蘇 麗 周敦榮 譚茜茜 童玉梅

(陽江市人民醫(yī)院藥學(xué)部，廣東省陽江市 529500)

新型冠狀病毒肺炎(corona virus disease 2019，COVID-19)患者是SARS冠狀病毒2型(severe acute respiratory syndrome corona virus 2，SARS-CoV-2)所致的急性呼吸道傳染性疾病，本病的病理改變以免疫系統(tǒng)及肺臟功能受損為主，其因高效的傳播方式、難以預(yù)測(cè)的流行時(shí)間及較高的感染風(fēng)險(xiǎn)而對(duì)患者生命造成嚴(yán)重威脅[1]。部分COVID-19患者短時(shí)間內(nèi)可出現(xiàn)低氧血癥和/或呼吸困難，病情嚴(yán)重者可出現(xiàn)膿毒血癥、急性呼吸窘迫綜合征、多器官功能衰竭及難以糾正的代謝性酸中毒等[2-3]。目前，臨床上尚無治療COVID-19的特效藥，多采用對(duì)癥處理、抗感染、抗病毒等治療[4]。最近有研究報(bào)告，在COVID-19患者糞便中發(fā)現(xiàn)了SARS-CoV-2，可見腸道也是該病毒攻擊的靶器官，故制訂高效、安全的腸道保護(hù)方案尤為重要[5]。臨床研究表明，微生物調(diào)節(jié)劑可減輕肺炎患者機(jī)體的炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)腸道菌群，改善肺功能[6]。李蘭娟院士提出的COVID-19“四抗二平衡”治療策略包含了維持微生態(tài)平衡[7]。但目前關(guān)于微生物調(diào)節(jié)劑防治COVID-19的效果尚未有明確結(jié)論，且缺乏相關(guān)臨床實(shí)踐數(shù)據(jù)的支持。因此，本研究基于“肺-腸”軸理論，觀察微生物調(diào)節(jié)劑對(duì)COVID-19患者的治療效果，旨在為臨床治療COVID-19提供一定依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2020年2～3月我院收治的22例普通型COVID-19患者作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第六版)》[8]中關(guān)于普通型COVID-19的診斷標(biāo)準(zhǔn)，且咽拭子、痰液或下呼吸道分泌物等標(biāo)本的核酸檢測(cè)結(jié)果為陽性；(2)年齡18～75歲；(3)自愿簽署研究知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并鼻竇炎、急性氣管支氣管炎、中耳炎、化膿性扁桃體炎等疾病的患者；(2)伴有支氣管哮喘、肺結(jié)核、肺部腫瘤等其他呼吸系統(tǒng)疾病患者；(3)合并AIDS、原發(fā)性免疫缺陷病、先天性心臟病、先天性呼吸道畸形、肺發(fā)育異常、胃食管反流癥等基礎(chǔ)疾病患者；(4)凝血功能異?；颊?；(5)長期接受糖皮質(zhì)激素及其他免疫抑制劑等藥物治療的患者；(6)對(duì)本研究用藥過敏者；(7)妊娠期或哺乳期女性。剔除標(biāo)準(zhǔn)：治療期間出現(xiàn)腹瀉者；不可預(yù)測(cè)性、突發(fā)性死亡病例；因各種因素中途放棄治療或退出研究或轉(zhuǎn)院者；出現(xiàn)過敏反應(yīng)或不良事件，研究者判斷應(yīng)停止試驗(yàn)者。按隨機(jī)數(shù)字表法將患者分為對(duì)照組和觀察組，每組11例。其中，對(duì)照組中男性7例、女性4例，年齡19～72(48.26±3.06)歲；出現(xiàn)癥狀至接受治療的時(shí)間為1～11(5.29±1.49)d；合并冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病2例，合并糖尿病2例。觀察組中男性6例、女性5例，年齡20～76(47.16±4.26)歲；出現(xiàn)癥狀至接受治療的時(shí)間為2～13(6.02±1.33)d；合并冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病3例，合并糖尿病1例。兩組患者一般資料比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，具有可比性。本研究已獲我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 治療方法 參考《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第六版)》[8]中的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，兩組患者均接受常規(guī)西藥治療，即口服洛匹那韋/利托那韋片(AbbVie Deutschland GmbH & Co.KG，生產(chǎn)批號(hào)：117334；規(guī)格：每片含洛匹那韋100 mg，利托那韋25 mg)，4片/次，2次/d；將注射用重組人干擾素α2a(深圳科興生物工程有限公司，國藥準(zhǔn)字：S20000018；生產(chǎn)批號(hào)：SA210101；規(guī)格：600萬IU)600萬IU加入滅菌注射用水(上海浦津林州制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H41024230；生產(chǎn)批號(hào)：1906221；規(guī)格：5 mL)2 mL，霧化吸入，2次/d。同時(shí)密切監(jiān)測(cè)病情，根據(jù)病情給予支持及對(duì)癥治療。在上述治療的基礎(chǔ)上，觀察組加用微生物調(diào)節(jié)劑治療，即采用溫開水沖服雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌片(杭州遠(yuǎn)大生物制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字：S20060010；生產(chǎn)批號(hào)：202006331；0.5 g/片)，2.0 g/次，3次/d。兩組均于連續(xù)治療7 d后進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的評(píng)估。

