鄭佳秋， 梅 燚， 吳永成， 王薇薇， 張麗娜， 張永吉， 陳以博， 祖艷俠， 萬(wàn)紅建

(1.江蘇沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇鹽城 224002； 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，浙江杭州 310021；3.江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇揚(yáng)州 225007)

辣椒(CapsicumannuumL.)原產(chǎn)于中南美洲熱帶亞熱帶地區(qū)，富含維生素C和辣椒素，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，在我國(guó)有著悠久的栽培歷史，年種植面積約200萬(wàn)hm2，在我國(guó)蔬菜周年供應(yīng)中起重要作用。辣椒成熟果實(shí)顏色主要由果實(shí)中類胡蘿卜素組分及其相對(duì)含量決定。類胡蘿卜素是光吸收復(fù)合體的重要組成成分，主要分布在植物有色體和葉綠體膜中，在保護(hù)光合作用器官、防止光氧化損傷等方面發(fā)揮了重要作用[1-2]。類胡蘿卜素合成需經(jīng)過縮合、脫氫、環(huán)化等一系列反應(yīng)[3]，而八氫番茄紅素合成酶(PSY)既是類胡蘿卜素合成途徑的首要限速酶，又是控制碳源流向的首要關(guān)鍵酶，分別誘導(dǎo)PSY基因組成型和功能型特異表達(dá)，可顯著提高植物非綠色組織中的類胡蘿卜素含量，PSY基因已成為植物類胡蘿卜素基因工程改良主要目的基因[4-7]。

鑒定和分析辣椒果實(shí)中的PSY(CaPSY)基因?qū)沂酒湓诶苯奉惡}卜素合成及果色形成中的作用具有重要理論意義。前人研究認(rèn)為，成熟時(shí)辣椒果實(shí)的顏色由3對(duì)獨(dú)立的基因y、c1、c2控制[8]。Lefebvre等研究發(fā)現(xiàn)，辣椒紅素/辣椒玉紅素合成酶基因(Ccs)控制紅色果實(shí)和黃色果實(shí)的遺傳差異，與前人研究命名的y基因相對(duì)應(yīng)，定位在6號(hào)染色體上[9-10]。而Thorup等認(rèn)為，八氫番茄紅素合成酶基因(PSY)調(diào)控紅色與橙色果實(shí)的遺傳差異[11-12]，該基因與前人研究認(rèn)為的c2位點(diǎn)相對(duì)應(yīng)，調(diào)控果實(shí)中類胡蘿卜素的含量。Tian等應(yīng)用病毒誘導(dǎo)沉默辣椒紅素生物合成途徑上的4個(gè)關(guān)鍵基因(Psy、Lcyb、Crtz、Ccs)以研究辣椒果實(shí)顏色的形成，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)沉默和同時(shí)沉默幾個(gè)關(guān)鍵基因時(shí)，基因表達(dá)水平均降低，辣椒紅素合成減少，果實(shí)呈現(xiàn)黃色或橙色[13]，這與前人研究認(rèn)為的紅色是顯性由位于6號(hào)染色體y位點(diǎn)的單獨(dú)基因控制的觀點(diǎn)[14]不一致。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)沉默PSY基因時(shí)，β-胡蘿卜素、β-隱黃質(zhì)、玉米黃質(zhì)、辣椒紅素含量顯著減少，表明沉默PSY基因負(fù)面影響了辣椒紅素生物合成途徑的中間產(chǎn)物，從而引發(fā)辣椒紅素含量的降低，表現(xiàn)出正常果實(shí)與沉默果實(shí)顏色的明顯不同，可見PSY基因在辣椒果實(shí)顏色形成過程中的重要作用。

