雷鎰妃，肖雅夫，胡長敏*

1.華中農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，武漢 430070；2.肽澤（武漢）生物科技有限公司，武漢 430075

皮膚癬菌病通常由皮膚癬菌感染引起，犬貓皮膚癬菌病主要是指由犬小孢子菌（Microsporum canis）、須癬毛癬菌（Trichophyton mentagrophytes）和石膏樣小孢子菌（Microsporum gypseum）3 種致病菌感染所引起的皮膚病[1-2]。統(tǒng)計顯示，皮膚癬菌病約占臨床皮膚病病例總數(shù)的16%[3]，且由于皮膚癬菌可以通過直接接觸在動物和人之間傳播，因此寵主、動物愛好者等人群也易感染，故在臨床上應(yīng)更加重視[4]。

皮膚作為最大的免疫系統(tǒng)和物理屏障[5]，具有一定的防御能力，能夠有效抵制病原菌的侵蝕和破壞，而當皮膚遭遇外部寄生蟲感染、過敏、細菌、損傷、代謝障礙、內(nèi)分泌障礙等情況時，其皮膚微生態(tài)環(huán)境則可能被破壞，對皮膚的酸堿度、濕度和溫度等造成影響，為皮膚癬菌的生長和繁殖提供便利條件[6]。多項研究表明真菌的發(fā)病機制多與菌絲及其內(nèi)源性蛋白有關(guān)，并且真菌的多種毒力因子均能導致疾病的發(fā)生。當皮膚癬菌定植于皮膚表面并且適于生長時，其能在毛囊口產(chǎn)生大量菌絲伸入毛囊，吸取機體的營養(yǎng)以供自身大量繁殖，同時破壞毛囊、毛根及毛球上部的角質(zhì)，并分裂形成緊密的孢子或分節(jié)菌絲[7-8]，故在降解皮膚角質(zhì)層的同時也將宿主皮膚作為營養(yǎng)源供給自己，引起毛發(fā)病變及皮膚炎癥。

犬貓皮膚癬菌病的治療，現(xiàn)階段常用方法主要為采用抗真菌藥浴或使用酮康唑、伊曲康唑及特比萘芬等抗真菌藥物。隨著抗真菌藥物的臨床應(yīng)用日益廣泛，其耐藥性逐漸給真菌感染治療帶來嚴峻挑戰(zhàn)[9]。天然植物類抗真菌藥物具有高效、低毒及低殘留特點，臨床應(yīng)用日益廣泛。本研究擬對一款天然植物抗真菌香波防控犬貓真菌感染的功效進行初步評價，以期為臨床犬貓真菌性皮膚病的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

石膏小孢子菌ATCC 42890、須毛癬菌ATCC 28185 購于上海嘉楚生物工程有限公司。沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（sabouraud dextrose agar，SDA）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar medium，PDA）及皮膚霉菌試驗培養(yǎng)基（dermatophyte test medium，DTM）購自青島海博生物技術(shù)有限公司。天然植物抗真菌香波為肽澤（武漢）生物有限科技公司產(chǎn)品（20200701），另外2 種對照香波為市售產(chǎn)品（下稱對照1、對照2）。

1.2 臨床病例

2019—2020 年度華中農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)院皮膚癬菌病例，以及2020 年收集的使用天然植物抗真菌香波治療的病例。

1.3 抗真菌香波的體外評價

1）真菌培養(yǎng)及鏡檢。將石膏小孢子菌及須毛癬菌分別接種于SDA、PDA 及DTM 培養(yǎng)基，置于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d。將培養(yǎng)好的真菌使用乳酸酚棉蘭染色液染色并鏡檢。

2）天然植物抗真菌香波抑菌效果評價。

①真菌菌液制備。使用5 mL 無菌生理鹽水沖洗生長良好的真菌并收集菌液，通過細胞計數(shù)器將菌液的孢子濃度調(diào)整為108CFU/mL，隨后將200 μL菌液均勻涂布于沙氏培養(yǎng)基上。

