楊彥豪， 黎 銘， 王 瑞， 黃 姻， 楊慧贊， 黃光華， 邱高峰， 曾 蘭

(1.上海海洋大學(xué)/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心/上海水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，上海 201306；2.廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)科學(xué)研究院/廣西水產(chǎn)遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530021)

Dmc1(disrupted meiotic cDNA)基因是DNA重組酶RecA/Rad51家族成員之一，在同源染色體配對(duì)、聯(lián)會(huì)、重組和分離過(guò)程中具有重要作用[1]。Dmc1基因最早在酵母中發(fā)現(xiàn)，被鑒定為減數(shù)分裂過(guò)程中的特異性基因[2]，具有催化DNA雙鏈交換的能力[3]，還可以通過(guò)抑制解旋酶Srs2的活性來(lái)協(xié)助減數(shù)分裂過(guò)程中交叉的形成，從而保證減數(shù)分裂的完整性[4]。已有的研究表明，在減數(shù)分裂過(guò)程中，Dmc1基因可在睪丸和卵巢特異表達(dá)，其突變可能導(dǎo)致減數(shù)分裂停滯[5-7]。迄今為止，已在多個(gè)物種中發(fā)現(xiàn)Dmc1基因，一些水生動(dòng)物的Dmc1基因也得到了克隆和鑒定[11-16]。

羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)是淡水養(yǎng)殖蝦類主要品種之一。近年來(lái)，由于引種混亂、育苗技術(shù)不規(guī)范、近親繁殖等，造成羅氏沼蝦種質(zhì)資源退化問(wèn)題日趨嚴(yán)重，影響了羅氏沼蝦產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，探索研究羅氏沼蝦生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的分子調(diào)控機(jī)制成為解決這些問(wèn)題的可行途徑。目前，有關(guān)羅氏沼蝦的研究主要集中在生物形態(tài)學(xué)[17-18]、種群生態(tài)學(xué)[19-20]、遺傳學(xué)[21-24]方面，有關(guān)羅氏沼蝦Dmc1基因的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究利用RACE技術(shù)對(duì)羅氏沼蝦Dmc1(MrDmc1)基因進(jìn)行全長(zhǎng)cDNA克隆，利用生物信息學(xué)方法分析MrDmc1基因編碼區(qū)特征、理化性質(zhì)及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，并利用熒光定量PCR對(duì)其在不同組織、卵巢發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)情況進(jìn)行分析，以期為進(jìn)一步研究MrDmc1基因在卵巢發(fā)育過(guò)程中的作用，探究羅氏沼蝦卵巢發(fā)育分子調(diào)控機(jī)制，建立羅氏沼蝦卵巢發(fā)育人工調(diào)控新技術(shù)，推進(jìn)羅氏沼蝦遺傳改良及分子輔助育種奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料來(lái)自廣西南寧國(guó)家級(jí)羅氏沼蝦良種場(chǎng)，選擇健康的4月齡羅氏沼蝦，采集卵巢置于液氮中速凍，-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆茫糜贒mc1基因克隆。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中斑節(jié)對(duì)蝦Dmc1基因序列(EU440762)，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)接頭引物、5′RACE特異性引物、3′RACE特異性引物和實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物，引物序列見(jiàn)表1。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物信息

1.3 羅氏沼蝦總RNA提取及cDNA合成

凍存的卵巢組織按Trizol提取試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟提取總RNA，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證RNA。去除基因組DNA后，進(jìn)行cDNA第1鏈合成，合成cDNA置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 MrDmc1基因克隆

1.4.1 5′-RACE 以特異性引物RC779-RT1/RC779-RT2反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA，經(jīng)RNase H 和末端轉(zhuǎn)移酶TdT處理后，進(jìn)行巢氏PCR(操作步驟見(jiàn)英杰公司5′-RACE系統(tǒng)手冊(cè))。PCR反應(yīng)條件見(jiàn)表2。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)回收純化后連接pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞(SK2301)，以pMD18-T載體的通用引物做菌落PCR，將PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.4.2 3′-RACE 以3′接頭引物做反轉(zhuǎn)錄，獲得的cDNA為模版進(jìn)行巢式PCR，PCR反應(yīng)條件見(jiàn)表3。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，經(jīng)過(guò)膠回收、純化后，送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。根據(jù)5′RACE和3′RACE測(cè)序得到的序列，利用DNAMAN軟件拼接獲得MrDmc1基因的全長(zhǎng)序列。

