史喜菊，杜思樂，蒲靜，張偉，任彤，徐立偉，鄧叢良，趙相鵬，高志強(qiáng)，汪琳，張佳瑋，白子龍，張小寒，賴平安，宋悅謙

（中國海關(guān)科學(xué)技術(shù)研究中心，北京 100026）

動物源性食品是人類飲食結(jié)構(gòu)的重要組成部分，而動物源性食品中肉類又居于首位，是人類動物蛋白的主要來源。國家統(tǒng)計(jì)局?jǐn)?shù)據(jù)顯示，2015年之前我國肉類總產(chǎn)量呈逐年上升趨勢，2016—2018 年基本持平，2019 年開始出現(xiàn)下降，這種下降主要是由于原來占肉類總量60%以上的豬肉產(chǎn)量降低了21.3%，相反，牛肉和羊肉產(chǎn)量卻分別增加了3.6%和2.7%。不同種屬來源的肉，由于其營養(yǎng)價(jià)值、風(fēng)味以及消費(fèi)者宗教習(xí)俗等原因，價(jià)格差異很大，所以市場上肉類摻假現(xiàn)象層出不窮。肉制品摻假是全球性問題。國外對近千種肉制品的檢測結(jié)果表明，有近20%的產(chǎn)品存在標(biāo)識與品種不完全相符的現(xiàn)象，如2012 年沃爾瑪?shù)暮側(cè)狻?013年的歐洲馬肉等事件[1]。在國內(nèi)，有些不法肉食品企業(yè)使用相對廉價(jià)的豬肉、雞肉等肉類原料，通過各種深加工手段，冒充牛、羊肉制品進(jìn)行銷售以謀取不當(dāng)利益，嚴(yán)重侵犯了消費(fèi)者的合法權(quán)益。

目前已知的肉及肉制品中肉類成分的鑒定方法眾多，其中基于DNA 的PCR 檢測技術(shù)被認(rèn)為是精準(zhǔn)有效的檢測方法之一[2-5]，我國也相應(yīng)出臺了一系列檢測標(biāo)準(zhǔn)，如《常見畜禽動物源性成分檢測方法 實(shí)時(shí)熒光PCR 法》[6]、《動物產(chǎn)品中牛、山羊和綿羊源性成分三重實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測方法》[7]、《食品、化妝品和飼料中牛羊豬源性成分檢測方法實(shí)時(shí)熒光PCR 法》[8]等。隨著這些標(biāo)準(zhǔn)的出臺，市場上銷售的各類肉源成分熒光PCR 檢測試劑盒也層出不窮。本研究特選取了市場上常見的4 個(gè)品牌的5 種肉及肉制品（牛、羊、豬、雞、鴨）熒光PCR 檢測試劑盒，并對其特異性、靈敏性、成本效益等方面進(jìn)行了比較，旨在為選擇更合適的肉類成分檢測試劑盒提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 從屠宰場和市場上購買牛肉、羊肉、豬肉、雞肉和鴨肉各20 份。

1.1.2 主要試劑 動物組織DNA 提取試劑盒，購自天根生化科技有限公司；5 種肉類成分熒光PCR 檢測試劑盒購自4 家生物公司，分別用A、B、C 和D 代表。

1.1.3 主要儀器 核酸提取儀、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀、均質(zhì)儀、研缽和研磨棒、微量移液器等。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理

1.2.1.1 單一樣品 去除樣品中明顯的脂肪組織并用滅菌水清洗干凈；取100～200 mg 樣品用手術(shù)剪剪碎，并用研磨棒充分研磨；取50 mg 研磨樣品置于1.5 mL 無菌離心管中，加入200 μL 滅菌PBS（pH 7.2）用于核酸提取。每份樣品做3 個(gè)重復(fù)。

1.2.1.2 混合樣品 稱取5 種肉類樣品各100 mg，置于研缽中，用研磨棒充分研磨混勻；取50 mg 研磨樣品置于1.5 mL 無菌離心管中，加入200 μL 滅菌PBS（pH 7.2）用于核酸提取。每份樣品做3 個(gè)重復(fù)。

