冷怡林，金豆豆，李 娟

（洛陽市中醫(yī)院 制劑室，河南 洛陽 471003）

三顆針為小檗科植物擬豪豬刺Berberis soulieana Schneid.、小黃連刺Berberis wilsonae Hemsl.、細(xì)葉小檗Berberis poiretii Schneid.或匙葉小檗Berberis vernae Schneid.等同屬數(shù)種植物的干燥根。具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效。用于濕熱瀉痢，黃疸，濕疹，咽痛目赤，聤耳流膿，癰腫瘡毒。三顆針主要含異喹啉類生物堿[1]，具有抗病原微生物[2]，降低血壓，提高免疫力，降脂調(diào)脂，抗心律失常、抗腫瘤等作用，臨床用于消炎抗菌、降血壓、降血糖、降血脂等[3-4]。其主要藥效成分鹽酸小檗堿具有廣譜抗菌、增加白細(xì)胞吞噬功能、利膽、刺激促腎上腺皮質(zhì)激素分泌及降壓等作用，為臨床常用抗菌消炎藥[5]。

鹽酸小檗堿的傳統(tǒng)提取方法有石灰乳法[6-8]，酸水法[9]和醇提法[10]，但以上方法均不同程度地存在提取時間長、溶劑消耗大、有效成分提取率低、操作煩瑣等問題。近年發(fā)展的閃式提取法是將藥材與溶劑在室溫下快速粉碎至細(xì)微顆粒，使溶劑迅速與藥材組織內(nèi)部結(jié)合并達(dá)到平衡的一種新技術(shù)，可最大限度地萃取有效成分，保護(hù)熱敏成分，具有溶劑用量小、提取時間短、提取率高等優(yōu)點(diǎn)[11-12]，廣泛適用于中藥有效成分的提取[13-14]。本實(shí)驗(yàn)首次將閃式提取法應(yīng)用于三顆針中鹽酸小檗堿的提取，通過Plackett-Burnman設(shè)計（PBD）篩選出提取過程中的主要影響因素，并利用最陡爬坡試驗(yàn)及Box-Behnken設(shè)計（BBD）-效應(yīng)面（RSM）優(yōu)化法，確定三顆針中鹽酸小檗堿的最佳提取工藝和提取條件。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Thermo ScientificTMDionexTMUltiMateTM3000高效液相色譜儀（包括四元泵、DAD檢測器，賽默飛世爾科技中國有限公司）；JHBE-50S型中藥閃式提取器（河南金鼐科技發(fā)展有限公司）；H5322型中藥粉碎機(jī)（河北朵麥信息科技有限公司）；Quintix 224電子天平（0.01 mg，德國賽多利斯公司）；PS-1010HT型數(shù)控超聲波清洗器（功率600 W，合肥攀升超聲波科技有限公司）；DHG-9053A型干燥箱（無錫瑪瑞科技有限公司）；Milli-Q Academic超純水系統(tǒng)（美國默克密理博）。

1.2 藥品與試劑

鹽酸小檗堿（批號：110713-202015，含量以85.9 %計，中國食品藥品檢定研究院）；三顆針?biāo)幉馁徸园不帐≠裰菟幉拇笫袌?，?jīng)鑒定為小檗科植物擬豪豬刺Berberis soulieana Schneid.的干燥根，除去雜質(zhì)，洗凈，干燥；乙腈，甲醇均為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 閃式提取工藝

取三顆針供試品適量，粉碎，過四號篩，取粉末約100 g，精密稱定，投入閃式提取器中，加入適當(dāng)提取介質(zhì)，設(shè)置儀器參數(shù)，充分提取，過濾，取續(xù)濾液按相應(yīng)方法測定，計算鹽酸小檗堿的轉(zhuǎn)移率。轉(zhuǎn)移率（%）=提取液中鹽酸小檗堿含量/藥材中鹽酸小檗堿含量×100。

2.2 鹽酸小檗堿的含量測定

2.2.1 供試品溶液的制備 取三顆針供試品適量，粉碎，過四號篩，取粉末約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 ml，密塞，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）1 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取鹽酸小檗堿對照品適量，置于25 ml量瓶中，加甲醇溶解稀釋至刻度，搖勻，制成每1 ml含鹽酸小檗堿722.45 μg的對照品溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，備用。

2.2.3 色譜條件 日本島津Wondasil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液（24:76）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：265 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10.00 μl。在上述條件下，供試品溶液中鹽酸小檗堿色譜峰理論塔板數(shù)高于6000，與相鄰色譜峰分離度符合規(guī)定，見圖1。