1.3 觀察指標(biāo) (1)核酸轉(zhuǎn)陰率。比較兩組患者治療7 d后的呼吸道標(biāo)本核酸檢測(cè)結(jié)果轉(zhuǎn)陰率。(2)臨床癥狀消失所需時(shí)間。記錄兩組患者住院期間乏力、發(fā)熱、咳嗽消失所需時(shí)間。(3)療效。治療7 d后，參考《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第六版)》[8]中的療效標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)估：治療后呼吸道癥狀基本消失，體溫恢復(fù)正常>3 d，肺部影像學(xué)顯示急性滲出性病變明顯改善，連續(xù)2次呼吸道標(biāo)本核酸檢測(cè)陰性(采樣時(shí)間至少間隔1 d)，達(dá)到出院及解除隔離標(biāo)準(zhǔn)，則視為治愈；治療后呼吸道癥狀部分緩解，體溫恢復(fù)正常>3 d，肺部影像學(xué)顯示急性滲出性病變有所改善，呼吸道標(biāo)本核酸檢測(cè)有1次為陰性，則視為好轉(zhuǎn)；臨床癥狀、體征仍存在或加重(尤其是呼吸困難)，肺部影像學(xué)顯示急性滲出性病變未改善，呼吸道標(biāo)本核酸檢測(cè)仍為陽性視為無效。治療總有效率=(治愈+好轉(zhuǎn))例數(shù)/總例數(shù)×100%。(4)呼吸道菌群。通過一次性咽拭子采集患者治療前、治療7 d后的痰液標(biāo)本，20 min內(nèi)送至微生物室，按照《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》[9]中的相關(guān)要求進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)及分離。將標(biāo)本接種于血平板(無錫菩禾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司)上，放于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，使用VITEK系列全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)(biosMerieumx公司)進(jìn)行菌群種類鑒別。(5)腸道菌群。于治療前、治療7 d后，采集患者5～8 g新鮮大便標(biāo)本(若患者無法自行排便，則使用開塞露輔助排便)，置于干燥、潔凈、無吸水性的有蓋容器內(nèi)，20 min內(nèi)送至微生物室，將樣本稱重、稀釋后，接種于血瓊脂平板培養(yǎng)，采用平板活菌計(jì)數(shù)法測(cè)定乳桿菌、雙歧桿菌、腸球菌、腸桿菌的基因拷貝數(shù)，以lg CFU/g表示每克糞便中的細(xì)菌量。(6)免疫功能。采集患者治療前、治療7 d后的空腹靜脈血3 mL，室溫下放置20 min，于德國艾本德5804R型低溫高速離心機(jī)上離心5 min，轉(zhuǎn)速為3 000 r/min，離心半徑為6 cm，取上清液，置于美國Thermo Fisher Scientific TSX400超低溫冰箱中保存待測(cè)。使用NovoCyte流式細(xì)胞儀(上海然哲儀器設(shè)備有限公司)測(cè)定CD3+T淋巴細(xì)胞、CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞水平，并計(jì)算CD4+/CD8+比值。(7)不良反應(yīng)。治療7 d后，記錄治療期間患者出現(xiàn)胃腸道癥狀的情況，并通過檢測(cè)患者血常規(guī)、血生化、肝功能、腎功能、心肌標(biāo)志物水平，判斷患者是否出現(xiàn)腎功能受損、肝功能受損、心肌受損。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以(x±s)表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或配對(duì)t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者治療總有效率及核酸轉(zhuǎn)陰率的比較 兩組患者的治療總有效率及核酸轉(zhuǎn)陰率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.229，P=0.632；χ2=0.000，P=1.000)。見表1。

