陳詩麗，閔 可，楊 蓉，羅 瑋，謝小玉，陳 波，馬 銘

(湖南師范大學化學生物學及中藥分析教育部重點實驗室，植化單體開發(fā)與利用湖南省重點實驗室，中國 長沙 410081)

黃精中薯蕷皂苷元含量的測定方法主要有紫外分光光度法(UV)[6]、高效液相色譜-紫外檢測法(HPLC-UV)[7]和超高效液相色譜-紫外檢測法(UPLC-UV)[8]。紫外分光光度法雖然操作簡單，但分析復(fù)雜體系時，分析物易受共存物的干擾。由于薯蕷皂苷元沒有發(fā)色團，紫外吸收較弱，且紫外吸收波長主要在低波長區(qū)域，因此通過UPLC/HPLC-UV法檢測時靈敏度較低。此外，當采用HPLC-UV或UPLC-UV法對薯蕷皂苷元進行定量時，均需要繁瑣的樣品預(yù)處理過程和耗時的色譜分離過程，不適用于高通量分析。因此，迫切需要建立一種高效、靈敏、快速和簡單易操作的黃精中薯蕷皂苷元的檢測方法。

敞開式質(zhì)譜是一種可以在常壓下直接分析樣品或樣品表面的技術(shù)，具有快速、靈敏、實時、高通量，以及適用于復(fù)雜樣品分析的特點，已被用于食品檢測[9]和臨床檢驗[10，11]。解吸附電暈束電離質(zhì)譜法(DCBI-MS)是一種新型的敞開式質(zhì)譜分析技術(shù)，樣品無需前處理，分析過程僅需十幾秒，可直接分析固體、液體和粉末樣品[12]等。與其他敞開式質(zhì)譜技術(shù)相比，DCBI源可以產(chǎn)生可見的紫色電暈束，有利于樣品的原位分析和質(zhì)譜成像[13]。Min等人[14]使用DCBI-MS/MS法快速原位高通量分析了口罩中的鄰苯二甲酸酯。此外，DCBI-MS法已被廣泛應(yīng)用于食品安全、包裝材料和有機農(nóng)藥分析等領(lǐng)域[15,16]。

本研究建立了DCBI-MS法測定中藥黃精中的薯蕷皂苷元的方法，根據(jù)質(zhì)譜準分子離子峰和碎片離子對薯蕷皂苷元進行快速識別，并對其裂解規(guī)律進行探究。

1 儀器與材料

1.1 儀器

FW-80高速萬能粉碎機(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)、AP135W電子天平(日本島津公司)、MTN-2800D氮吹濃縮裝置(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)、J03-0.2A精密手動壓力機(上海申康機床有限公司)、F-030SD超聲波清洗機(深圳福洋科技集團有限公司)、DCBI-1電離源(日本島津公司)、LCMS-8040質(zhì)譜儀(日本島津公司)和HPLC-8050高效液相色譜儀(日本島津公司)。

1.2 材料

甲醇、乙腈和二氯甲烷(均為色譜級)購自北京伊諾凱科技有限公司(中國，北京)。實驗用水使用超純水系統(tǒng)(Millipore，美國)制得。薯蕷皂苷元標準品(批號：Z10S11B124158)購自上海源葉生物科技有限公司(中國，上海)。甲睪酮標準品(內(nèi)標)購自薩恩化學科技有限公司(中國，上海)。黃精藥材購買途徑來自湖南長沙市各大藥房及電商中藥材店鋪，信息如表1所示。黃精藥材經(jīng)湖南師范大學醫(yī)學院鄒輝副教授鑒定為黃精Polygonatirhizoma的干燥根莖。

表1 黃精樣品信息

2 方法

2.1 DCBI-MS工作原理與條件

圖1 DCBI-MS原理示意圖

使用DCBI-1電離源與LCMS-8040質(zhì)譜儀結(jié)合，在選擇離子監(jiān)測(SIM)的正離子模式下工作。DCBI-MS的原理圖如圖1所示。高壓氦氣經(jīng)過控制加熱套管加熱后，經(jīng)空心針電極(工作電極)射出，在工作電極和環(huán)形電極(也稱為對電極)形成的強電場作用下，被激發(fā)電離形成等離子體[17]。等離子體伴隨氣流流出DCBI源探頭產(chǎn)生可見的紫色電暈束。將樣品溶液滴加在制備好的三角形紙基上，樣品被電暈束照射后，分析物被解吸附，經(jīng)過一系列電離反應(yīng)，形成帶電離子進入質(zhì)譜錐孔被檢測。氦氣(He)流量為1.0 L·min-1，電壓設(shè)定為1.8 kV，解吸附溫度為320 ℃。MS界面由LabSolutions工作站控制，條件為：脫溶劑(DL)溫度為250 ℃；加熱塊溫度為350 ℃；霧化氣流量為0.5 L·min-1。