圖1 三顆針鹽酸小檗堿對照品溶液（A）和供試品溶液（B）HPLC圖譜

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取對照品溶液 0.5，1，2，4，6，8 ml，分別置于10 ml量瓶中，加甲醇溶解稀釋至刻度，搖勻，按2.2.3項下色譜條件測定，記錄色譜圖及鹽酸小檗堿峰面積。以鹽酸小檗堿質(zhì)量濃度（x，μg/ml）為橫坐標(biāo)，以峰面積值（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算相應(yīng)回歸方程和相關(guān)系數(shù)（r）。結(jié)果鹽酸小檗堿的回歸方程為y=332 151x+1999.4（r=0.9994），表明峰面積與濃度在36.12～577.96 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 取對照品溶液，按2.2.3項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖及鹽酸小檗堿峰面積。結(jié)果鹽酸小檗堿峰面積RSD為0.58 %（n=6）。說明儀器精密度良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取三顆針樣品6份，按2.2.1項下方法分別制備供試品溶液，按2.2.3項下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖及峰面積值。結(jié)果鹽酸小檗堿平均含量為7.2245 mg/g，RSD為1.09 %（n=6）。表明方法重復(fù)性良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取2.2.1項下供試品溶液，按2.2.3項下色譜條件，分別于制備后 0，4，8，16，20，24 h進(jìn)樣，記錄色譜圖及峰面積。結(jié)果鹽酸小檗堿峰面積RSD為0.77 %（n=6）。說明供試品溶液在室溫條件下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 加樣回收試驗(yàn) 取已知含量的三顆針樣品9份，每份約0.5 g，精密稱定，分成3組，分別精密加入濃度為1.452 mg/ml的鹽酸小檗堿對照品溶液2.0，2.5，3.0 ml，按2.2.1項下供試品制備方法處理，按2.2.3項下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果鹽酸小檗堿的平均加樣回收率為100.6 %，相應(yīng)RSD值為2.15 %（n=9）。說明方法準(zhǔn)確性良好。

2.3 PBD篩選顯著性因素

2.3.1 PBD 因素水平及試驗(yàn)結(jié)果 參考文獻(xiàn)報道[15-16]及前期研究，選擇提取介質(zhì)（乙醇）濃度、提取時間、液料比、藥材粒度、提取次數(shù)、閃式提取器轉(zhuǎn)速6個影響因素，以鹽酸小檗堿轉(zhuǎn)移率為響應(yīng)值，每個因素設(shè)計2個水平（設(shè)計高水平為+1，低水平為-1），運(yùn)用Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)置12組試驗(yàn)。PB試驗(yàn)因素及水平見表1，試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果見表2。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計因素及水平

表2 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果

2.3.2 模型建立和分析 運(yùn)用Design expert 8.0.6軟件進(jìn)行顯著性分析，模型具有顯著性（P＜0.05）；復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.8955，相關(guān)性較好，說明可用該模型解釋上述6個因素對響應(yīng)值的影響，結(jié)果見表3。由表3可見，6個因素對響應(yīng)值的影響按大小排序?yàn)橐毫媳龋疽掖紳舛龋咎崛r間＞閃式提取器轉(zhuǎn)速＞提取次數(shù)＞藥材粒度，影響閃式提取三顆針中鹽酸小檗堿的顯著性因素為液料比、乙醇濃度及提取時間。

表3 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計方差分析

2.4 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果

由PBD試驗(yàn)結(jié)果可知影響閃式提取三顆針中鹽酸小檗堿的顯著性因素為液料比、乙醇濃度及提取時間，且均呈正效應(yīng)。為快速逼近最優(yōu)區(qū)域，本研究設(shè)計最陡爬坡試驗(yàn)，固定提取次數(shù)為2次，藥材粒度為30目，閃式提取器轉(zhuǎn)速為3000 r/min，采用正向爬坡模式（液料比步長設(shè)為5 ml/g，乙醇濃度步長設(shè)為10 %，提取時間步長設(shè)為5 s），以鹽酸小檗堿轉(zhuǎn)移率為觀察值，分析鹽酸小檗堿提取的最優(yōu)參數(shù)，結(jié)果見表4。由表4可知，最優(yōu)提取工藝為實(shí)驗(yàn)4，參數(shù)為液料比40 ml/g，乙醇濃度70 %，提取時間30 s，此時鹽酸小檗堿的轉(zhuǎn)移率為96.57 %，因此選擇實(shí)驗(yàn)3，4，5對應(yīng)水平進(jìn)行Box-Behnken設(shè)計-效應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

表4 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果

2.5 BBD-RSM優(yōu)化提取工藝

2.5.1 BBD試驗(yàn)因素、水平及結(jié)果 基于PBD試驗(yàn)及最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果，選擇液料比（A），乙醇濃度（B），提取時間（C）為考察因素，以鹽酸小檗堿的轉(zhuǎn)移率為指標(biāo)，采用Design expert 8.0.6軟件，設(shè)置三因素三水平（編碼為-1，0，+1）模型進(jìn)行試驗(yàn)，并對二次多項方程進(jìn)行顯著性分析。因素與水平見表5，試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果見表6。