表1 兩組患者療效及核酸轉(zhuǎn)陰率的對(duì)比[n(%)]

2.2 兩組患者臨床癥狀消失所需時(shí)間的比較 兩組患者乏力、發(fā)熱、咳嗽消失所需時(shí)間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表2。

表2 兩組患者臨床癥狀消失所需時(shí)間的比較(x±s，d)

2.3 兩組患者治療前后呼吸道菌群數(shù)量的比較 治療前，兩組患者各呼吸道菌群數(shù)量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)；治療后，兩組患者各呼吸道菌群數(shù)量均少于治療前，且觀察組的菌群數(shù)量均少于對(duì)照組(均P<0.05)。見表3。

表3 兩組患者治療前后呼吸道菌群數(shù)量的比較(x±s，lg CFU/g)

組別n韋榮氏球菌屬治療前治療后t值P值梭桿菌屬治療前治療后t值P值對(duì)照組1111.19±3.618.55±1.222.2980.03311.28±2.839.13±1.232.3110.032觀察組1111.92±3.286.83±1.824.500<0.00111.39±2.136.62±0.836.921<0.001 t值0.4962.6040.1035.610P值0.6250.0170.919<0.001

2.4 兩組患者治療前后腸道菌群數(shù)量的比較 治療前，兩組患者各個(gè)腸道菌群數(shù)量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)；治療后，觀察組乳桿菌、雙歧桿菌數(shù)量多于治療前及對(duì)照組，腸球菌、腸桿菌數(shù)量少于治療前及對(duì)照組(均P<0.05)。見表4。

表4 兩組患者治療前后腸道菌群數(shù)量的比較(x±s，lg CFU/g)

組別n腸球菌治療前治療后t值P值腸桿菌治療前治療后t值P值對(duì)照組118.95±0.858.56±1.250.8560.4029.48±0.869.05±0.881.1590.260觀察組119.02±1.037.03±1.034.531<0.0019.49±0.768.12±0.834.038<0.001 t值0.1743.1330.0292.550P值0.8640.0050.9770.019

2.5 兩組患者治療前后T淋巴細(xì)胞亞群水平的比較 治療前，兩組患者各T淋巴細(xì)胞水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)；治療后，兩組患者CD3+T淋巴細(xì)胞水平、CD4+T淋巴細(xì)胞水平、CD4+/CD8+比值均高于治療前，CD8+T淋巴細(xì)胞水平均低于治療前(均P<0.05)，且觀察組上述指標(biāo)均優(yōu)于對(duì)照組(均P<0.05)。見表5。

表5 兩組患者治療前后T淋巴細(xì)胞亞群水平的比較 (x±s)