表2 5′-RACE反應(yīng)條件

表3 3′-RACE反應(yīng)條件

1.5 生物信息學(xué)分析

通過(guò)NCBI ORF finder(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)網(wǎng)站在線分析基因的開(kāi)放閱讀框(ORF)和其編碼的氨基酸序列；MrDMC1蛋白的保守結(jié)構(gòu)域由NCBI conserved domain(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)和Pfam(http：//pfam.xfam.org/)在線預(yù)測(cè)獲得；利用 Expasy ProtParam(http：//web.expasy.org/protparam/)分析MrDMC1蛋白質(zhì)氨基酸組成、分子量、理論等電點(diǎn)等；利用RARE CODON CALTOR在線軟件(http：//https：//people.mbi.ucla.edu/sumchan/caltor.html)計(jì)算基因序列的稀有密碼子；利用ProtScale、SignalP 6.0 Sever和TMHMM Sever v.2.0在線分析蛋白質(zhì)的親疏水性、信號(hào)肽。利用NetNGlyc 1.0 server和NetPhos 3.1 server預(yù)測(cè)蛋白糖基化和磷酸化位點(diǎn)；利用PSORTⅡ Prediction 在線軟件(http：//psort.hgc.jp/form2.html)進(jìn)行亞細(xì)胞定位；通過(guò)SOPMA和SWISS-MODEL在線預(yù)測(cè)工具分析MrDMC1蛋白的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)；用DNAStar軟件中的MegAlign程序?qū)rDmc1基因序列與其他物種的Dmc1基因序列進(jìn)行比對(duì)，并利用MEGA 5.1軟件中鄰接法(Neighbor Joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析MrDmc1基因的表達(dá)

根據(jù)克隆獲得的MrDmc1基因序列設(shè)計(jì)引物，以β-action基因作為內(nèi)參，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系如下：Premix ExTaqTMⅡ 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA 5 μL，ddH2O 4μL；擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性15 s，60 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。利用2-ΔΔCT法計(jì)算MrDmc1基因的相對(duì)表達(dá)量。利用IBM SPSS Statistics軟件對(duì)MrDmc1基因表達(dá)差異性進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 羅氏沼蝦總RNA提取及檢測(cè)

使用Trizol法提取羅氏沼蝦卵巢的總RNA，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，NanoDrop 2000分光光度計(jì)檢測(cè)其純度和濃度，選取D260 nm/D280 nm的值在1.90～2.0范圍的樣品用于后面的試驗(yàn)研究(圖1-A)。

2.2 MrDmc1基因全長(zhǎng)序列克隆及序列分析

利用特異性引物RC779-RT1/RC779-RT2反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA，經(jīng)RNase H 和TdT處理后，進(jìn)行5′-RACE巢氏PCR(圖1-B)；利用3′接頭為反轉(zhuǎn)引物的cDNA為模版進(jìn)行3′-RACE巢式PCR(圖1-C)；通過(guò)DNAMAN拼接獲得MrDmc1基因全長(zhǎng)序列，對(duì)基因序列分析表明MrDmc1基因序列全長(zhǎng)為 1 627 bp，ORF為1 026 bp，包含542個(gè)密碼子，編碼蛋白包含341個(gè)氨基酸(圖2)。

2.3 生物信息學(xué)分析

對(duì)MrDmc1基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明，MrDMC1蛋白分子式為C1648H2644N460O514S10，理論分子量為37.4 ku，為親水性穩(wěn)定蛋白(圖3)；該蛋白具有Rad51結(jié)構(gòu)域和helix-hairpin-helix(HhH)結(jié)構(gòu)域(圖4)，沒(méi)有跨膜區(qū)域和信號(hào)肽切割位點(diǎn)(圖5)，含有1個(gè)N-糖基化位點(diǎn)和25個(gè)磷酸化位點(diǎn)(圖6)；該蛋白主要存在于細(xì)胞質(zhì)(60.9%)、細(xì)胞核(17.4%)和細(xì)胞骨架中(17.4%)；該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)卷曲分別占48.39%、13.78%、7.04%、30.79%，三級(jí)結(jié)構(gòu)與人減數(shù)分裂重組蛋白DMC1(SWTL ID：7c99.1)的相似度為78.11%(圖7)。

