曹春歌，房凌云

（山東省菏澤市中醫(yī)醫(yī)院 中藥科，山東 菏澤 274000）

小兒咽扁顆粒是由金銀花、射干、金果欖、玄參、桔梗、麥冬、人工牛黃和冰片八味藥組成。方中金銀花、射干共為君藥，金銀花甘寒入肺，清熱解毒，主要活性成分為綠原酸、異綠原酸C和異綠原酸A[1-2]，射干宣散風(fēng)熱，祛痰利咽，主要活性成分為射干苷和次野鳶尾黃素異黃酮類成分[3]；金果欖性味苦寒，玄參苦咸微寒，桔梗開宣肺氣，麥冬養(yǎng)陰潤燥，四藥相配，共奏滋陰宣肺，合為臣藥，金果欖主要活性成分為二萜呋喃內(nèi)酯型化合物古倫賓，玄參主要活性成分為哈巴苷及哈巴俄苷[4-7]；人工牛黃、冰片醒神開竅，共為佐藥[8-9]。全方清熱利咽，解毒止痛，臨床用于小兒肺衛(wèi)熱盛所致的喉痹、乳蛾等癥[10]。

小兒咽扁顆粒現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《中國藥典》2020年版一部，僅采用高效液相色譜（HPLC）法對綠原酸進行含量測定，僅涉及君藥金銀花所含的單一成分，并不能整體反映小兒咽扁顆粒的內(nèi)在質(zhì)量。現(xiàn)有文獻[11-12]對小兒咽扁顆粒中的有效成分研究較少。本文采用HPLC對綠原酸、異綠原酸C、異綠原酸A、古倫賓、哈巴苷、哈巴俄苷、射干苷、次野鳶尾黃素8個指標(biāo)成分進行含量測定，并建立指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計量學(xué)全面分析小兒咽扁顆粒的質(zhì)量特性，為進一步的臨床研究提供理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀（DAD檢測器，美國安捷倫公司）；XS205型電子天平（d=0.01 mg，瑞士梅特勒托利公司）；KQ-500DBG型數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲波儀器有限公司）；QYSW-30A型超純水儀（美國Millipore公司）。

1.2 試藥

綠原酸（批號：110753-202018，純度：96.1 %），古倫賓（批號：111837-201703，純度：99.8 %），哈巴苷（批號：111729-201707，純度：96.8 %），哈巴俄苷（批號：111730-201709，純度：95.9 %），射干苷（批號：111632-202003，純度：98.7 %），次野鳶尾黃素（批號：111557-201703，純度：99.9 %，中國食品藥品檢定研究院）；異綠原酸C（批號：20201125），異綠原酸A（批號：20210117，四川省維克奇生物科技有限公司，含量均≥98.6 %），甲醇，乙腈均為色譜純（美國Merck公司），其他試劑均為分析純，水為超純水。

市售小兒咽扁顆粒共計3個生產(chǎn)廠家12個批次，見表1。

表1 小兒咽扁顆粒樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[13-15]

色譜柱為Waters XTERRA C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-0.3 % 磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～13 min，12 %A；13～27 min，12 %→45 %A；27～37 min，45 %→55 %A；37～50 min，55 %→78 %A）；檢測波長：220 nm（0～13 min，檢測哈巴苷；27～50 min，檢測古倫賓、哈巴俄苷、射干苷、次野鳶尾黃素）；326 nm（13～27 min，檢測綠原酸、異綠原酸C、異綠原酸A）；流速為1.0 ml/min；柱溫為35 ℃；進樣量為10 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液的制備 精密稱取綠原酸、異綠原酸C、異綠原酸A、古倫賓、哈巴苷、哈巴俄苷、射干苷、次野鳶尾黃素對照品各適量，加甲醇，超聲使溶解，配制成每1 ml含綠原酸399.5 μg、異綠原酸C 143.1 μg、異綠原酸A 140.6 μg、古倫賓72.72 μg、哈巴苷0.3561 mg、哈巴俄苷149.7 μg、射干苷71.64 μg、次野鳶尾黃素95.36 μg的混合對照品儲備液，精密量取對照品儲備液2 ml，置20 ml棕色量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，室溫避光保存，備用。