②藥敏紙片制備。分別吸取天然植物抗真菌香波原液、對照1 及對照2 與無菌水進行1∶10 稀釋；將濾紙剪成直徑10 mm 的圓形小濾紙片，分別放入上述稀釋液中浸濕，隨后晾干備用。

③抑菌試驗。所有樣品重復上述步驟，接種后每日觀察記錄真菌生長情況，并置于28 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，7 d 后出觀察結(jié)果，測量抑菌環(huán)的直徑，其邊緣以肉眼看不到真菌明顯生長為限。

1.4 抗真菌香波功效評價

選擇僅患皮膚癬菌病的犬貓，應(yīng)用天然植物抗真菌香波進行藥浴，對患病動物精神狀態(tài)、病灶清潔度與嚴重程度、主要臨床表現(xiàn)等情況做觀察記錄。初次采樣后，將患病動物用溫水浸濕，全身涂抹天然植物抗真菌香波原液，揉搓按摩5～10 min 后沖洗干凈，1 周后再次進行評價。治療效果通過臨床癥狀的恢復情況以及2 次真菌的培養(yǎng)結(jié)果進行使用評價。鑒于真菌性皮膚病有反復發(fā)作的特性，所以使用抗真菌香波動物的臨床癥狀消失后，仍然持續(xù)使用香波2～4 次防止復發(fā)。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)病特征調(diào)查

共收集犬貓皮膚癬菌病115 例（表1）。犬19 個品種64 個病例，患病占比最高的品種為串種犬，患病數(shù)16 例，占比25.0%，其次為泰迪犬，患病數(shù)7例，占比10.9%，其他品種患病占比均小于10%。貓8 個品種50 個病例，患病占比前3 的品種為英國短毛貓，患病數(shù)24 例，占比48.0%；布偶貓10 例，占比20.0%；田園貓9 例，占比18.0%，其他品種貓則少數(shù)發(fā)病。

表1 犬貓皮膚癬菌病與品種的關(guān)系

犬貓皮膚癬菌病與性別、年齡的關(guān)系如表2所示，犬患皮膚癬菌病的雌雄比為28∶37，患病年齡主要集中于1～3 歲（34/51，占比66.7%）；貓患皮膚癬菌病的雌雄比為23∶27，患病年齡主要集中于1～3歲（19/40，占比47.5%），其次是小于1 歲的貓（16/40，占比40.0%），大于3 歲的貓患病數(shù)較少。

表2 犬貓皮膚癬菌病與性別、年齡的關(guān)系

皮膚癬菌能導致犬全身性感染，其中背部、四肢與頸部的感染率較高，貓背部和耳朵有較高感染率（表3）。

表3 犬貓皮膚癬菌病與患病部位的關(guān)系

2.2 抗真菌香波體外評價

1）分離菌株的菌落形態(tài)。SDA 平板培養(yǎng)菌落生長出現(xiàn)典型紋狀溝，初始生長菌落表面呈白色粉末狀，背面為黃色，隨著培養(yǎng)時間延長，表面逐漸變?yōu)榛疑▓D1a）；PDA 平板培養(yǎng)菌落較稀疏，呈現(xiàn)中心向四周放射狀，菌落表面呈白色，背面中心為白色，周圍呈黃色（圖1b）；DTM 培養(yǎng)基顏色呈灰青色（圖1c）。

2）乳酸酚棉蘭真菌染色液染色鏡檢。分離菌株采用乳酸酚棉蘭真菌染色液進行染色，染色結(jié)果見圖2，鏡檢結(jié)果顯示菌絲周圍有大量呈現(xiàn)紡錘形的分生孢子，孢子分隔區(qū)域大于6 個，且孢子兩端呈現(xiàn)帽樣結(jié)構(gòu)，推測為犬小孢子菌的大分生孢子。