組別nCD8+T淋巴細(xì)胞(%)治療前治療后t值P值CD4+/CD8+比值治療前治療后t值P值對(duì)照組1132.26±3.7228.83±2.022.6870.0140.96±0.251.22±0.182.7990.011觀察組1133.59±3.3823.35±2.468.124<0.0010.93±0.281.42±0.214.643<0.001 t值0.8785.7100.2652.398P值0.391<0.0010.7940.026

2.6 兩組患者不良反應(yīng)發(fā)生率的比較 觀察組的不良反應(yīng)總發(fā)生率低于對(duì)照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.306，P=0.580)。見表6。

表6 兩組不良反應(yīng)發(fā)生率的比較[n(%)]

3 討 論

隨著對(duì)COVID-19的病理及臨床表現(xiàn)的認(rèn)識(shí)逐漸加深，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)COVID-19不僅會(huì)損傷患者肺部組織，且會(huì)累及免疫系統(tǒng)、胃腸道等[10]。Chung[11]研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群可通過短鏈脂肪酸、細(xì)菌脂多糖，以及調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞等來改善肺部免疫反應(yīng)，進(jìn)而對(duì)肺部微生物群的定植產(chǎn)生影響。當(dāng)腸道菌群發(fā)生紊亂時(shí)，機(jī)體產(chǎn)生的炎性介質(zhì)經(jīng)血液循環(huán)進(jìn)入肺部，進(jìn)而影響肺部免疫應(yīng)答的類型、強(qiáng)度及微生態(tài)環(huán)境[12]。呼吸道感染可誘發(fā)腸道菌群微環(huán)境改變，即“肺病及腸”，而腸道菌群微環(huán)境紊亂可造成呼吸道感染的反復(fù)出現(xiàn)，即“腸病及肺”。故有學(xué)者提出“肺-腸”軸的概念，“肺-腸”軸調(diào)控呼吸道、胃腸道的免疫傳遞，可通過黏膜免疫來實(shí)現(xiàn)肺部抵御微生物入侵的目的[13]。這表明在COVID-19的治療中，不應(yīng)忽略腸道微生物的調(diào)控作用。

本研究結(jié)果顯示，兩組患者的治療總有效率、核酸轉(zhuǎn)陰率，以及乏力、發(fā)熱、咳嗽消失所需時(shí)間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，而且兩組大部分治療無效的患者為臨床癥狀未緩解或加重，可見微生物調(diào)節(jié)劑對(duì)改善COVID-19患者的療效、臨床癥狀及核酸轉(zhuǎn)陰效果并不理想。但這也可能與本研究納入樣本量較少、隨訪時(shí)間較短有關(guān)，故后期仍需展開深入研究，進(jìn)一步觀察微生物調(diào)節(jié)劑對(duì)COVID-19病情的改善作用。

