崖嬌練 徐玉嬋 許澤輝 蔡 稔 羅世強 蔡鵬飛 覃柳群 嚴(yán)提珍

(廣西柳州市婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳科、柳州市出生缺陷預(yù)防與控制重點實驗室、柳州市生殖醫(yī)學(xué)重點實驗室，廣西柳州市 545001)

常見的性染色體非整倍體(sex chromosome aneuploidy,SCA)疾病包括特納綜合征、克氏綜合征、47,XYY綜合征及X三體綜合征等。其中，47,XXX綜合征及特納綜合征患者常表現(xiàn)為身材矮小、青春期發(fā)育延遲、卵巢發(fā)育不良、不孕、先天性心臟畸形等[1]?？耸暇C合征與男性睪丸發(fā)育不充分及不育癥相關(guān)，相關(guān)表型通常在青春期后出現(xiàn)[2]。47,XYY綜合征的表型多樣且臨床癥狀體征不明顯，部分患者可無明顯表型，而部分患者存在發(fā)育遲緩、學(xué)習(xí)困難、認(rèn)知障礙等異常表現(xiàn)，并可能出現(xiàn)反社會傾向[3]。X三體綜合征的患者表型高度可變[4]。

雖然有文獻報告頸部水囊狀淋巴管瘤及頸項透明層增厚與特納綜合征有關(guān)[5-6]，但對于其他類型SCA，目前沒有準(zhǔn)確率較高的產(chǎn)前篩查方法。因此，目前臨床上多數(shù)特納綜合征患者可得到診斷，但克氏綜合征、47,XYY綜合征及X三體綜合征等其他SCA的臨床診斷較為困難；且克氏綜合征的確診年齡往往晚于特納綜合征、47,XXX及47,XYY綜合征[7]，而未診斷及延遲診斷可導(dǎo)致患者錯過最佳干預(yù)時機[8]。如何早期診斷SCA并及早干預(yù)，對SCA臨床診療具有重要意義。無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(non-invasive prenatal testing,NIPT)技術(shù)是一種通過對孕婦外周血游離DNA進行高通量測序及生物信息學(xué)分析，來評估胎兒染色體非整倍體發(fā)生風(fēng)險的產(chǎn)前篩查技術(shù)。與傳統(tǒng)的血清學(xué)篩查相比，NIPT技術(shù)具有高靈敏度和高特異性的特點，目前已被廣泛應(yīng)用于胎兒13-三體綜合征、18-三體綜合征及21-三體綜合征的產(chǎn)前篩查，但其對胎兒SCA的檢測效能仍缺乏研究數(shù)據(jù)。本研究采用NIPT技術(shù)對孕婦外周血游離DNA進行檢測，探討NIPT技術(shù)在胎兒SCA診斷中的臨床應(yīng)用價值，為胎兒SCA的診斷與盡早干預(yù)提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年8月至2020年12月期間，在我院行NIPT且結(jié)果提示SCA高風(fēng)險的所有孕婦，共計223例。獲得孕婦及家屬知情同意后行侵入性產(chǎn)前診斷、孕婦外周血核型檢查，并進行妊娠結(jié)局隨訪。入組時孕婦年齡為27.5～38.5(33.0±5.5)歲，孕周為14～20(17.0±3.1)周，其中初產(chǎn)婦45例(20.18%)、經(jīng)產(chǎn)婦175例(78.48%)，有3例孕產(chǎn)史不詳(1.35%)。

1.2 NIPT方法 使用DNA保存管采集孕婦的外周靜脈血8～10 mL，輕柔顛倒混合使血液與采血管中的抗凝劑充分混合，室溫放置30 min后于2 ℃～8 ℃條件下保存。樣本無凝血、嚴(yán)重溶血等情況，且須在48 h內(nèi)運達實驗室，方視為合格樣本。使用杭州貝瑞和康基因診斷技術(shù)有限公司生產(chǎn)的胎兒染色體非整倍體(T13/T18/T21)檢測試劑盒(可逆末端終止測序法)(國械注準(zhǔn)20153400461)，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行血漿游離DNA提取、末端補平、加接頭、文庫純化、文庫定量、文庫混合、高通量測序(測序儀廠家：Illumina公司；型號：NextSeq CN500)及數(shù)據(jù)分析，使用貝瑞和康基因診斷技術(shù)有限公司的胎兒SCA數(shù)據(jù)分析軟件(浙械注準(zhǔn) 20182700231)對測序數(shù)據(jù)進行分析，異常結(jié)果由軟件自動提示。