3）抑菌試驗。抑菌試驗結(jié)果表明，天然植物抗真菌香波對須廯毛廯菌的抑菌圈大小為12 mm，較對照品1 抑菌圈（8 mm）及對照品2 抑菌圈（6 mm）分別增加50%及100%。天然抗真菌香波對石膏樣小孢子菌的抑菌圈大小為23 mm，較對照1 抑菌圈（10 mm）及對照2 抑菌圈（12 mm）分別增加130%及91.7%。天然抗真菌香波對臨床真菌菌株F3 的抑菌圈大小為15 mm，較對照品1 抑菌圈（5 mm）及對照品2 抑菌圈（3 mm）分別增加200%及400%。

2.3 抗真菌香波體內(nèi)評價

受試犬貓25 只，按要求使用香波的犬貓17只，在使用3 次天然植物抗真菌香波后，15 只犬貓抓撓現(xiàn)象減少，患處皮膚紅腫面積減小，痂皮脫落，毛發(fā)恢復狀況良好（圖3）。

3 討 論

統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，泰迪犬等犬種以及田園貓及英短貓等品種貓均有皮膚癬菌病的病例，幾乎所有常見的犬貓均可感染真菌，罹患皮膚癬菌病。從易患犬貓品種來說，泰迪犬、金毛犬以及布偶貓等毛發(fā)濃密犬貓更易攜帶真菌病原。由于上述犬貓毛發(fā)厚實，如果長時間缺乏護理，更易導致真菌的感染[2]。

本研究結(jié)果顯示，幼齡犬貓更易患真菌性皮膚病，這與朱重偉[10]的報道一致。轉(zhuǎn)鐵蛋白被證實在犬貓皮膚免疫方面具有重要作用[11]，小于11 月齡的犬缺乏合成轉(zhuǎn)鐵蛋白的能力。此外，幼齡犬皮膚結(jié)構(gòu)如皮脂腺發(fā)育不完善，皮膚分泌不飽和脂肪酸不足，降低了對真菌的滅殺作用。報道[12]顯示，隨著年齡的增長，皮膚結(jié)構(gòu)發(fā)育逐漸完善，犬貓對真菌的抵抗力也逐漸增強。

本研究結(jié)合藥敏紙片擴散法進行了天然植物抗真菌香波及對照品的抑菌試驗，結(jié)果顯示天然植物抗真菌香波的抑菌效果優(yōu)于對照品。體內(nèi)評價試驗也證實，使用天然植物抗真菌香波后，皮膚癬菌病的患病動物病變及臨床癥狀恢復良好。

天然植物抗真菌香波是一款專用于患皮膚癬菌病的動物的洗護產(chǎn)品，其主效成分包括厚樸提取物、紫蘇葉提取物及穿膜肽。研究發(fā)現(xiàn)和厚樸酚有抗炎、抗菌、抗腫瘤等作用，尤其對真菌，如犬小孢子菌、須毛癬菌以及白色念珠菌抑制作用明顯[13]。紫蘇葉是一年生藥食兩用植物，其在試管內(nèi)能抑制葡萄球菌生長，紫蘇醛起主要抑菌作用，在天然抑菌劑的開發(fā)上有著潛在的應(yīng)用價值[14]。細胞穿膜肽（cell penetrating peptides，CPPs）是一類能與外源生物活性大分子（如核酸、蛋白質(zhì)等）結(jié)合，通過內(nèi)吞或直接穿透細胞膜而將外源活性物質(zhì)遞送進細胞內(nèi)且不會損壞細胞膜結(jié)構(gòu)的小分子短肽。CPPs 自身的多肽屬性，使其進入細胞后能被正常分解，具有良好組織相容性，細胞毒性小，是多數(shù)藥物靶向治療的理想載體[15]。綜上，結(jié)合天然植物抗真菌香波體內(nèi)外評價結(jié)果，確定天然植物抗真菌香波能有效預防和改善皮膚癬菌性疾病，具有一定臨床使用價值。