目前，PSY基因在草莓、甜橙、小麥等植物上已有相關(guān)研究，而辣椒PSY基因家族的鑒定和生物信息學(xué)分析方面報(bào)道較少。本研究對(duì)辣椒及其他植物PSY基因進(jìn)行鑒定分析系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，對(duì)鑒定出的辣椒PSY基因家族成員進(jìn)行生理和結(jié)構(gòu)分析，并熒光定量分析組織表達(dá)特異性，有助于了解辣椒PSY基因的功能和結(jié)構(gòu)特征，為進(jìn)一步探索辣椒果色形成的分子機(jī)制提供一些理論依據(jù)，為創(chuàng)制不同果色新種質(zhì)資源奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 CaPSY基因家族的鑒定

利用植物PSY基因隱馬爾科夫(HMM)模型對(duì)辣椒2個(gè)全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)PGP(http：//peppergenome.snu.ac.kr/)和Pepper Genome Database 2.0(http：//peppersequence.genomics.cn/page/species/index/jsp)進(jìn)行搜索，獲得辣椒PSY基因相關(guān)信息，通過Pfam(http：//pfam.janelia.org/)進(jìn)行鑒定。其他植物的八氫番茄紅素合成酶基因信息來源于Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//phytozome.jgi.doe.gov/)。

1.2 CaPSY基因家族的系統(tǒng)發(fā)生學(xué)和染色體定位分析

利用pI/Mw工具(http：//web.expasy.org/compute_pi/)計(jì)算等電點(diǎn)和分子量。外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)模式圖由Gene Structure Display Server(GSDS)繪制。通過ClustalX軟件對(duì)獲得的CaPSY基因進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，再用MEGA 11.0軟件采用鄰接(Neighbor-Joining，NJ)法，校驗(yàn)參數(shù)Bootstrap設(shè)為1 000次重復(fù)，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。利用MEME (http：//meme.nbcr.net/meme/cgi-bin/meme.cgi) 分析保守基序。用DNAMAN 6.0軟件分析序列間的相似性。結(jié)合辣椒基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的辣椒PSY基因位置信息，利用MapDraw 2.1進(jìn)行染色體定位，在線(http：//chibba.agtec.uga.edu/duplication/index/locus)分析這些基因的串聯(lián)重復(fù)和片段重復(fù)特征。

1.3 試驗(yàn)材料與方法

辣椒品種為Y28，種子由江蘇沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所蔬菜花卉研究室提供，2016年種植于江蘇省鹽城市南洋試驗(yàn)場(chǎng)。辣椒種子先用55 ℃溫水處理20 min后，放在28 ℃水中浸泡 6 h，取出種子用濕紗布包好，28 ℃黑暗光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行催芽，每天用自來水沖洗1次，大約4 d種子露白，播于穴盤中育苗，放在塑料大棚中進(jìn)行生長(zhǎng)，培養(yǎng)條件：晝溫為20～25 ℃，夜溫為10～15 ℃。當(dāng)幼苗長(zhǎng)至4葉1心時(shí)，取根、莖、葉組織，液氮取樣后在-80 ℃超低溫冰箱中存放備用。辣椒幼苗長(zhǎng)至 8～10張真葉時(shí)移栽到露地，3個(gè)月后果實(shí)成熟時(shí)，取花、嫩果(花后15 d)、成熟青果(花后30 d)、轉(zhuǎn)色期果實(shí)(花后40 d)、成熟紅果(花后50 d)作為樣品，液氮取樣后在-80 ℃超低溫冰箱中存放備用。

采用RNASEOUT RECOMB.RNASE INHIB提取試劑盒(Invitrogen公司)，參考說明書分別提取根、莖、葉、花、嫰果、成熟青果、轉(zhuǎn)色期果實(shí)、成熟紅果的總RNA。參照SUPERSCRIPT Ⅲ TRANSCRIPT試劑盒(Invitrogen公司)說明書合成cDNA。CaPSY基因特異引物用Prime 5軟件設(shè)計(jì)，以UBI作為內(nèi)參檢測(cè)基因。