2.2 HPLC-UV條件

色譜分離采用Diamonsil C18(2)色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流動相為水(A)-乙腈(B)，等度洗脫條件為V(乙腈)∶V(水)=94∶6，總流速設(shè)置為1.0 mL·min-1，檢測波長為210 nm，進樣體積為20 μL，單次色譜分析總時間為30 min。

2.3 溶液的制備

2.3.1 對照品溶液的制備 準確稱取2.0 mg薯蕷皂苷元標準品于燒杯中，加入甲醇溶解，轉(zhuǎn)至50 mL容量瓶中，定容，得到40 mg·L-1薯蕷皂苷元對照品儲備液。內(nèi)標甲睪酮對照品儲備液(40 mg·L-1)的配制方法同上。薯蕷皂苷元對照品儲備液用甲醇稀釋至10 mg·L-1作為工作溶液，用于優(yōu)化DCBI-MS的分析參數(shù)。

漫長的暴風驟雨之后，被男人浸潤透了的伍亦苒滿足而又嗔怪地說，怕了你了，像一個饑餓的孩子，房間都訂好了，卻還要在這里。

2.3.2 供試品溶液的制備 中藥黃精藥材用高速萬能粉碎機粉碎成粉末，過0.45 mm篩。稱取0.4 g黃精粉末于離心管中，加入2.00 mL二氯甲烷，靜置20 min，在常溫下超聲40 min，得黃精提取液。對黃精提取液進行兩種方式處理：(1)取100 μL黃精提取液，加入甲睪酮內(nèi)標，用甲醇稀釋至溶液總體積為300 μL，得到含內(nèi)標濃度為2 mg·L-1的供試品溶液，用于DCBI-MS分析。(2)另取1.00 mL黃精提取液，氮吹至干，加入等體積的甲醇復(fù)溶，經(jīng)0.22 μm尼龍膜過濾，得到用于HPLC分析的供試品溶液。

3 結(jié)果與討論

3.1 三角形紙基上樣方向的考察

DCBI-MS上樣使用的三角形紙基是通過定制的精密手動壓力機從色譜紙上裁剪下來的，三角紙的頂角角度為30°，底邊寬7 mm，高為13 mm。將待測樣品溶液滴在三角形紙基上，筆者考察了三角形紙基底邊對著質(zhì)譜錐孔和三角形紙基尖端對著質(zhì)譜錐孔兩種上樣方式對分析物薯蕷皂苷元質(zhì)譜峰面積響應(yīng)的影響，結(jié)果如圖2。由圖2可知，當三角形紙基尖端對著質(zhì)譜錐孔時(圖2a)，在全掃譜圖中背景較復(fù)雜，監(jiān)測不到薯蕷皂苷元的準分子離子[MDiosgenin+H]+(m/z415.3)峰。而當三角形紙基底邊對著質(zhì)譜錐孔時(圖2b)，背景較為干凈，質(zhì)譜圖中出現(xiàn)明顯的薯蕷皂苷元的準分子離子峰[MDiosgenin+H]+(m/z415.3)，薯蕷皂苷元的質(zhì)譜響應(yīng)強度得到了明顯提高。推測可能的原因是當三角形紙基底邊對著質(zhì)譜錐孔時，電暈束作用于紙基的表面積更大，有利于更多樣品分子進行解吸附和電離。因此，后續(xù)采用三角形紙基底邊對著質(zhì)譜錐孔的上樣方式開展研究。