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載凡納濱對(duì)蝦(Penaeus vannamei，ADM45305.1)等31個(gè)物種DMC1蛋白的氨基酸序列，利用MEGA 5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖8)，結(jié)果表明羅氏沼蝦與甲殼綱動(dòng)物的進(jìn)化關(guān)系最為接近，與魚(yú)類的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.5 MrDmc1基因的mRNA表達(dá)分析

MrDmc1基因的組織表達(dá)譜表明，在雌蝦7個(gè)不同組織中MrDmc1基因均有表達(dá)，其中，在心臟中的表達(dá)量最高，其次是肝胰腺、鰓，在眼中的表達(dá)量最低。單因素方差分析發(fā)現(xiàn)，除在卵巢與肌肉、肝胰腺與鰓中的表達(dá)量差異為不顯著外，其他各組織之間的表達(dá)量差異均為極顯著(P<0.01)(圖9)。

以4個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的羅氏沼蝦卵巢組織為試驗(yàn)材料，進(jìn)一步研究MrDmc1基因在卵巢中的表達(dá)規(guī)律，結(jié)果表明，在卵巢發(fā)育過(guò)程中，MrDmc1基因呈先上升再下降的趨勢(shì)，在卵巢發(fā)育Ⅱ期表達(dá)量達(dá)到最高，從卵巢發(fā)育Ⅱ期開(kāi)始表達(dá)量逐步降低。單因素方差分析表明，MrDmc1基因在不同發(fā)育時(shí)期卵巢中的表達(dá)差異為極顯著(P<0.01)(圖10、圖11)。

3 討論

利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，探究羅氏沼蝦生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的分子調(diào)控機(jī)制，是推動(dòng)羅氏沼蝦產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要途徑。因此，深入開(kāi)展羅氏沼蝦生殖發(fā)育相關(guān)的分子研究，揭示羅氏沼蝦卵巢發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制尤為關(guān)鍵。Dmc1基因已被證明是具有DNA重組酶活性的RecA/Rad51超家族的成員之一[25]。對(duì)同源染色體之間DNA鏈的交換和減數(shù)分裂過(guò)程中斷鏈雙鍵的修復(fù)是必不可少的[26]。本研究利用RACE技術(shù)對(duì)羅氏沼蝦Dmc1基因進(jìn)行克隆，獲得了MrDmc1基因的全長(zhǎng)cDNA序列，為MrDmc1基因功能等方面研究奠定基礎(chǔ)。

一些水生動(dòng)物Dmc1基因已有報(bào)道，且不同動(dòng)物的Dmc1基因長(zhǎng)度不同[11-17]。本研究首次克隆了羅氏沼蝦MrDmc1基因的核苷酸序列，并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)該基因全長(zhǎng)為1 627 bp，ORF為1 026 bp，編碼341個(gè)氨基酸，與斑節(jié)對(duì)蝦、中華絨螯蟹、 克氏原螯蝦的基因編碼區(qū)一致?；蛳嗨菩苑治霰砻?，羅氏沼蝦MrDmc1與中華絨螯蟹、克氏原螯蝦、凡納濱對(duì)蝦和美洲龍蝦的基因相似性較高；氨基酸序列同源性比較表明，羅氏沼蝦MrDMC1與克氏原螯蝦同源性最高，為92.96%，其次是美洲龍蝦(90.91%)和凡納濱對(duì)蝦(90.32%)，與文昌魚(yú)同源性最低，為77.35%；系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)表明，羅氏沼蝦MrDmc1基因與克氏原螯蝦、凡納濱對(duì)蝦等甲殼類動(dòng)物進(jìn)化關(guān)系較近，與魚(yú)類的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，說(shuō)明該基因在不同物種間的保守型存在差異。生物信息學(xué)分析表明，羅氏沼蝦MrDMC1蛋白的分子量為37.4 ku，為穩(wěn)定親水性蛋白，該蛋白中無(wú)信號(hào)肽和跨膜區(qū)域，不是跨膜蛋白或分泌蛋白，MrDMC1蛋白存在1個(gè)N-糖基化位點(diǎn)和25個(gè)磷酸化位點(diǎn)，主要定位于細(xì)胞質(zhì)中。預(yù)測(cè)結(jié)果可為后期體外構(gòu)建羅氏沼蝦MrDmc1基因原核表達(dá)載體及蛋白的表達(dá)優(yōu)化提供重要的科學(xué)數(shù)據(jù)。

