禹蘭平，王楷宬，潘俊慧，張富友，楊文靜，周凱鈺太，崔成都，孫福亮，王素春

（1.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；2.延邊大學(xué)，吉林延吉 133000；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物生物安全風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警及防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（南方），山東青島 266032）

隨著全球家畜養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，動(dòng)物疫病問題也越來越復(fù)雜，給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大影響，對(duì)人類健康與公共衛(wèi)生造成潛在威脅。對(duì)病原的及時(shí)檢測(cè)，有助于及時(shí)控制動(dòng)物疫病并減少損失。病原分離與鑒定是診斷動(dòng)物疫病的金標(biāo)準(zhǔn)，但其耗時(shí)耗力，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員和實(shí)驗(yàn)環(huán)境需求較高，還存在一定的生物安全風(fēng)險(xiǎn)[1]。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是目前應(yīng)用最廣泛的病原檢測(cè)技術(shù)。該技術(shù)可對(duì)病原核酸進(jìn)行定性分析，而且特異性好、靈敏度高、準(zhǔn)確率高，但須依賴精密的核酸擴(kuò)增儀以實(shí)現(xiàn)不同溫度的熱循環(huán)擴(kuò)增，多適用于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。20 世紀(jì)以來，等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)作為一種創(chuàng)新性病原核酸檢測(cè)技術(shù)，得到逐步發(fā)展完善。此類技術(shù)可在一個(gè)恒定的溫度下完成擴(kuò)增反應(yīng)，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、成本低、操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短等優(yōu)點(diǎn)，可在野外環(huán)境下通過便攜快速檢測(cè)設(shè)備，用于動(dòng)物疫病現(xiàn)場(chǎng)初篩。該技術(shù)與PCR 技術(shù)相結(jié)合，可為動(dòng)物疫病的發(fā)現(xiàn)和處置爭(zhēng)取時(shí)間，對(duì)動(dòng)物疫病防控具有重要意義。本文從技術(shù)原理、優(yōu)缺點(diǎn)及在動(dòng)物疫病檢測(cè)中的應(yīng)用方面，對(duì)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、重組酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、依賴核酸序列的擴(kuò)增技術(shù)、交叉引物等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、賴解旋酶擴(kuò)增技術(shù)等當(dāng)前常見的幾種恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)進(jìn)行分析總結(jié)，以期為動(dòng)物疫病檢測(cè)方法建立和防控策略制定提供參考。

1 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

1.1 技術(shù)原理

2000 年，Notomi 等[2]研發(fā)了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP），使用4～6 條引物通過BstDNA 聚合酶的鏈置換活性，對(duì)模板進(jìn)行特定擴(kuò)增。該方法有3 個(gè)反應(yīng)階段：第一，起始結(jié)構(gòu)產(chǎn)生。外引物和內(nèi)引物擴(kuò)增出起始模板并限制擴(kuò)增范圍，同時(shí)為內(nèi)引物提供擴(kuò)增用模板。第二，啞鈴狀結(jié)構(gòu)產(chǎn)生。內(nèi)引物擴(kuò)增的DNA 片段包含5'端DNA 的反向互補(bǔ)序列，而反向互補(bǔ)序列可以相互形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)；另一條內(nèi)引物與互補(bǔ)序列退火雜交，經(jīng)過鏈置換并合成后在擴(kuò)增的DNA 片段另一端形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，這樣擴(kuò)增后的片段擁有2 個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)的啞鈴狀結(jié)構(gòu)。第三，以上一階段產(chǎn)生的啞鈴狀結(jié)構(gòu)DNA 片段為模板進(jìn)行循環(huán)擴(kuò)增，最終生成重復(fù)并反向的莖環(huán)結(jié)構(gòu)和多環(huán)花椰菜樣結(jié)構(gòu)的DNA 片段混合產(chǎn)物。