1.4 CaPSY基因家族的表達(dá)特性分析

采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)CaPSY基因組織特異性表達(dá)，反應(yīng)體系為20 μL，包括10 μL 2× SYBR premix ExTaqTM，1 μL cDNA(稀釋10倍)，0.4 μL上游引物(10 μmol/L)，0.4 μL下游引物(10 μmol/L)，8.2 μL ddH2O。PCR程序?yàn)槎椒ǎ?5 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃復(fù)性30 s，循環(huán)40次。采用2-ΔΔCT法計(jì)算基因表達(dá)量[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 CaPSY基因的鑒定

利用植物PSY基因HMM模型對(duì)辣椒2個(gè)全基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行搜索，通過Pfam網(wǎng)站進(jìn)行鑒定，最終獲得6個(gè)CaPSY基因(表1)。CaPSY基因編碼的蛋白為303～432個(gè)氨基酸，其中CaPSY04編碼的蛋白最長(zhǎng)有432個(gè)氨基酸，CaPSY03編碼的蛋白最短有303個(gè)氨基酸。相對(duì)分子量為33.61(CaPSY03)～48.44 ku(CaPSY04)。除CaPSY06基因編碼的蛋白等電點(diǎn)是5.59，為酸性蛋白，其余的等電點(diǎn)均大于7，為堿性蛋白。

2.2 CaPSY基因的結(jié)構(gòu)分析

為了解CaPSY基因結(jié)構(gòu)進(jìn)化情況，將PSY基因的核苷酸序列與相應(yīng)的基因組序列校正后確定內(nèi)含子/外顯子的結(jié)構(gòu)圖(圖1)。結(jié)果表明，CaPSY基因中除了CaPSY03基因沒有內(nèi)含子，其他基因內(nèi)含子的數(shù)量為5～12個(gè)。CaPSY02的內(nèi)含子最多，有12個(gè)，其次是CaPSY06，有9個(gè)內(nèi)含子，CaPSY04和CaPSY05均含有5個(gè)內(nèi)含子，有相似的內(nèi)含子/外顯子結(jié)構(gòu)模式。

2.3 CaPSY基因的序列分析

為了明確CaPSY基因的序列特征，采用Clustal X和DNAMAN 6.0軟件對(duì)辣椒6個(gè)CaPSY基因的氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對(duì)。研究結(jié)果表明，所有的辣椒CaPSY基因都含有1個(gè)保守的反式-異平基-二磷酸合成酶結(jié)構(gòu)域，存在4個(gè)保守的天冬氨酸殘基(圖2)，比Marchler-Bauer等的研究[16]多了2個(gè)天冬氨酸富集區(qū)，與前人的研究結(jié)果趨于一致。根據(jù)氨基酸序列相似性比對(duì)結(jié)果(表2)可知，CaPSY01、CaPSY04和CaPSY05基因的氨基酸序列相似性最高，其中CaPSY01與CaPSY04的相似性為59.7%，CaPSY01與CaPSY05的相似性為60.1%，而CaPSY04與CaPSY05的相似性高達(dá)85.3%，其次CaPSY02與CaPSY06的相似性為68.6%，CaPSY03與其他5個(gè)PSY基因的氨基酸相似性僅為8.1%～16.5%。

表2 CaPSY基因的氨基酸序列相似性

2.4 CaPSY基因家族的系統(tǒng)發(fā)育和保守基序分析

Tran等認(rèn)為，部分藻類還保留PSYⅠ和PSYⅡ 2個(gè)家族，但高等植物只有PSYⅠ家族[17]。利用MEGA 11.0軟件中的鄰接法構(gòu)建進(jìn)化樹，Bootstrap設(shè)為1 000次重復(fù)，去掉Bootstrap支持率低于60%的節(jié)點(diǎn)。結(jié)果表明，植物PSY氨基酸分成重要的2類：CladeⅠ和CladeⅡ，基本與PSY分類學(xué)上的結(jié)論[18-20]相符，同時(shí)也表明PSY的同源性與物種的親緣關(guān)系相關(guān)，如茄科的辣椒、馬鈴薯、茄子和番茄PSY聚在一起，藻類的團(tuán)藻和微胞藻聚在一起，說明進(jìn)化發(fā)生比較近。水稻、高粱和二穗短柄草聚在一起，表明PSY旁系同源基因的分化早于禾本科植物的種屬演化[21]，而且與其作用部位功能分化相關(guān)[22]。同個(gè)植物不同PSY之間的親緣關(guān)系有相近的，如CladeⅠ中辣椒CaPSY01、CaPSY04、CaPSY05聚為一支(CladeⅠa)，表明他們具有較高的保守性，其中CaPSY04和CaPSY05聚在一起，說明親緣關(guān)系較近，CaPSY02和CaPSY06聚為一支(CladeⅠb)，說明它們進(jìn)化發(fā)生比較近。也有親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的，如辣椒CaPSY03單獨(dú)聚在CladeⅡ中最外圍，與其他辣椒PSY親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，可能也預(yù)示著基因不同的功能(圖3)。