1.2.2 核酸提取 按照動物組織DNA 提取試劑盒說明書，分別從上述樣品中提取DNA，置于-20 ℃冰箱備用。

1.2.3 核酸濃度測定 用NanoDrop 微量核酸蛋白濃度測定儀測定各樣品核酸濃度，用于靈敏性試驗(yàn)。

1.2.4 肉類種屬成分熒光PCR 檢測 參加比對的4 種品牌肉類成分檢測試劑盒均為熒光PCR 方法。按照各試劑盒說明書要求配制反應(yīng)體系，設(shè)置反應(yīng)條件，進(jìn)行結(jié)果判定。具體見表1。

表1 4 種品牌肉類成分熒光PCR 檢測試劑盒檢測條件

1.2.5 特異性比較試驗(yàn)

1.2.5.1 單一樣品 以單一樣品提取的核酸為模板，分別用4 種品牌試劑盒進(jìn)行熒光PCR 反應(yīng)，試驗(yàn)檢測單一樣品的特異性。

1.2.5.2 混合樣品 以混合樣品提取的核酸為模板，分別用4 種品牌試劑盒進(jìn)行熒光PCR 反應(yīng)，試驗(yàn)檢測混合樣品的特異性。

1.2.6 靈敏性比較試驗(yàn)

1.2.6.1 單一樣品 分別提取5種肉類樣品核酸，測定濃度后進(jìn)行10 倍倍比稀釋；以倍比稀釋的核酸為模板，分別用4 種品牌試劑盒進(jìn)行熒光PCR 反應(yīng)，試驗(yàn)檢測單一樣品的靈敏性。每種試劑盒檢測出的最低核酸濃度即為該類源性成分的最低檢測限。

1.2.6.2 混合樣品 提取5種混合肉類樣品核酸，測定濃度后進(jìn)行10 倍倍比稀釋；以倍比稀釋的核酸為模板，分別用4 種品牌試劑盒進(jìn)行熒光PCR 反應(yīng)，試驗(yàn)檢測混合樣品的靈敏性。每種試劑盒檢測出的最低核酸濃度即為該類源性成分的最低檢測限。

1.2.7 成本與效率比較 計(jì)算4 種品牌試劑盒的反應(yīng)時(shí)間及試劑耗材成本，比較成本與效率。

2 結(jié)果與分析

2.1 核酸濃度

測定的單一樣品和混合樣品的核酸純度和濃度見表2。

表2 核酸原始純度及濃度

2.2 特異性比較試驗(yàn)

2.2.1 單一樣品 結(jié)果（表3）顯示：每種試劑盒均只能從單一樣品中檢出特異性擴(kuò)增，而對其他肉類模板擴(kuò)增均為陰性。說明各試劑盒的特異性均較好，不同肉類之間不存在交叉反應(yīng)。

表3 各試劑盒檢測單一樣品特異性結(jié)果

2.2.2 混合樣品 結(jié)果（表4）顯示：每種試劑盒均只能從混合模板中檢出特異的肉品種類，而對其他4 種肉類的擴(kuò)增均為陰性。說明各試劑盒的特異性均較好，混合模板也未對特異性產(chǎn)生干擾。

表4 各試劑盒檢測混合樣品特異性結(jié)果

2.3 靈敏性比較試驗(yàn)

2.3.1 單一樣品 不同試劑盒檢測單一樣品的最低檢測限存在差異（表5）：對于牛源性成分檢測試劑盒，D 品牌的最低檢測限為1.03 fg/μL，A 品牌為103 fg/μL，B 和C 品牌為10.3 pg/μL；對于羊源性成分檢測試劑盒，B 和C 品牌的最低檢測限為9.56 fg/μL，D 品牌為95.6 fg/μL，A 品牌為956 fg/μL；對于豬源性成分檢測試劑盒，B 和C品牌的最低檢測限為9.85 fg/μL，A 和D 品牌為98.5 fg/μL；對于雞源性成分檢測試劑盒，C 和D 品牌的最低檢測限為11.08 fg/μL，A 和B 品牌為110.8 fg/μL；對于鴨源性成分檢測試劑盒，D品牌的最低檢測限為10.21 fg/μL，其他3 家均為102.1 fg/uL。