常用的LAMP 擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)方法有瓊脂糖凝膠電泳、實(shí)時(shí)熒光、試紙條技術(shù)以及添加染料指示劑等。此外，LAMP 反應(yīng)過程中，從脫氧核糖核酸三磷酸中析出的焦磷酸離子可與反應(yīng)液中的鎂離子反應(yīng)而生成不溶于水的焦磷酸鎂白色沉淀物，基于此設(shè)計(jì)了焦磷酸鎂白色沉淀觀察法、濁度檢測(cè)法、金屬離子指示法等檢測(cè)方法。

1.2 優(yōu)缺點(diǎn)和臨床應(yīng)用

LAMP 擴(kuò)增技術(shù)簡(jiǎn)單高效，擴(kuò)增反應(yīng)和產(chǎn)物檢測(cè)可一步完成，不依賴特殊設(shè)備，是目前發(fā)展較為成熟的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，在禽、羊、豬等動(dòng)物的病原檢測(cè)中都有應(yīng)用（表1）。與傳統(tǒng)的PCR 擴(kuò)增反應(yīng)相比，LAMP 技術(shù)耗時(shí)更短，擴(kuò)增時(shí)間大多數(shù)在1 h 以內(nèi)，靈敏度更高。但該方法對(duì)引物的設(shè)計(jì)要求較為復(fù)雜，需要的引物數(shù)量多，研發(fā)多重LAMP 檢測(cè)方法有很大困難。該方法擴(kuò)增后的產(chǎn)物呈花椰菜樣結(jié)構(gòu)，不適用于克隆測(cè)序，僅適用于結(jié)果的陰陽性判定。此外，若對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，就無法避免開蓋檢測(cè)問題，從而會(huì)產(chǎn)生氣溶膠污染和結(jié)果假陽性問題，但結(jié)合實(shí)時(shí)熒光和染料指示劑能做到擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束即出檢測(cè)結(jié)果，無需開蓋，從而可以有效避免氣溶膠污染問題，且操作簡(jiǎn)單，是目前較為常用的兩種形式。例如，常攀峰等[3]建立的羊傳染性膿皰病毒LAMP檢測(cè)方法，通過在反應(yīng)體系中添加染料指示劑，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束時(shí)即可肉眼觀察結(jié)果，不需要對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行額外操作，簡(jiǎn)化了操作流程，避免了氣溶膠污染，靈敏度也是普通PCR 的10 倍以上，可作為羊傳染性膿皰病毒的臨床檢測(cè)候選方式。有學(xué)者[4]建立了一些病原的RT-LAMP 檢測(cè)方法，與已有的熒光RT-PCR 方法比較，兩種檢測(cè)方法靈敏度一致，但LAMP 方法特異性更強(qiáng)，耗時(shí)更短，陽性檢出率更高，且對(duì)儀器依賴性低，更適用于病原的臨床快速篩查。

表1 LAMP 技術(shù)在動(dòng)物病原檢測(cè)中的應(yīng)用舉例

2 重組酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

2.1 技術(shù)原理

重組酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)主要包括重組酶聚合酶擴(kuò)增（recombinase polymerase amplification，RPA）和重組酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（recombinase aid amplification，RAA）[13-14]。

RPA 是Piepenburg 等[15]在2006 年建立的方法，其擴(kuò)增原理是先利用T4 類噬菌體中的重組酶蛋白UvsX 與特異性引物結(jié)合，形成重組酶-引物復(fù)合體，再對(duì)雙鏈DNA 進(jìn)行掃描和識(shí)別，識(shí)別到同源序列后，復(fù)合體插入雙鏈DNA 形成D-環(huán)結(jié)構(gòu)；為了防止新鏈和之前的母鏈配對(duì)，單鏈結(jié)合蛋白（gp32）與置換出的單鏈DNA 結(jié)合，隨后ATP水解供能，使重組酶-引物復(fù)合體分解，在引物3'端與DNA 聚合酶結(jié)合并進(jìn)行復(fù)制和延伸。RAA 擴(kuò)增原理與RPA 相似，其創(chuàng)新點(diǎn)在于擴(kuò)增反應(yīng)中使用的重組酶來自細(xì)菌或真菌。這類酶來源更廣泛，對(duì)溫度的適應(yīng)性更強(qiáng)，因而提高了反應(yīng)穩(wěn)定性，降低了試劑成本。