圖2 上樣方式對薯蕷皂苷元質(zhì)譜響應(yīng)強度的影響(a)三角紙尖端對著質(zhì)譜錐孔；(b)三角紙底邊對著質(zhì)譜錐孔

3.2 DCBI-MS條件優(yōu)化

3.2.1 掃描模式的選擇 利用質(zhì)譜進行定量時，可選擇的掃描模式有選擇離子監(jiān)測模式(SIM)和多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)。SIM模式指的是監(jiān)測薯蕷皂苷元質(zhì)譜產(chǎn)生的準分子離子[MDiosgenin+H]+的響應(yīng)強度。MRM模式指的是監(jiān)測薯蕷皂苷元的一對離子對的響應(yīng)強度(母離子m/z415.3，子離子m/z217.2)。比較兩種模式下目標峰的響應(yīng)強度，結(jié)果如圖3。由圖3可知，SIM模式下的薯蕷皂苷元的響應(yīng)強度明顯大于MRM模式。此外，SIM模式比MRM模式更簡單，不需要離子碰撞誘導(dǎo)解離過程。因此，后續(xù)研究均選擇SIM模式進行檢測。

圖3 掃描模式對薯蕷皂苷元質(zhì)譜響應(yīng)強度的影響

3.2.2 上樣體積的影響 在DCBI-MS分析中，樣品的上樣體積與定量準確性直接相關(guān)。一般而言，上樣體積與熱解吸附出的目標分子總量呈正相關(guān)，而與樣品的解吸附速度呈負相關(guān)，這是由于隨著上樣體積的增大，上樣分析物的物質(zhì)的量增加，有利于增大分析物的質(zhì)譜峰面積；但上樣體積過大，會降低熱傳導(dǎo)效率，反而會影響分析物的解吸附及離子化，從而降低分析物的質(zhì)譜峰面積[18]。筆者考察了薯蕷皂苷元上樣體積依次為3，5，10，15，20和25 μL時，薯蕷皂苷元質(zhì)譜峰面積的變化情況，結(jié)果如圖4a。圖4a表明，上樣體積從3 μL增大至20 μL時，分析物的質(zhì)譜峰面積呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢，但當上樣體積超過20 μL時，分析物的質(zhì)譜峰面積反而下降，此時，可觀察到樣品溶液在三角紙上出現(xiàn)輕微溢出現(xiàn)象，說明樣品過載造成了部分樣品損失。同時，由于上樣體積過大，降低了熱傳導(dǎo)效率，這兩個因素共同作用，使得分析物的質(zhì)譜峰面積出現(xiàn)了顯著降低。因此，在后續(xù)的研究中，選擇上樣體積為20 μL。

3.2.3 解吸附溫度的影響 DCBI源的電離過程可以分為兩步：第一步是樣品由凝聚態(tài)解吸附成為氣相狀態(tài)；第二步是離子化過程[17]。解吸附溫度的升高可以提高解吸附效率，但解吸附溫度過高也可能導(dǎo)致分析物分解而造成損失。因此，解吸附溫度的選擇在DCBI-MS檢測中起著至關(guān)重要的作用。筆者考察了解吸附溫度分別為120，160，200，240，280，320和350 ℃時對薯蕷皂苷元質(zhì)譜峰面積的影響，結(jié)果如圖4b。圖4b顯示，解吸附溫度較低時，無法觀察到薯蕷皂苷元的質(zhì)譜信號。解吸附溫度從160 ℃逐漸增加到320 ℃時，薯蕷皂苷元的質(zhì)譜峰面積隨著解吸附溫度的升高而增加。當解吸附溫度超過320 ℃時，薯蕷皂苷元的質(zhì)譜峰面積反而呈現(xiàn)出了下降的趨勢，這可能是由于解吸附溫度過高時，薯蕷皂苷元部分分解所致。因此，DCBI源的解吸附溫度選擇為320 ℃。

圖4 上樣體積(a)和解吸附溫度(b)對薯蕷皂苷元質(zhì)譜峰面積的影響

3.2.4 放電電壓的影響 相較于其他敞開式質(zhì)譜，DCBI源的獨特優(yōu)勢就在于其擁有一束可見的紫色電暈束，這有利于對樣品進行原位分析，進而提高進樣位置的定位準確率和質(zhì)譜成像。為了在保持足夠強度的同時獲得相對穩(wěn)定明亮的電暈束，對放電電壓進行優(yōu)化是非常必要的。本文考察了放電電壓分別為1.5,1.6,1.7,1.8和1.9 kV時，對薯蕷皂苷元質(zhì)譜峰面積的影響，結(jié)果如圖5所示。圖5說明，當放電電壓從1.5 kV增加到1.8 kV時，分析物的質(zhì)譜峰面積逐漸增加，同時肉眼觀察到電暈束的顏色逐漸加深。當放電電壓高于1.8 kV時，薯蕷皂苷元質(zhì)譜峰面積降低。因此，后續(xù)實驗選取1.8 kV的放電電壓。