表5 各試劑盒檢測單一樣品最低檢測限

2.3.2 混合樣品 不同試劑盒檢測混合樣品的最低檢測限存在差異（表6）：A 品牌的5 種肉類成分檢測試劑盒比較一致，最低檢測限均為1.10 pg/μL，不同成分的試劑盒之間無差異；B 品牌的羊源和雞源成分檢測試劑盒最低檢測限為1.10 pg/μL，其他3 種成分檢測試劑盒的最低檢測限為110.2 fg/μL，不同成分的試劑盒檢測限相差10 倍；C 品牌的牛源和羊源成分檢測試劑盒的核酸檢測限為11.0 pg/μL，其他3 種成分檢測試劑盒的核酸檢測限約為110.2 fg/μL，不同成分的試劑盒檢測限相差100 倍；D 品牌的5 種肉類成分檢測試劑盒比較一致，最低檢測限為110.2 fg/μL，不同成分的試劑盒之間無差異。

表6 各試劑盒檢測混合樣品最低檢測限

2.4 成本和效率比較

分別計(jì)算4 種品牌試劑盒的反應(yīng)時(shí)間及試劑耗材成本發(fā)現(xiàn)，不同品牌試劑盒的熒光PCR 檢測時(shí)間及檢測成本存在差異（表7）：A 品牌試劑盒耗時(shí)最短，全程僅需52.5 min，總成本價(jià)66 元/份，價(jià)格適中；B 和C 品牌耗時(shí)均需80 min 以上，總成本價(jià)分別為62 和66 元，處于中間水平；D 品牌試劑盒耗時(shí)65.0 min，但是成本偏高，單份84 元。

表7 4 種品牌試劑盒效率和成本比較

3 討論

隨著人們對生活品質(zhì)的要求逐步提高，消費(fèi)者越來越關(guān)注食用肉制品的質(zhì)量問題，但市場上肉類摻假的現(xiàn)象屢見不鮮，引起了消費(fèi)者及監(jiān)管部門的廣泛關(guān)注[1]。目前，已有顯微鏡法、PCR 法、熒光PCR 法、蛋白質(zhì)譜及光譜學(xué)等多種肉類成分檢測方法，其中熒光PCR 檢測方法由于其靈敏、特異和快速等優(yōu)點(diǎn)，已成為肉類成分檢測領(lǐng)域的黃金標(biāo)準(zhǔn)，被廣泛應(yīng)用于肉類源性成分鑒別[3-4、9-11]。

本次研究分別從特異性、靈敏性、效率成本等方面，對市場上4 個(gè)品牌的5 種肉類成分熒光PCR 檢測試劑盒進(jìn)行了比較。經(jīng)過試驗(yàn)，4 種品牌試劑盒特異性均較好，不同肉類之間沒有交叉反應(yīng)，與相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的描述一致[6-8]；而靈敏性則有較大區(qū)別，檢測同一種肉類的不同品牌試劑盒靈敏性及同一品牌檢測不同肉類的試劑盒靈敏性均存在差異，靈敏度高的可以達(dá)到fg 級別，差的只能到pg 級別，與王金斌等[9]、馬炳存等[10]研究結(jié)果一致。分析原因，可能是由試劑盒的固有性能特征引起的，不同品牌的檢測試劑追求的使用目的不同，有的追求高特異性，有的追求高靈敏性，這也是造成試劑盒間存在差異的根本原因。另外，不同品牌的試劑盒檢測時(shí)間和成本也有差異，耗時(shí)短的試劑盒由于循環(huán)次數(shù)少，可能會存在弱陽性檢出率低的情況，價(jià)格偏高的試劑盒通常靈敏度也要高一些，使用者可以根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康暮皖A(yù)算選擇恰當(dāng)?shù)脑噭┖小?/p>