重組酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的基礎(chǔ)擴(kuò)增產(chǎn)物可以通過凝膠電泳法進(jìn)行鑒定，也可以結(jié)合熒光探針或熒光染料，實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增反應(yīng)和結(jié)果判定一步化。此外，該方法還可以結(jié)合膠體金試紙條技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)病原核酸的快速檢測(cè)。

2.2 優(yōu)缺點(diǎn)和臨床應(yīng)用

重組酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在我國(guó)一直擁有很大的研究熱度，研究人員已建立了禽、豬、牛等多種家畜的病原檢測(cè)方法（表2）。該技術(shù)在檢測(cè)過程中不受場(chǎng)地條件約束，5～30 min 即可完成擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)溫度（37～42 ℃）與人體溫接近，甚至可以夾在腋下或握在手中進(jìn)行反應(yīng)。該方法操作簡(jiǎn)單，靈敏度高，且與LAMP 相比，擴(kuò)增時(shí)間更短，反應(yīng)溫度更低，更容易實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。此外，RAA 方法將反應(yīng)過程中用到的多種酶，按照需求量?jī)龈稍诜磻?yīng)管中，這樣既方便運(yùn)輸，又保證了酶的活性。

表2 重組酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在動(dòng)物病原檢測(cè)上的應(yīng)用舉例

重組酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)一般用于實(shí)驗(yàn)研究。該方法的擴(kuò)增產(chǎn)物需要通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，可能會(huì)出現(xiàn)拖帶現(xiàn)象，且容易出現(xiàn)氣溶膠污染，因此在檢測(cè)前需要對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行反應(yīng)阻斷和純化處理。將重組酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)結(jié)合熒光探針法，可以實(shí)時(shí)顯示擴(kuò)增結(jié)果，既提高了檢測(cè)靈敏度和特異性，又縮短了反應(yīng)時(shí)間，是目前較為常用的方式。但是該方法對(duì)引物和探針有特定要求，引物長(zhǎng)度一般為30～35 bp，探針長(zhǎng)度一般為46～53 個(gè)堿基，在探針設(shè)計(jì)時(shí)需要找出適合標(biāo)記熒光信號(hào)、淬滅基團(tuán)和四氫呋喃分子位點(diǎn)，設(shè)計(jì)要求較復(fù)雜，目前還沒有專門設(shè)計(jì)這類探針的軟件，只能依靠技術(shù)人員進(jìn)行人工操作。

3 依賴核酸序列的擴(kuò)增技術(shù)

3.1 技術(shù)原理

依賴核酸序列的擴(kuò)增技術(shù)（nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）由Compton[24]在1991 年建立，是一種在42 ℃條件下，由1 對(duì)特異性引物介導(dǎo)，在禽源成髓細(xì)胞瘤逆轉(zhuǎn)錄酶、核糖核酸酶H、噬菌體T7 RNA 多聚酶的共同作用下完成的連續(xù)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)。該方法大致包括5 步：（1）引物Ⅰ與RNA 模板鏈3'端結(jié)合；（2）禽源成髓細(xì)胞瘤逆轉(zhuǎn)錄酶合成反義的DNA 鏈，形成DNA-RNA 雜交鏈；（3）核糖核酸酶H 降解雜交鏈中的RNA，留下DNA 鏈；（4）引物Ⅱ與DNA 的5'端結(jié)合；（5）噬菌體T7 RNA 多聚酶合成補(bǔ)償鏈，進(jìn)入第一步，開始循環(huán)反應(yīng)。