3.3 DCBI-MS方法學考察

3.3.1 線性相關(guān)性考察 取薯蕷皂苷元對照品儲備液，甲醇稀釋至質(zhì)量濃度依次為0.5，3，6，8和10 mg·L-1的一系列標準溶液，不同濃度的標準溶液均含有2 mg·L-1甲睪酮內(nèi)標溶液。以薯蕷皂苷元濃度為橫坐標(X)，薯蕷皂苷元與甲睪酮的質(zhì)譜峰面積的比值為縱坐標(Y)，繪制標準曲線(如圖6所示)，進行線性回歸，結(jié)果顯示，薯蕷皂苷元在0.5～10 mg·L-1時，薯蕷皂苷元與甲睪酮的質(zhì)譜峰面積的比值與薯蕷皂苷元的質(zhì)量濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為：Y=0.285 9X+0.047 0，線性相關(guān)系數(shù)R2為0.999 3。

圖5 放電電壓對薯蕷皂苷元質(zhì)譜峰面積的影響

圖6 DCBI-MS法測定薯蕷皂苷元校準曲線

3.3.2 精密度、檢出限和定量限考察 取10 mg·L-1薯蕷皂苷元工作溶液(含有2 mg·L-1甲睪酮內(nèi)標)，采用DCBI-MS法連續(xù)測定3次，記錄薯蕷皂苷元準分子離子峰的峰面積與內(nèi)標峰面積的比值，計算質(zhì)譜峰面積比值的相對標準偏差(RSD)，得到RSD值均為15%，表明儀器精密度良好。檢出限(LOD)和定量限(LOQ)分別在信噪比S/N=3和10時測定，連續(xù)測定5次，薯蕷皂苷元的LOQ值為0.4 mg·L-1，LOD值為0.1 mg·L-1，表明DCBI-MS法對薯蕷皂苷元有較好的靈敏度。

3.3.3 加標回收率試驗 為了驗證DCBI-MS法定量檢測黃精中薯蕷皂苷元的準確性，須進行加標回收試驗。在3份黃精粉末樣品(各0.4 g)中分別加入低、中、高濃度水平(即30.0, 75.0和120.0 μg·g-1)的標準溶液，按照“供試品溶液的制備”方法制備加標樣品供試品溶液，進行DCBI-MS分析，平行分析5次，測得的加標回收率結(jié)果列于表2。由表2可知，加標回收率范圍為90.0%～106.8%，表明建立的方法具有良好的準確度。

表2 DCBI-MS法的加標回收率

3.4 方法對比

圖7 薯蕷皂苷元對照品溶液與黃精提取物的HPLC圖譜

3.4.1 HPLC-UV方法的建立 采用HPLC-UV法對制備得到的黃精提取液進行分析，薯蕷皂苷元工作溶液(10 mg·L-1)與實際樣品黃精提取物的HPLC圖譜如圖7。圖7顯示，薯蕷皂苷元對照品與實際樣品黃精提取物在相同保留時間25.6 min出現(xiàn)了薯蕷皂苷元的特征色譜峰。

用甲醇將薯蕷皂苷元對照品儲備液分別稀釋至1, 5, 10, 20和30 mg·L-1的系列標準溶液，以薯蕷皂苷元質(zhì)量濃度為橫坐標(X)，薯蕷皂苷元的色譜峰面積為縱坐標(Y)，得HPLC-UV法線性回歸方程，結(jié)果表明，薯蕷皂苷元在1～40 mg·L-1時，薯蕷皂苷元色譜峰面積與質(zhì)量濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為：Y=5 440.8X-1 161.61，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 9。

3.4.2 DCBI-MS法和HPLC-UV法測定結(jié)果對比 在本研究中，為了評估DCBI-MS法定量測定黃精中薯蕷皂苷元的準確性，將DCBI-MS法測定的結(jié)果與HPLC-UV法測定的結(jié)果進行了對比，結(jié)果見表3。

