孔文茹，李菲菲，尤鈺琳，王智璠，紀建波

（山東大學 藥學院，山東 濟南 250012）

姜黃（Curcumae Longae Rhizoma）是姜科植物姜黃（Curcuma longa L.）的干燥根莖，歷版《中國藥典》均收載其為常用中藥，具有破血行氣，通經(jīng)止痛等功效，用于胸脅刺痛，胸痹心痛，痛經(jīng)經(jīng)閉，癥瘕，風濕肩臂疼痛，跌撲腫痛[1]。姜黃主要含揮發(fā)油類和姜黃素類，在中藥中屬活血藥?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)姜黃及其主要有效成分姜黃素（curcumin）具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、保護肝臟等多種藥理活性[2]。因其具有低毒、副作用少等優(yōu)點，常被用作一種天然的食品添加劑。

有研究報道，姜黃素能減輕四氯化碳誘導的肝損傷[3]；姜黃素還可通過調(diào)節(jié)線粒體功能障礙和抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激減輕小鼠慢性酒精性肝損傷[4]，通過顯著降低乙醇誘導的天門冬氨酸轉氨酶和堿性磷酸酶水平對肝臟產(chǎn)生保護作用[5]。目前，很多醒酒飲料中加入了姜黃素，以減輕酒精對肝臟的損傷。

迄今已有許多方法用于姜黃中姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素的定性和定量分析，比如高效液相色譜法（HPLC）[6-7]、毛細管電泳法[8-10]、超臨界流體色譜[11]、液相-質(zhì)譜聯(lián)用法[12]、薄層色譜法[13]等。HPLC因分離效果好，靈敏度高，選擇性好，重現(xiàn)性高，常用于姜黃素類化合物的含量測定。

本研究建立了HPLC定量分析醒酒飲料中姜黃素的方法，成功應用于市場中含姜黃素的醒酒飲料中姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素的含量測定。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀（安捷倫公司，包括G1311B四元梯度泵，G1367E自動進樣器，G1316A柱溫箱，G4212B二極管陣列檢測器，Agilent色譜工作站）；Mettler AG135十萬分之一電子分析天平（瑞士梅特勒公司）；KQ5200DE數(shù)控超聲清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

市售姜黃醒酒飲料（編號：JH-1～JH-5）；姜黃素對照品（批號：C12348612，含量：98 %，上海麥克林生化科技有限公司）；去甲氧基姜黃素對照品（批號： RP210303，含量：99.51 %，成都麥德生科技有限公司）；雙去甲氧基姜黃素對照品（批號：F2122080，含量：98 %，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；甲醇，乙腈（色譜純，美國Fisher公司）；甲酸（色譜純，美國Mreda公司），水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液 精密稱取姜黃素對照品10.11 mg、去甲氧基姜黃素對照品9.91 mg、雙去甲氧基姜黃素對照品10.01 mg，置于10 ml量瓶中，分別加甲醇定容至刻度，配制成濃度為1 mg/ml的姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素對照品儲備液。

2.1.2 供試品溶液 精密吸取醒酒飲料2 ml于10 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，超聲提取30 min，冷至室溫，取上清，經(jīng)0.22 μm有機系濾膜過濾，即得供試品溶液。

2.2 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm），連接C18保護柱（4.0 mm×3.0 mm，5 μm，Phenomenex）；流動相：乙腈（A），0.04 %甲酸水溶液（B），按表1梯度洗脫；流速：1.0 ml/min；柱溫：25 ℃；檢測波長為425 nm；進樣量：5 μl。

表1 梯度洗脫程序

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

精密吸取混合對照品溶液和供試品溶液各5 μl，分別注入高效液相色譜儀，按2.2項下色譜條件測定。結果供試品溶液中姜黃素、去甲氧基姜黃素及雙去甲氧基姜黃素在對照品色譜峰相應位置有色譜峰流出，表明方法專屬性良好。色譜圖見圖1。

圖1 對照品（A）和樣品（B）的HPLC圖譜

2.4 方法學驗證

2.4.1 線性關系考察 精密吸取姜黃素、去甲氧基姜黃素及雙去甲氧基姜黃素對照品溶液各適量，加入甲醇，配制成濃度為250 μg/ml的混合對照品溶液，逐級稀釋，配制成濃度為125，62.5，31.25，15.63，7.81，3.91，1.95，0.98 μg/ml的混合對照品溶液。其中姜黃素的線性實驗采用濃度為250，125，62.5，31.25，15.63，7.81，3.91，1.95 μg/ml的混合對照品溶液，去甲氧基姜黃素和雙去甲氧基姜黃素的線性實驗采用濃度為125，62.5，31.25，15.63，7.81，3.91，1.95，0.98 μg/ml的混合對照品溶液。按2.2項下色譜條件分別進樣5 μl，測定峰面積。以對照品濃度（μg/ml）為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，得到姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素的回歸方程、相關系數(shù)和線性范圍，見表2。結果表明，姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素在各自的線性范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關系。

表2 線性考察結果

2.4.2 精密度試驗 按2.1.2項下方法制備供試品溶液，按2.2項下色譜條件，連續(xù)進樣6次，測得姜黃素、去甲基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素峰面積的RSD值分別為0.34 %，0.37 %，1.03 %，表明該方法精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 按2.1.2項下方法制備供試品溶液，分別在0，2，6，12，20，30 h按2.2項下色譜條件進樣，測定峰面積，測得姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素峰面積的RSD值分別為0.23 %，0.32 %，0.44 %，表明供試品溶液在該條件下30 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復性試驗 精密吸取姜黃醒酒飲料6份，每份2 ml，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，按2.2項下色譜條件進樣，測定峰面積，測得姜黃素、去甲氧基姜黃素及雙去甲氧基姜黃素的平均含量為19.71，2.65，0.28 mg，RSD值分別為0.83 %，0.90 %，0.67 %，表明該方法重復性良好。

2.4.5 檢測限和定量限 取2.1.1項下混合對照品溶液適量，用甲醇溶液逐級稀釋后進樣分析，測得姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素的檢測限（S/N=3）分別為0.48，0.24，0.24 μg，定量限（S/N=10）分別為0.98，0.48，0.48 μg。

2.4.6 回收率試驗 取已知含量（姜黃素386.1 μg/ml、去甲氧基姜黃素51.8 μg/ml、雙去甲氧基姜黃素5.4 μg/ml）的姜黃醒酒飲料3份，每份2 ml，分別置于10 ml量瓶中，再分別加入1 mg/ml的對照品溶液適量，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，按2.2項下色譜條件進樣，測定含量，計算回收率，結果姜黃素、去甲氧基姜黃素及雙去甲氧基姜黃素的平均加樣回收率為92.67 %～106.77 %，RSD為1.10 %～2.65 %。表明該方法準確性良好，結果見表3。

表3 回收率試驗結果（n=3）

2.4.7 樣品含量測定 分別吸取不同品牌的姜黃醒酒飲料2 ml，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，按擬定的含量測定方法測定樣品中姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素的含量。結果見表4。

表4 不同品牌姜黃醒酒飲料中3種姜黃素的含量測定結果（n=3）

3 結論

本研究建立了HPLC測定不同品牌姜黃醒酒飲料中姜黃素、去甲氧基姜黃素和雙去甲氧基姜黃素含量的方法，該方法準確、靈敏。通過不同品牌的姜黃醒酒飲料的含量測定結果可看出，姜黃醒酒飲料中姜黃素的添加量最多，雙去甲氧基姜黃素的添加量很少甚至沒有。