目前擴(kuò)增產(chǎn)物的初步鑒定主要是在瓊脂糖甲醛變性凝膠電泳后用染料染色，并在紫外燈下觀察片段長(zhǎng)度或進(jìn)行熒光檢測(cè)[25]。在《禽流感病毒NASBA 檢測(cè)方法》（GB/T l9440—2004）中，擴(kuò)增后的產(chǎn)物用Nuclisens 閱讀器進(jìn)行檢測(cè)，其原理是根據(jù)上游引物5'末端含有噬菌體T7 的依賴于DNA 的RNA 聚合酶起動(dòng)因子序列，下游引物5'末端含有釕標(biāo)電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)探針互補(bǔ)序列，在擴(kuò)增過程中既能產(chǎn)生互補(bǔ)RNA 序列的模板，又能特異性結(jié)合檢測(cè)步驟中的ECL 探針。此外，還可以使用與酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定結(jié)合建立的寡核苷酸檢測(cè)[26]。

3.2 優(yōu)缺點(diǎn)和臨床應(yīng)用

NASBA 技術(shù)擴(kuò)增效率與RT-PCR 相當(dāng)，保真度高，擴(kuò)增產(chǎn)物不易污染實(shí)驗(yàn)室環(huán)境和物品，能有效避免交叉污染導(dǎo)致的假陽性。該方法將反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增反應(yīng)合并到一起，縮短了反應(yīng)時(shí)間，適合擴(kuò)增RNA；如果擴(kuò)增DNA 模板，則需要在反應(yīng)過程中添加變性步驟[27]。

在NASBA 技術(shù)的早期發(fā)展過程中，研究者建立了部分畜禽和水生動(dòng)物病原檢測(cè)方法（表3）。我國(guó)2004 年發(fā)布了兩項(xiàng)應(yīng)用該技術(shù)進(jìn)行病原檢測(cè)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)——《H5 亞型禽流感病毒NASBA 檢測(cè)方法》（GB/T 19439—20040）和《禽流感病毒NASBA 檢測(cè)方法》（GB/T l9440—2004），填補(bǔ)了禽流感病毒快速檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的空白。然而該技術(shù)在反應(yīng)過程中需要用到3 種酶，因而反應(yīng)成本偏高。與LAMP 和重組酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)相比，該方法耗時(shí)更長(zhǎng)，并且反應(yīng)過程中需要2 種溫度，配備2 種反應(yīng)液，操作過程相對(duì)復(fù)雜。隨著技術(shù)缺點(diǎn)的逐漸凸顯，利用該技術(shù)進(jìn)行的疫病檢測(cè)研究逐漸減少。

表3 NASBA 技術(shù)在動(dòng)物病原檢測(cè)上的應(yīng)用舉例

4 交叉引物等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

4.1 技術(shù)原理

交叉引物等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（crossing priming amplification，CPA）由杭州優(yōu)思達(dá)生物公司研發(fā)，是我國(guó)第一個(gè)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的核酸擴(kuò)增技術(shù)[33]。該方法在63 ℃條件下，通過BstDNA 聚合酶、甜菜堿和交叉引物進(jìn)行擴(kuò)增，按照交叉引物數(shù)量的不同，可分為雙交叉引物擴(kuò)增（2 條交叉引物、2 條剝離引物）和單交叉引物擴(kuò)增（1 條交叉引物，2 條剝離引物和2 條普通引物）。雙交叉引物擴(kuò)增是2 條交叉引物與模板互補(bǔ)結(jié)合并延伸后，由2 條剝離引物通過BstDNA 聚合酶剝離新合成的單鏈，被剝離的新單鏈成為模板并生成大量擴(kuò)增產(chǎn)物。單交叉引物擴(kuò)增是1 條交叉引物與模板結(jié)合并延伸形成雙鏈，隨后2 條剝離引物通過BstDNA 聚合酶剝離新合成的單鏈，2 條普通引物以被剝離的新單鏈為模板合成2 條長(zhǎng)度不等的單鏈DNA，最后以這2 條單鏈DNA 為模板進(jìn)行大量擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物通過膠體金試紙條技術(shù)可實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)，也可通過添加染料指示劑或瓊脂糖電泳進(jìn)行檢測(cè)。