為了研究辣椒CaPSY基因之間結(jié)構(gòu)的多樣性，利用MEME在線工具對(duì)鑒定的6個(gè)CaPSY基因序列進(jìn)行保守基序鑒定，結(jié)果見圖4。在辣椒中鑒定到8個(gè)保守基序，長(zhǎng)度依次為41、50、50、41、40、50、50、50(表3)。CaPSY01、CaPSY04和CaPSY05編碼的蛋白均含有相同的5個(gè)保守基序(motif1+motif2+motif3+motif4+motif5)，CaPSY04和CaPSY05在進(jìn)化分析中遺傳距離較近，并且它們編碼的蛋白保守基序分布也很相似，說明這2個(gè)基因親緣關(guān)系較近。CaPSY02編碼的蛋白含有5個(gè)保守基序(motif1+motif2+motif6+motif7+motif8)，CaPSY06編碼的蛋白含有3個(gè)保守基序(motif6+motif7+motif8)，基序motif6、motif7和motif8是CaPSY02和CaPSY06編碼的蛋白特有的基序，CaPSY03編碼的蛋白僅含有1個(gè)motif2保守基序，與其他CaPSY基因的進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)，這與進(jìn)化分析的結(jié)果相一致。

表3 辣椒CaPSY基因的保守基序

2.5 CaPSY基因家族的染色體定位

根據(jù)鑒定得到的PSY基因的染色體位置信息進(jìn)行染色體定位，如圖5所示，6個(gè)CaPSY基因分布在辣椒12條染色體中的4條染色體上，其中CaPSY01、CaPSY02和CaPSY03位于1號(hào)染色體上，CaPSY04、CaPSY05、CaPSY06分別位于2號(hào)、4號(hào)和10號(hào)染色體。在線(http：//chibba.agtec.uga.edu/duplication/index/locus)分析CaPSY基因的重復(fù)特征，未發(fā)現(xiàn)串聯(lián)重復(fù)情況。

2.6 CaPSY基因家族的表達(dá)特性分析

已有研究表明，在黃龍膽中至少有2 個(gè)PSY基因，PSYⅠ基因在花中特異性表達(dá)[23]，蘋果中有4個(gè)PSY基因，并且在不同的時(shí)期和組織中它們的表達(dá)量也不同[24]。為了更好地了解辣椒中6個(gè)CaPSY基因的特性，筆者研究了CaPSY在辣椒不同組織器官(根、莖、葉、花、嫩果、成熟青果、轉(zhuǎn)色果、成熟紅果)中的表達(dá)模式。設(shè)計(jì)了特異引物，在保守區(qū)域的外圍通過RT-PCR進(jìn)行擴(kuò)增。CaPSY基因特異引物由Prime 5軟件設(shè)計(jì)，以UBI作為內(nèi)參檢測(cè)基因(表4)。如圖6所示，6個(gè)CaPSY基因在辣椒根、莖、葉、花和果實(shí)組織器官中均有表達(dá)，說明基因?yàn)榻M成型表達(dá)，但表達(dá)量存在差異，整體表現(xiàn)為花中表達(dá)水平最高，其次是果實(shí)，根部和莖部的表達(dá)量比果實(shí)中低，而葉中表達(dá)量最低，其中葉片和莖部器官中起主要調(diào)控作用的是CaPSY04和CaPSY05；根中以CaPSY03和CaPSY04為主參與根部類胡蘿卜素的合成；花器官中除了CaPSY06表達(dá)量低以外，其余CaPSY基因表達(dá)量都很高；CaPSY03和CaPSY05在果實(shí)中隨著果實(shí)成熟度的增加表達(dá)量逐漸增加，在果實(shí)轉(zhuǎn)色期和紅果中的表達(dá)量最豐富，這與草莓的相關(guān)報(bào)道[25]相一致，推測(cè)辣椒紅果中類胡蘿卜素的合成主要由CaPSY03和CaPSY05這2個(gè)基因調(diào)控，而CaPSY04和CaPSY06則表現(xiàn)出差異，表達(dá)量開始隨果實(shí)成熟度的增加而增加，但果實(shí)完全轉(zhuǎn)化成紅果時(shí)表達(dá)量卻降低，推測(cè)主要在果實(shí)轉(zhuǎn)色期起調(diào)控作用。