組織表達(dá)分析顯示，MrDmc1基因在羅氏沼蝦卵巢等7個(gè)組織中均有表達(dá)，且在不同組織中存在差異，在心臟中的表達(dá)量最高，其次是肝胰腺、鰓，在眼中的表達(dá)量最低。已有的研究表明，Dmc1基因在多個(gè)物種的性腺中高表達(dá)，在不同倍性鯉魚(yú)[12]、紅腹蠑螈[27]、達(dá)氏鱘[28]和南方鲇[29]的研究中，Dmc1基因只在性腺中表達(dá)。在斑節(jié)對(duì)蝦的研究中，Dmc1基因在性腺、心臟和血細(xì)胞中均有表達(dá)[14]；在日本鰻鱺的研究表明Dmc1基因主要在性腺中表達(dá)，在大腦中也有表達(dá)[11]。在本研究中，MrDmc1基因在卵巢中的表達(dá)水平不高，與所用卵巢樣品處于的卵巢發(fā)育Ⅲ期有關(guān)；MrDmc1基因在卵巢等7個(gè)不同組織中均有表達(dá)，表明Dmc1基因在脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物中的生物功能可能存在差別。

MrDmc1基因在不同發(fā)育時(shí)期卵巢中的表達(dá)結(jié)果顯示，MrDmc1基因在卵巢發(fā)育Ⅰ期到Ⅱ期表達(dá)量逐步增高，在卵巢發(fā)育Ⅱ期達(dá)到最高，從卵巢發(fā)育Ⅱ期開(kāi)始MrDmc1基因表達(dá)量逐步降低。達(dá)氏鱘Dmc1基因在0～Ⅰ期精巢中不表達(dá)，在Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期精巢中表達(dá)量逐步升高，并在Ⅳ期精巢中達(dá)到最高，在Ⅴ期精巢中，表達(dá)量顯著下降[29]；小鼠dmc1基因僅在減數(shù)分裂Ⅰ細(xì)線期到偶線期的精母細(xì)胞中特異表達(dá)[10]；蠑螈dmc1基因在減數(shù)分裂Ⅰ細(xì)線期開(kāi)始表達(dá)，一直持續(xù)到精子生成階段[27]。日本鰻鱺dmc1基因只在減數(shù)分裂Ⅰ的早期表達(dá)，并且持續(xù)到粗線期，但是表達(dá)量卻逐漸降低[11]。本研究發(fā)現(xiàn)MrDmc1基因在卵巢發(fā)育早期表達(dá)量較高，隨著卵巢的逐漸成熟，MrDmc1隨之降低，在卵巢發(fā)育Ⅱ期表達(dá)量最高，隨后逐漸降低，說(shuō)明MrDmc1基因參與了羅氏沼蝦卵巢發(fā)育，推測(cè)其在卵巢發(fā)育早期發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)RACE技術(shù)獲得羅氏沼蝦MrDmc1基因，基因全長(zhǎng)為1 627 bp，ORF為1 026 bp，存在542個(gè)密碼子，編碼341個(gè)氨基酸；系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)發(fā)現(xiàn)羅氏沼蝦MrDmc1基因與克氏原螯蝦、凡納濱對(duì)蝦等甲殼類動(dòng)物進(jìn)化關(guān)系較近。生物信息學(xué)分析表明，MrDMC1蛋白分子量為37.4 ku，沒(méi)有跨膜區(qū)域和信號(hào)肽切割位點(diǎn)，含有1個(gè)N-糖基化位點(diǎn)和25個(gè)磷酸化位點(diǎn)，是親水性蛋白，主要存在細(xì)胞質(zhì)中。熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，MrDmc1基因在卵巢等7個(gè)組織中均有表達(dá)，且在不同組織中存在差異；MrDmc1基因在卵巢發(fā)育Ⅱ期表達(dá)量達(dá)到最高，推測(cè)其在卵巢發(fā)育早期發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用。試驗(yàn)結(jié)果可為進(jìn)一步研究羅氏沼蝦Dmc1基因的生物學(xué)功能，探究羅氏沼蝦卵巢發(fā)育分子調(diào)控機(jī)制提供重要依據(jù)。