4.2 優(yōu)缺點(diǎn)和臨床應(yīng)用

CPA 技術(shù)操作相對(duì)簡(jiǎn)單，靈敏度高，特異性好，在63 ℃左右反應(yīng)1 h 即可完成擴(kuò)增。該技術(shù)的反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度與LAMP 方法相似，自問世以來，已經(jīng)在禽、牛、豬等多種動(dòng)物的病原檢測(cè)中得到應(yīng)用（表4）。但CPA反應(yīng)體系配制過程相對(duì)繁瑣，通過添加染料指示劑實(shí)現(xiàn)可視化結(jié)果判定時(shí)，對(duì)弱陽性結(jié)果存在一定的主觀誤差，容易造成假陽性或假陰性。

表4 CPA 技術(shù)在動(dòng)物病原檢測(cè)上的應(yīng)用舉例

5 賴解旋酶擴(kuò)增技術(shù)

5.1 技術(shù)原理

賴解旋酶擴(kuò)增技術(shù)（helicase dependent amplification，HDA）是由美國(guó)New Englang Biolabs 公司發(fā)明的一種模擬動(dòng)物體內(nèi)DNA 復(fù)制的新技術(shù)[41]。HDA 技術(shù)擴(kuò)增反應(yīng)主要包含5 個(gè)階段：（1）利用解旋酶打開DNA 雙鏈，使其變成游離的單鏈形式；（2）結(jié)合蛋白與解旋后的DNA 單鏈結(jié)合，以阻止互補(bǔ)鏈再結(jié)合；（3）利用2 條特異性引物和單鏈靶DNA 雜交，通過DNA 聚合酶延伸和模板退火的引物生成雙鏈DNA；（4）新合成的雙鏈DNA 作為DNA 解旋酶的底物進(jìn)行下一步的擴(kuò)增和循環(huán)，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物的大量擴(kuò)增；（5）擴(kuò)增完成后，可通過瓊脂糖凝膠電泳、熒光DNA 結(jié)合劑、熒光和電化學(xué)等方法進(jìn)行檢測(cè)。

5.2 優(yōu)缺點(diǎn)和臨床應(yīng)用

與其他等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)相比，HDA 技術(shù)僅需要2 條普通引物，且引物設(shè)計(jì)相對(duì)簡(jiǎn)單。但該方法的反應(yīng)體系較為復(fù)雜，方法優(yōu)化會(huì)受體系限制，且反應(yīng)過程大部分需要分兩步在2 個(gè)不同溫度條件下完成，反應(yīng)時(shí)間多為1～2 h，并不具備優(yōu)勢(shì)。該方法主要用于環(huán)狀DNA 擴(kuò)增，可以同時(shí)完成基因擴(kuò)增和基因篩選[42]，且擴(kuò)增產(chǎn)物是均一的，可以直接用于測(cè)序，但是反應(yīng)體系中解旋酶解旋的速度是有限制的，因此不適合擴(kuò)增長(zhǎng)序列。

在動(dòng)物病原檢測(cè)方面，已建立了一些HDA 檢測(cè)方法（表5）。但是受多種因素影響，該技術(shù)在病原檢測(cè)方面沒有得到廣泛應(yīng)用。

表5 HDA 技術(shù)在動(dòng)物病原檢測(cè)上的應(yīng)用實(shí)例

6 小結(jié)