表4 辣椒CaPSY基因擴(kuò)增引物序列

3 討論與結(jié)論

許多研究表明，辣椒成熟果實(shí)顏色的差異主要是由于類胡蘿卜素成分的變化，在植物體中已鑒定出許多酶和基因與類胡蘿卜素的合成相關(guān)[26]，其中PSY被認(rèn)為是首要的調(diào)控基因[27]，已有研究表明通過沉默PSY基因表達(dá)發(fā)現(xiàn)其與橙色果實(shí)相關(guān)[13]。本研究基于已知的2個(gè)辣椒全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定出的6個(gè)CaPSY基因，相較于其他作物如番茄、木薯、玉米中鑒定的3個(gè)PSY基因而言，辣椒CaPSY基因編碼的相對(duì)數(shù)量較高。

辣椒CaPSY編碼蛋白屬于全反式-異平基-二磷酸合成酶超家族(Trans_IPPS)，它包括4個(gè)天冬氨酸富集區(qū)域，比Marchler-Bauer等的研究結(jié)果[16]多了2個(gè)天冬氨酸富集區(qū)域，整體相一致。6個(gè)CaPSY基因定位在辣椒的4條染色體上，未發(fā)現(xiàn)串聯(lián)重復(fù)情況。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，PSY的同源性與物種的親緣關(guān)系相關(guān)，6個(gè)辣椒CaPSY基因與茄科中的其他辣椒、番茄、馬鈴薯和茄子聚合度較高，但同一植物的不同PSY基因之間也會(huì)表現(xiàn)出親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，如本研究中辣椒6個(gè)CaPSY聚為2類，其中CaPSY04和CaPSY05的親緣關(guān)系最近，CaPSY03與其他CaPSY的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系最遠(yuǎn)，與基因的保守基序分析和氨基酸序列相似性分析結(jié)果相一致，預(yù)示著家族中每個(gè)基因具有不同的功能。

研究基因在組織和器官中的特定表達(dá)可以更準(zhǔn)確地了解其在組織中的功能作用[28-29]。本研究鑒定出的6個(gè)辣椒CaPSY基因在根、莖、葉、花和果實(shí)中均有表達(dá)，說明基因?yàn)榻M成型表達(dá)，但表達(dá)量存在差異，呈現(xiàn)出組織特異性的功能分化，這與已報(bào)道的草莓PSY表達(dá)模式[25]相似，其中CaPSY03、CaPSY04和CaPSY05基因是辣椒各組織器官中調(diào)控類胡蘿卜素的主要基因，在成熟紅果中CaPSY03和CaPSY05的表達(dá)量最高，推測(cè)辣椒紅果中類胡蘿卜素的合成主要由這2個(gè)基因調(diào)控，這為研究新的分子靶標(biāo)創(chuàng)制辣椒不同果色資源提供了理論依據(jù)。本研究探討的辣椒CaPSY基因家族的特性，為CaPSY基因功能機(jī)制的研究提供了基礎(chǔ)。