2.2.2 供試品溶液的制備 取小兒咽扁顆粒10袋，取內(nèi)容物，研磨均勻，精密稱取2.0 g，置50 ml棕色量瓶中，加入85 %甲醇約40 ml，室溫超聲處理（功率400 W，頻率40 kHz）45 min，放冷，用85 %甲醇定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對照溶液的制備 按小兒咽扁顆粒的制備工藝分別制備缺金銀花、射干、玄參和金果欖的陰性樣品，按2.2.2項下方法制備陰性對照溶液，即得。

2.3 HPLC指紋圖譜建立

2.3.1 精密度試驗 取小兒咽扁顆粒樣品（編號：S6），按2.2.2項下方法制成供試品溶液，連續(xù)進樣測定6次，以4號峰（綠原酸）為參照峰，測得其余16個共有峰相對保留時間及相對峰面積RSD（n=6）均分別小于0.97 %和1.64 %，表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗 取同一份小兒咽扁顆粒（編號：S6）供試品溶液，分別于0，5，10，15，20，24，36 h，按2.1項色譜條件進樣測定，以4號峰（綠原酸）為參照峰，測得其余16個共有峰相對保留時間及相對峰面積RSD（n=7）分別小于1.03 %和2.16 %，表明小兒咽扁顆粒供試品溶液36 h內(nèi)穩(wěn)定。2.3.3 重復(fù)性試驗 取小兒咽扁顆粒樣品（編號：S6）6份，分別按2.2.2項下方法制成供試品溶液，按2.1項色譜條件進樣測定，以4號峰（綠原酸）為參照峰，測得其余16個共有峰相對保留時間及相對峰面積RSD（n=6）分別小于1.49 %和2.79 %，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.4 指紋圖譜的建立及相似度評價 取12批小兒咽扁顆粒樣品各適量，按2.2.2項下方法制成供試品溶液，依法進樣測定，將色譜圖數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012A版），以編號S6色譜圖為參考圖譜，時間窗寬度設(shè)為0.1 min，多點校正生成對照指紋圖譜，色譜圖見圖1。共標(biāo)示出17個共有峰，其中4號峰（綠原酸）色譜峰響應(yīng)值最大，穩(wěn)定性好，故選擇4號峰（綠原酸）作為參照峰（S），計算12批小兒咽扁顆粒樣品的指紋圖譜相似度分別為0.990，0.991，0.988，0.987，0.992，0.984，0.993，0.985，0.996，0.995，0.986，0.997，均大于0.95，表明小兒咽扁顆粒質(zhì)量總體較穩(wěn)定。

圖1 12批小兒咽扁顆粒HPLC指紋圖譜（S1～S12）和對照指紋圖譜（R）

2.3.5 主要特征峰歸屬 精密吸取2.2.1項下8個成分對照品溶液，依法進樣測定，記錄色譜圖，與指紋圖譜各主要共有峰進行對比，確認其中8個色譜峰，分別為2號峰哈巴苷、4號峰綠原酸、7號峰異綠原酸C、10號峰異綠原酸A、12號峰射干苷、15號峰古倫賓、16號峰次野鳶尾黃素和17號峰哈巴俄苷。

2.4 多指標(biāo)成分含量測定

2.4.1 系統(tǒng)適用性試驗 分別精密吸取2.2項下混合對照品溶液、供試品溶液和各陰性供試品溶液各10 μl，按2.1項下色譜條件參數(shù)，結(jié)果各待測成分分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)以綠原酸峰計大于5500。陰性供試品溶液中的其他成分對8種有效成分的測定無干擾，說明該色譜系統(tǒng)專屬性較好。色譜圖見圖2。

圖2 HPLC圖譜

2.4.2 線性關(guān)系考察 分別精密吸取2.2.1項下混合對照品儲備液1.0，3.0，5.0，6.0，7.0，9.0 ml，置于同一50 ml量瓶中，加甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，得系列混合對照品溶液，精密吸取上述系列混合對照品溶液，按2.1項下色譜條件進樣，記錄色譜圖。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X，μg/ml），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進行線性回歸，繪制各組分標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。結(jié)果表明：綠原酸、異綠原酸C、異綠原酸A、古倫賓、哈巴苷、哈巴俄苷、射干苷及次野鳶尾黃素在試驗范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。將對照品溶液逐級稀釋后，以信噪比（S/N）約為10.0時的濃度為各成分的定量限（LOQ）。結(jié)果見表2。