5 種等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，在不同方面都有自己的特點(diǎn)。在引物設(shè)計(jì)方面，LAMP 和CPA 技術(shù)需要設(shè)計(jì)2 條以上引物，引物設(shè)計(jì)難度與要求相對(duì)于其他3 種更高。在配制體系方面，NASBA 技術(shù)在反應(yīng)過程中需要中途加入酶反應(yīng)液，HDA 技術(shù)需要配制A、B 兩種反應(yīng)體系，其他3 種技術(shù)只需要配制1 種即可進(jìn)行反應(yīng)。在反應(yīng)溫度方面，LAMP、RPA、RAA、CPA 技術(shù)在整個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)過程中僅需要1 個(gè)恒定溫度即可，而NASBA 和HDA 技術(shù)需要2 個(gè)甚至3 個(gè)反應(yīng)溫度，反應(yīng)過程相對(duì)復(fù)雜。在反應(yīng)時(shí)間方面，RPA 和RAA 技術(shù)最具有優(yōu)勢(shì)，5～20 min 即可完成擴(kuò)增檢測(cè)，而其他3 種等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)反應(yīng)時(shí)間普遍在1 h 左右。在產(chǎn)物檢測(cè)方面，5 種技術(shù)均可通過瓊脂糖凝膠進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)，但是這種方式容易產(chǎn)生氣溶膠污染。RPA 和RAA技術(shù)可以結(jié)合熒光探針法，通過熒光信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，反應(yīng)過程無需開蓋，避免了污染問題。LAMP 和CPA 技術(shù)可通過在反應(yīng)管蓋上加入染料指示劑，反應(yīng)結(jié)束后來回翻轉(zhuǎn)使反應(yīng)液與指示劑混合均勻，通過顏色變化來判斷反應(yīng)陰陽性，從反應(yīng)開始到結(jié)果判定全程封閉，可避免氣溶膠污染并且降低假陽性概率。NASBA 可以通過ECL 閱讀器來判斷反應(yīng)是否擴(kuò)增。5 種等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)也可以通過試紙條、膠體金和核酸擴(kuò)增物快速檢測(cè)板等檢測(cè)方法實(shí)現(xiàn)肉眼可視化檢測(cè)，但是把產(chǎn)物加入到試紙條檢測(cè)并等待結(jié)果這一階段時(shí)間容易產(chǎn)生氣溶膠污染，因此市面上也出現(xiàn)了獨(dú)立封閉的試紙條容器，反應(yīng)管無需開蓋直接放入容器進(jìn)行檢測(cè)，這樣可有效降低檢測(cè)結(jié)果假陽性概率，但其成本高于普通的試紙條，主要用于寵物或經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高動(dòng)物的疫病快速檢測(cè)。

7 前景與展望

在動(dòng)物疫病防控工作中，快速、高效、簡(jiǎn)單、便捷的病原檢測(cè)方法，可以及早發(fā)現(xiàn)疫病并減少因疫病造成的損失，對(duì)促進(jìn)我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展起重要作用。等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)自問世以來，因其特有的技術(shù)優(yōu)勢(shì)而備受關(guān)注。近年來，等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)得到不斷發(fā)展和創(chuàng)新，相關(guān)病原檢測(cè)方法也層出不窮。

至今，我國(guó)已開發(fā)出多種商業(yè)化等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒，并申請(qǐng)了相關(guān)專利[48-51]，使等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)得到了進(jìn)一步推廣和應(yīng)用。但是等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)作為一種新興技術(shù)，雖然具備許多優(yōu)點(diǎn)，也面臨著諸多挑戰(zhàn)，仍需要不斷改進(jìn)，例如在反應(yīng)成本、反應(yīng)過程穩(wěn)定性、操作簡(jiǎn)便性等方面。因此，基于何種情況選擇何種檢測(cè)技術(shù)，需要根據(jù)不同需求和場(chǎng)景條件來選擇。此外，等溫檢測(cè)技術(shù)還可以借助自身優(yōu)勢(shì)，與微流體芯片、納米金、CRISPR 等技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，建立更加快捷、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法，從而為動(dòng)物疫病檢測(cè)提供更好的服務(wù)。