本研究中，觀察組治療后呼吸道和腸道各菌群數(shù)量的改善情況均優(yōu)于對(duì)照組(均P<0.05)，這提示微生物調(diào)節(jié)劑可能通過“肺-腸”軸調(diào)節(jié)COVID-19患者的呼吸道和腸道菌群，分析原因可能為：給予微生物調(diào)節(jié)劑干預(yù)可直接為機(jī)體補(bǔ)充正常腸道菌群，并促進(jìn)有益菌的繁殖及生長，同時(shí)抑制致病菌繁殖，恢復(fù)腸道菌群的平衡，從而通過“肺-腸”軸來調(diào)節(jié)上呼吸道菌群的平衡。具體機(jī)制可能為：(1)肺部與腸道微生物相互影響。定植于呼吸道與消化道黏膜上的微生物可作為肺-腸聯(lián)系的物質(zhì)基礎(chǔ)，如腸道中的乳酸桿菌可與樹突狀細(xì)胞相互作用而影響T淋巴細(xì)胞分化為調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞或Th1、Th2，抑制單核細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子α等促炎癥因子，從而減輕炎癥反應(yīng)[14]。(2)肺部與腸道通過菌群介導(dǎo)免疫反應(yīng)。① 樹突狀細(xì)胞可識(shí)別腸道病原體的相關(guān)分子，隨后改變其表型并遷移至腸系膜淋巴結(jié)，激活初始T淋巴細(xì)胞并獲得趨化因子受體4、6等歸巢分子后，向呼吸道黏膜轉(zhuǎn)移[15-16]。② 腸道微生物與模式識(shí)別受體相互作用后，可激活下游的調(diào)節(jié)固有免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)，而微生物調(diào)節(jié)劑通過樹突狀細(xì)胞及巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)和激活免疫反應(yīng)參與機(jī)體免疫。此外，微生物調(diào)節(jié)劑作用于上皮細(xì)胞后菌體被內(nèi)化，與消化道固有層中的樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及抗原呈遞細(xì)胞相互作用而增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能，進(jìn)而改善腸道與肺部的免疫功能[17-18]。(3)肺部與腸道中的微生物代謝產(chǎn)物可相互影響。腸道微生物可在消化酶作用下分解成碳水化合物、膳食纖維等物質(zhì)，促進(jìn)腸道吸收短鏈脂肪酸。短鏈脂肪酸主要通過刺激CD4+叉頭框蛋白p3調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞，影響T淋巴細(xì)胞趨向分化，減少促炎細(xì)胞因子及單核細(xì)胞等免疫細(xì)胞的生成[19]。當(dāng)單核細(xì)胞遷移至肺部時(shí)，可促進(jìn)初始T淋巴細(xì)胞分化為調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞，抑制初始T淋巴細(xì)胞分化為Th2細(xì)胞，減輕氣道過敏反應(yīng)與炎癥反應(yīng)。

從免疫病理學(xué)角度來看，SARS-CoV-2可誘導(dǎo)趨化因子、炎性細(xì)胞因子及輔助性T淋巴細(xì)胞1激活，造成適應(yīng)性免疫反應(yīng)抑制、炎癥反應(yīng)失衡及淋巴細(xì)胞減少，抑制適應(yīng)性免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗病毒抗體[20]。劉玲等[21]研究發(fā)現(xiàn)，COVID-19患者機(jī)體普遍存在細(xì)胞免疫、體液免疫功能紊亂的現(xiàn)象，機(jī)體抗病毒能力降低。因此，提高機(jī)體免疫功能在抑制COVID-19病情進(jìn)展中尤為重要。本研究中，兩組治療前CD3+T淋巴細(xì)胞水平、CD4+T淋巴細(xì)胞水平、CD4+/CD8+比值較低，CD8+T淋巴細(xì)胞水平較高，提示COVID-19患者細(xì)胞免疫功能降低，與上述研究結(jié)果基本一致；治療后，觀察組CD3+T淋巴細(xì)胞水平、CD4+T淋巴細(xì)胞水平、CD4+/CD8+比值均高于治療前及對(duì)照組，CD8+T淋巴細(xì)胞水平低于治療前及對(duì)照組(均P<0.05)，這提示在常規(guī)西藥治療基礎(chǔ)上加用微生物調(diào)節(jié)劑可提高COVID-19患者的免疫功能，維持機(jī)體免疫平衡。本研究中，兩組不良反應(yīng)發(fā)生率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，這提示常規(guī)西藥治療聯(lián)合微生物調(diào)節(jié)劑治療COVID-19患者，具有較高的安全性。

綜上所述，微生物調(diào)節(jié)劑可能通過“肺-腸”軸調(diào)節(jié)COVID-19患者的肺部及腸道菌群，提高患者的免疫功能，但其在提高療效、緩解臨床癥狀及促進(jìn)核酸轉(zhuǎn)陰方面效果不明顯。本研究存在一定局限性，如病例來源單一、樣本量少、隨訪時(shí)間短等，導(dǎo)致結(jié)果可能存在一定偏倚，后期須擴(kuò)大樣本量、延長觀察時(shí)間和隨訪時(shí)間，以進(jìn)一步探討微生物調(diào)節(jié)劑對(duì)COVID-19患者的治療效果。