表2 線性關(guān)系考察結(jié)果

2.4.3 精密度試驗 精密吸取2.2.1項下混合對照品溶液，按2.1項下色譜條件，連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。結(jié)果：綠原酸、異綠原酸C、異綠原酸A、古倫賓、哈巴苷、哈巴俄苷、射干苷、次野鳶尾黃素峰面積的RSD分別0.54 %，0.73 %，0.79 %，0.84 %，0.66 %，0.62 %，0.89 %，0.91 %（n=6），表明儀器精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品（S6）溶液，分別于制備后0，5，10，15，20，24 h，按2.1項下色譜條件進樣測定。結(jié)果：綠原酸、異綠原酸C、異綠原酸A、古倫賓、哈巴苷、哈巴俄苷、射干苷、次野鳶尾黃素峰面積的RSD（n=6）分別為0.77 %，0.89 %，0.91 %，1.03 %，0.95 %，1.11 %，0.97 %，0.84 %（n=6），表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 重復(fù)性試驗 取同一批小兒咽扁顆粒樣品（S6），按2.2.2項下方法制備供試品溶液，共6份，按2.1項下色譜條件進樣測定，計算小兒咽扁顆粒中8個成分含量及其RSD值。結(jié)果：綠原酸、異綠原酸C、異綠原酸A、古倫賓、哈巴苷、哈巴俄苷、射干苷、次野鳶尾黃素含量的平均值分別為0.2853，0.1022，0.1004，0.0606，0.1069，0.0618，0.0597，0.0745 mg/g，RSD（n=6）分別0.93 %，1.04 %，1.07 %，1.12 %，0.85 %，0.88 %，0.95 %，1.19 %（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.4.6 加樣回收試驗 取同一批（S6）小兒咽扁顆粒6份，每份1.0 g，精密稱定，分別加入2.2.1項下混合對照品儲備液1.0 ml，按2.2.2項下方法處理，再按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，計算各成分加樣回收率及其RSD值，結(jié)果見表3。

表3 （續(xù)）

表3 8個成分的加樣回收試驗結(jié)果（n=6）

2.4.7 樣品測定 取小兒咽扁顆粒12批，按2.2.2項下方法，平行制備3份供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄綠原酸、異綠原酸C、異綠原酸A、古倫賓、哈巴苷、哈巴俄苷、射干苷、次野鳶尾黃素的峰面積，采用外標(biāo)法計算小兒咽扁顆粒中上述8個成分含量。結(jié)果見表4。

表4 小兒咽扁顆粒中8個成分含量測定結(jié)果（n=3）

2.5 化學(xué)模式識別分析

2.5.1 聚類分析 以12批小兒咽扁顆粒8個成分含量測定結(jié)果為變量，運用SPSS 26.0軟件，采用“組間連接”，“平方歐式距離”進行聚類分析[16]。根據(jù)聚類分析樹狀圖（圖3），當(dāng)類間距離為10時，12批樣品可分為2大類，一家企業(yè)（貴州神奇制藥）聚為一類，另外兩家企業(yè)（四川禾邦陽光制藥和陜西盤龍制藥）聚為一類，當(dāng)類間距離為5時，12批樣品又各自聚為一類，可分成3類。說明同一廠家不同批次的產(chǎn)品具有較高相似度，但不同廠家的樣品具有差異性。