1.3 介入性產(chǎn)前診斷

1.3.1 樣本采集：(1)羊水標(biāo)本采集。 由具有從事產(chǎn)前診斷資質(zhì)的臨床醫(yī)生在超聲定位下對孕16～22+6周的孕婦行羊膜腔穿刺術(shù)，按8～10 mL/管抽取2管羊水送檢。取樣過程順利，孕婦無術(shù)后并發(fā)癥。(2)臍血標(biāo)本采集。由具有從事產(chǎn)前診斷資質(zhì)的臨床醫(yī)生在超聲引導(dǎo)下對孕 23 周及以上的孕婦行臍靜脈穿刺，抽取臍帶血 2～5 mL,注入5 mL無菌肝素抗凝管送檢。取樣過程順利，孕婦無術(shù)后并發(fā)癥。

1.3.2 胎兒染色體核型分析：羊水和臍血樣本分兩線進行接種、培養(yǎng)，經(jīng)制片、G顯帶后鏡檢。要求染色體分辨率達到320條帶，每線至少計數(shù)10個核型，分析3個核型，如遇異?；蛴幸蓡柕臉?biāo)本則需增加計數(shù)及分析的核型數(shù)。經(jīng)根據(jù)國際人類細(xì)胞遺傳學(xué)命名體系(ISCN2016)[9]對染色體核型進行描述。以該分析結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)，計算NIPT的陽性預(yù)測值(positive predictive value,PPV)，即NIPT檢出的全部陽性例數(shù)中，真陽性(胎兒染色體核型分析最終確診為SCA)例數(shù)所占的比例。

1.4 外周血染色體核型分析 抽取孕婦外周血靜脈血2 mL(使用肝素抗凝劑)，按1.3.2的方法進行外周血染色體核型分析，但至少計數(shù)20個核型，分析5個核型。

2 結(jié) 果

2.1 NIPT結(jié)果 223例SCA孕婦中，檢出X染色體減少的孕婦比例最高，其次是X染色體增加且有Y染色體、X染色體增加但無Y染色體的孕婦，檢出Y染色體增加的孕婦比例最低。見表1。

表1 NIPT檢出的性染色體異常情況

2.2 介入性產(chǎn)前診斷結(jié)果和妊娠結(jié)局 223例SCA高風(fēng)險孕婦中，80.72%(180/223)的孕婦選擇行侵入性產(chǎn)前診斷；16.14%(36/223)的孕婦拒絕行產(chǎn)前診斷；1.79%(4/223)的孕婦因超聲異常而引產(chǎn)，未行產(chǎn)前診斷；1.35%(3/223)的孕婦自然流產(chǎn)。選擇介入性產(chǎn)前診斷的180例孕婦中，有66例確診為SCA，NIPT的總PPV為36.67%(66/180)，其在X染色體減少病例中的PPV最低，在Y染色體增加病例中的PPV最高，見表2；但在66例確診為SCA的病例中，有8例NIPT結(jié)果提示的性染色體異常類型和介入性產(chǎn)前診斷的性染色體異常類型不符，見表3。在確診的SCA孕婦中，終止妊娠率為57.58 %(38/66)，見表2。

表2 接受介入性產(chǎn)前診斷孕婦的診斷結(jié)果及妊娠結(jié)局

表3 NIPT篩查與介入性產(chǎn)前診斷類型不一致的情況

2.3 孕婦外周血核型分析結(jié)果 在接受介入性產(chǎn)前診斷的180例孕婦中，有47例同時進行了外周血核型檢查，其中核型正常共36例，提示其他常染色體平衡易位或倒位共3例，性染色體異常共8例。這8例性染色體異常的病例中，NIPT結(jié)果有6例提示母源性異常，有2例未提示母源性異常；有3例的胎兒也經(jīng)介入性產(chǎn)前診斷確診為SCA，其他5例均為假陽性。見表4。

表4 8例外周血核型檢查異常的病例情況

3 討 論

3.1 NIPT對SCA的檢出能力 本研究中，NIPT對SCA的總PPV為36.67%(66/180)，但在X染色體減少病例中的PPV僅為19.81%，而在X染色體增加且有Y染色體、X染色體增加但無Y染色體病例中的PPV均高于50%，在Y染色體增加中的PPV高達90.91%。由此可見，NIPT提示為性染色體三體的病例患SCA的概率更高，尤其是Y染色體增多病例，而NIPT用于X染色體減少的病例時PPV相對更低，這與國內(nèi)外其他研究[10-11]結(jié)論一致。其原因可能為X染色體與Y染色體的高度同源及高通量測序讀長短導(dǎo)致定位錯誤、GC偏倚[12-13]。雖然有研究顯示NIPT在SCA產(chǎn)前篩查的PPV不如13三體綜合征、18三體綜合征及21三體綜合征[10]，但張麗娜等[14]對242例性染色體異常胎兒的產(chǎn)前介入性前診斷指征分析表明，NIPT結(jié)果高風(fēng)險已成為最常見的進行介入性產(chǎn)前診斷的指征，也是性染色體三體確診最可靠的依據(jù)。我們的研究進一步證明了NIPT可以作為性染色體三體產(chǎn)前篩查的有效手段，且對胎兒SCA有一定的檢出效能。