表3 DCBI-MS和HPLC-UV法測定8批黃精樣品中薯蕷皂苷元的結(jié)果比對 單位：μg·g-1

表3顯示，測定的8批次不同產(chǎn)地的黃精藥材樣品中薯蕷皂苷元的含量為14.3～32.4 μg·g-1。對兩種方法的結(jié)果進行t檢驗，顯示兩組數(shù)據(jù)之間不存在顯著性差異(P>0.05)。值得注意的是，DCBI-MS法進行樣品測定時，由于樣品基質(zhì)復(fù)雜，樣品測定結(jié)果的RSD略高于標準溶液測定結(jié)果的RSD，但樣品測定結(jié)果的RSD均在20%以內(nèi)，符合敞開式質(zhì)譜的要求，說明DCBI-MS法的測定結(jié)果準確可信。從表3可以發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地黃精的薯蕷皂苷元含量有差異，這可能與黃精種植的土壤、氣候和環(huán)境等有關(guān)。與DCBI-MS法相比，HPLC-UV法需要消耗大量有機流動相，單個樣品的分析時長需要30 min。此外，繁瑣的前處理過程以及流動相制備過程也需要耗費大量時間。而DCBI-MS法不需要復(fù)雜的預(yù)處理，樣品制備完畢即可上樣分析，大大減少了有機流動相的使用，并且20 s內(nèi)即可分析一個樣品，節(jié)約了樣品分析的時間，具有快速、高效、省時和省溶劑的優(yōu)勢。

3.5 薯蕷皂苷元的裂解規(guī)律

將DCBI源與三重四極桿質(zhì)譜串聯(lián)，利用二級質(zhì)譜獲得的特征離子對薯蕷皂苷元的裂解規(guī)律進行探究。首先，在優(yōu)化后的最佳分析條件下，正離子模式下得到薯蕷皂苷元的準分子離子峰[MDiosgenin+ H]+(m/z415.3)，然后通過碰撞誘導(dǎo)解離(CID)將[MDiosgenin+ H]+離子打碎，得到典型二級質(zhì)譜圖如圖8。

圖8 薯蕷皂苷元的典型DCBI-MS/MS譜圖

從圖8可以看出，薯蕷皂苷元的母離子[MDiosgenin+H]+經(jīng)打碎后主要產(chǎn)生m/z397.3，m/z271.2和m/z253.2的碎片離子峰。借鑒文獻報道的薯蕷皂苷的裂解規(guī)律[19]，根據(jù)得到的特征碎片離子，推測薯蕷皂苷元的潛在質(zhì)譜裂解規(guī)律如圖9所示。圖9顯示，薯蕷皂苷元的質(zhì)子形成[MDiosgenin+ H]+(m/z415.3)的準分子離子峰，m/z415.3離子在碰撞電壓的轟擊下有兩條裂解途徑。第一條裂解途徑是失去1分子H2O產(chǎn)生 [MDiosgenin-H2O+H]+碎片離子(m/z397.3)，接著丟失EF環(huán)脫144 Da生成[MDiosgenin-EF-H2O+H]+離子(m/z253.2)。第二條裂解途徑是先丟失EF環(huán)生成[MDiosgenin-EF +H]+離子(m/z271.2)后再繼續(xù)丟失H2O脫18 Da產(chǎn)生[MDiosgenin-EF-H2O+H]+離子(m/z253.2)。薯蕷皂苷元潛在裂解規(guī)律的發(fā)現(xiàn)，對含薯蕷皂苷元的中藥材中化合物的鑒別具有指導(dǎo)意義。

圖9 薯蕷皂苷元的潛在裂解規(guī)律

4 結(jié)論

本文以甲睪酮為內(nèi)標，建立了快速測定黃精中薯蕷皂苷元的DCBI-MS方法，優(yōu)化了三角形紙基上樣方式、掃描模式、上樣體積、DCBI源解吸附溫度和放電電壓等參數(shù)，并對方法的精密度和準確度進行了評估，利用二級質(zhì)譜圖，推測了薯蕷皂苷元潛在的質(zhì)譜裂解規(guī)律。本文建立的DCBI-MS法與傳統(tǒng)的HPLC-UV法對比，對實際樣品的測定結(jié)果無顯著性差異，與傳統(tǒng)HPLC-UV法相比，DCBI-MS更省時省溶劑。該DCBI-MS法不僅有利于大批量黃精樣品中薯蕷皂苷元含量的快速測定和高通量分析，也為其他含薯蕷皂苷元的中藥材的分析提供了新的策略。綜上所述，DCBI-MS法在復(fù)雜基質(zhì)中藥材的高通量分析和快速篩查目標化合物方面具有潛在優(yōu)勢，研究結(jié)果可為中藥黃精中薯蕷皂苷元的基礎(chǔ)研究和質(zhì)量控制提供參考。