圖3 12批小兒咽扁顆粒聚類分析樹狀圖

2.5.2 正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA） 為更具體地研究造成不同廠家不同批次小兒咽扁顆粒組間差異的化學(xué)成分，將12批小兒咽扁顆粒的17個共有峰的峰面積導(dǎo)入SIMCA-P 14.1軟件，啟動OPLS-DA分析程序并建立有監(jiān)督模式的OPLSDA模型[17]，見圖4。由圖4可見，12批小兒咽扁顆粒的分類情況與上述聚類分析一致，且模型的預(yù)測能力和穩(wěn)定性都較高（Q2=0.947，R2Y=0.899，R2X=0.856），說明所建立的OPLS-DA模型可判別不同廠家的小兒咽扁顆粒。同時用OPLS-DA中變量重要性投影值（VIP）篩選差異性質(zhì)量標(biāo)志物，在95 %的置信區(qū)間內(nèi)且VIP大于1，說明該變量對整體模型的貢獻度高于平均水平，對產(chǎn)品質(zhì)量影響具有統(tǒng)計學(xué)意義，可能為小兒咽扁顆粒的差異性質(zhì)量標(biāo)志物。由圖5可知，區(qū)分小兒咽扁顆粒的質(zhì)量差異標(biāo)志物可能是綠原酸、古倫賓、射干苷和次野鳶尾黃素（這4種成分VIP＞1）。生產(chǎn)企業(yè)在質(zhì)量監(jiān)控過程中可重點關(guān)注這4個成分的含量變化，科學(xué)合理地提高該制劑穩(wěn)定性。

圖4 12批小兒咽扁顆粒的OPLS-DA分析得分圖

圖5 小兒咽扁顆粒的變量載荷評價參數(shù)（VIP）

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

采用DAD檢測器在190～400 nm波長范圍內(nèi)對小兒咽扁顆粒中8個化合物進行了掃描，結(jié)果綠原酸、異綠原酸C、異綠原酸A在326 nm處有最大吸收；古倫賓、哈巴苷、哈巴俄苷、射干苷、次野鳶尾黃素在220 nm處有最大吸收，故選用分段切換波長法檢測。在流動相的選擇中，分別考察了甲醇、乙腈作為有機相，水、不同比例磷酸溶液（0.1 %，0.3 %，0.5 %），冰醋酸溶液（0.1 %，0.3 %，0.5 %）作為水相的多種流動相系統(tǒng)，結(jié)果以乙腈-0.3 %磷酸水溶液溶液為流動相，綠原酸、異綠原酸C、異綠原酸A、古倫賓、哈巴苷、哈巴俄苷、射干苷、次野鳶尾黃素8個成分的色譜峰峰形及分離度較好。

3.2 耐用性考察

本研究考察了不同色譜柱[Waters XTERRA C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、SHIMADZU VP-ODS（250 mm×4.6mm，5μm）及Thermo Hypersil Gold C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）]，不同流速（0.8，1.0，1.2 ml/min），不同柱溫（25，30，35 ℃）等對小兒咽扁顆粒中8個成分含量測定結(jié)果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些色譜條件的變化對各成分含量測定結(jié)果影響不大，說明本方法具有較好的耐受性。

3.3 結(jié)果分析

12批小兒咽扁顆粒指紋圖譜相似度大于0.95，表明小兒咽扁顆粒化學(xué)成分一致性較好；含量測定結(jié)果表明不同生產(chǎn)企業(yè)產(chǎn)品中8個指標(biāo)成分的含量存在一定差異，編號S1～S3的小兒咽扁顆粒（生產(chǎn)年份為2019年）中8個成分的含量普遍偏低，可能與樣品生產(chǎn)時間較長有關(guān)；正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）得出綠原酸、古倫賓、射干苷和次野鳶尾黃素可能是小兒咽扁顆粒的質(zhì)量差異標(biāo)志物，建議企業(yè)加強對金銀花、金果欖和射干藥材的監(jiān)控，參照《中國藥典》2020年版規(guī)定的限量值制定內(nèi)控指標(biāo)，從藥材源頭和制劑生產(chǎn)過程中把控產(chǎn)品質(zhì)量，以達到臨床用藥的穩(wěn)定。

4 結(jié)論

本研究建立了一種可同時測定小兒咽扁顆粒中綠原酸、異綠原酸C、異綠原酸A、古倫賓、哈巴苷、哈巴俄苷、射干苷、次野鳶尾黃素8個化學(xué)成分的HPLC法，方法準(zhǔn)確穩(wěn)定、操作簡便、重復(fù)性高，可用于小兒咽扁顆粒的質(zhì)量控制，并結(jié)合化學(xué)計量學(xué)分析進行綜合質(zhì)量評價，為完善其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供實驗依據(jù)。