3.2 影響NIPT檢測SCA結(jié)果準(zhǔn)確性的因素 本研究中，有8例NIPT提示SCA高風(fēng)險的孕婦經(jīng)外周血核型分析存在性染色體異常，其中有3例經(jīng)介入性產(chǎn)前診斷確診，另外5例均為假陽性。NIPT技術(shù)在物理上并未將母源性游離DNA和胎源性游離DNA分離，母源性染色體畸變可以掩蓋胎兒實際的染色體檢測結(jié)果，故母源性染色體異?？赡苁且餘IPT假陽性的原因之一[15-17]。在NIPT中，相對于13三體綜合征、18三體綜合征及21三體綜合征而言，母源性異常所致的SCA假陽性更常見[17]。因此，對于NIPT提示SCA高風(fēng)險的假陽性病例，可通過對孕婦本人進行外周血染色體G顯帶核型分析或者染色體微陣列分析、全基因組拷貝數(shù)變異檢測，分析導(dǎo)致假陽性的原因。對于真陽性的病例，孕婦的染色體核型分析也是必要的，可用于鑒別染色體畸變是遺傳還是新發(fā)的，從而精準(zhǔn)指導(dǎo)下一次生育。

此外，我們發(fā)現(xiàn)有8例樣本NIPT提示的性染色體異常類型與介入性產(chǎn)前診斷結(jié)果不一致，其中5例孕婦進行了外周血G顯帶核型分析，均未發(fā)現(xiàn)異常。由于母體低比例的染色體嵌合可能無法通過外周血染色體核型分析檢測明確，需要通過分辨率更高的染色體微陣列分析或全基因組拷貝數(shù)變異檢測才能檢測出來，因此我們無法確定這5個病例是否受母體X染色體低比例嵌合的干擾。陳雪嬌等[18]報告了1例NIPT結(jié)果為45,XO高風(fēng)險、胎兒核型為47,XXX[45]/46,XX[55]的嵌合體病例，胎盤熒光原位雜交技術(shù)檢測提示80% 的45,XO嵌合。限制性胎盤嵌合也是影響NIPT結(jié)果準(zhǔn)確性的主要原因之一[19]。本研究中，對于8例NIPT提示的性染色體異常類型與介入性產(chǎn)前診斷結(jié)果不一致的病例，均未能留取胎盤進行檢測，不能排除胎盤嵌合引起的結(jié)果不一致。

除以上原因外，母血中胎兒DNA含量低、母親罹患腫瘤、雙胎之一停育等因素也是導(dǎo)致NIPT檢測結(jié)果與介入性產(chǎn)前診斷結(jié)果不一致的生物學(xué)因素[19]。檢測前盡可能完整地收集孕婦的臨床資料，如孕產(chǎn)史、現(xiàn)病史、外周血染色體核型分析結(jié)果等，檢測后多點留取胎盤樣本，是分析導(dǎo)致NIPT假陰性或假陽性的原因的重要手段。

3.3 妊娠方式的選擇 在66例確診為SCA的病例中，有1例孕婦因?qū)m頸機能不全而自然流產(chǎn)，38例(57.58%)孕婦自愿選擇終止妊娠，以NIPT提示為X染色體減少和X染色體增加且有Y染色體的病例的終止妊娠率最高，分別為57.14%和82.61%。影響SCA病例終止妊娠的主要因素為SCA類型、超聲結(jié)果異常，產(chǎn)前診斷為45,X和47,XXY的孕婦更傾向于選擇引產(chǎn)[6]。有學(xué)者報告，低水平的45,X/46,XX嵌合現(xiàn)象可出現(xiàn)在表型正常的女性中，其壽命、生育能力及心血管功能等可能與正常人無明顯的差異[20]。因此，確診為X染色體減少的嵌合體病例是否應(yīng)該引產(chǎn)，還應(yīng)結(jié)合異常核型嵌合比例及超聲檢測結(jié)果謹(jǐn)慎地為孕婦提供咨詢服務(wù)，以免過度解讀報告帶給孕婦巨大的心理壓力。

總之，NIPT不僅在13三體綜合征、18三體綜合征及21三體綜合征的產(chǎn)前診斷中發(fā)揮著重要的作用，對SCA的產(chǎn)前篩查也具有一定的價值，然而其在X染色體減少病例中的檢測準(zhǔn)確性仍有待提高。在胎兒SCA的遺傳咨詢及孕婦妊娠選擇中，臨床醫(yī)師需要積累更多的數(shù)據(jù)，避免對報告過度解讀。