表5 Box-Behnken設(shè)計因素與水平

表6 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果

2.5.2 數(shù)據(jù)處理及模型擬合分析 運(yùn)用Design expert 8.0.6軟件，以鹽酸小檗堿轉(zhuǎn)移率（Y）為響應(yīng)值對各因素進(jìn)行多元線性回歸、二項式擬合及方差分析。結(jié)果，模型顯著（P＜0.05），失擬項不顯著（P＞0.05），多元相關(guān)系數(shù)R2為0.9142，表明所建模型擬合度較高，能準(zhǔn)確預(yù)測實(shí)際情況?；貧w方程為Y=96.42+2.41A+1.97B-0.32C+0.073AB-0.66AC+1.24BC-5.07A2-5.83B2-1.52C2，式中Y為鹽酸小檗堿轉(zhuǎn)移率，A、B、C分別為因素液料比、乙醇濃度、提取時間?；貧w模型方差分析結(jié)果見表7。

表7 BBD 試驗(yàn)結(jié)果方差分析

2.5.3 響應(yīng)面分析與最佳工藝確定 由表7可知，因素液料比（A）與乙醇濃度（B）對鹽酸小檗堿轉(zhuǎn)移率有顯著性影響，以液料比影響尤甚，影響程度大小依次為液料比＞乙醇濃度＞提取時間。為充分說明提取時間和液料比、提取時間和乙醇濃度、液料比和乙醇濃度交互作用對鹽酸小檗堿轉(zhuǎn)移率的影響，繪制響應(yīng)面圖和等高線，見圖2。響應(yīng)曲面較陡說明因素間交互作用顯著，由圖2可知，乙醇濃度與液料比對響應(yīng)值的交互作用最顯著。由Design expert 8.0.6軟件分析確定三顆針中鹽酸小檗堿閃式提取最佳因素取值為液料比為26.23 ml/g，乙醇濃度為71.60 %，提取時間為29.54 s，此條件下，鹽酸小檗堿的轉(zhuǎn)移率為96.88 %。為便于實(shí)驗(yàn)操作，將提取條件修正為液料比為25 ml/g，乙醇濃度為70 %，提取時間為30 s。

圖2 三維響應(yīng)面及等高線圖

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

為驗(yàn)證最佳閃式提取條件，取三顆針?biāo)幉?份，按最佳提取工藝提取鹽酸小檗堿，實(shí)際測得鹽酸小檗堿的轉(zhuǎn)移率為96.61 %，96.33 %，96.27 %，與預(yù)測值96.88 %的偏差為-0.78 %，-0.58 %，-0.64 %，表明該提取條件實(shí)測值與預(yù)測值差異很小[17]，說明最佳工藝模型準(zhǔn)確可靠。

3 討論

中藥成分提取的影響因素主要有溶劑、溫度、壓力、藥材粒度及液體的流動狀態(tài)，常用中藥提取方法有煎煮法、回流法、浸漬法、蒸餾法、滲漉法、連續(xù)回流法、破碎提取法等，但上述方法均不同程度地存在提取時間長，操作繁瑣，提取率低等缺點(diǎn)。隨著提取方法的不斷改善和發(fā)展，閃式提取因提取快速高效、經(jīng)濟(jì)節(jié)能、操作方便、適用廣泛、安全可靠等優(yōu)勢，得到廣泛應(yīng)用。

三顆針為小檗科植物，含小檗堿、小檗紅堿、小檗胺、藥根堿等化學(xué)成分，其主要成分鹽酸小檗堿具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效，用于治療細(xì)菌性痢疾、胃腸炎、副傷寒等，療效確切。因此本研究以鹽酸小檗堿的轉(zhuǎn)移率為指標(biāo)，分析閃式提取三顆針的最優(yōu)條件。

PBD相較于正交試驗(yàn)可實(shí)現(xiàn)以較少的實(shí)驗(yàn)次數(shù)快速準(zhǔn)確地找到顯著影響因素，減少工作量；最陡爬坡實(shí)驗(yàn)可快速逼近響應(yīng)值的最優(yōu)值區(qū)域；BBD-RSM彌補(bǔ)了正交試驗(yàn)和均勻設(shè)計等線性模型精密度低的不足，更好地揭示因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系，同時建立數(shù)據(jù)二項式模型，根據(jù)對回歸方程的分析來尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，被廣泛應(yīng)用于藥材提取優(yōu)化過程。

本試驗(yàn)利用Design expert 8.0.6軟件，采用閃式提取法，以三顆針?biāo)幉闹宣}酸小檗堿的轉(zhuǎn)移率為響應(yīng)值，首先通過Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計篩選出3個顯著性因素：液料比、提取時間和乙醇濃度；然后通過最陡爬坡實(shí)驗(yàn)，逼近響應(yīng)值的最優(yōu)區(qū)域，最后采用Box-Behnken設(shè)計-效應(yīng)面分析優(yōu)化得到最佳提取工藝為：液料比為25 ml/g，乙醇濃度為70 %，提取時間為30 s。并通過驗(yàn)證試驗(yàn)證明工藝快速可行且有效。