蔡文博

（常州市金壇區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，江蘇常州 213200）

口蹄疫（foot and mouth disease，F(xiàn)MD）是由口蹄疫病毒（foot and mouth disease virus，F(xiàn)MDV）感染豬、牛、羊等偶蹄動(dòng)物引起的一種急性、烈性、高度接觸性傳染病，可造成巨大經(jīng)濟(jì)損失和社會(huì)影響。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（WOAH）將其列為須通報(bào)動(dòng)物傳染病，我國將其規(guī)定為一類動(dòng)物疫病[1]。目前，我國仍是受FMD 危害較為嚴(yán)重的國家之一，主要流行O 型和A 型[2]。

FMD 是我國優(yōu)先防治病種之一，對(duì)其控制與消滅需要借助科學(xué)的檢測(cè)手段。目前，常用的FMDV 抗體檢測(cè)方法主要有病毒中和試驗(yàn)（VNT）和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。ELISA 因在FMDV 抗體檢測(cè)中具有敏感、特異、穩(wěn)定、安全等特點(diǎn)而備受青睞[3]。其中，液相阻斷ELISA（LPB-ELISA）是檢測(cè)FMDV 的國際標(biāo)準(zhǔn)方法[4]，也是我國FMD 診斷技術(shù)國家標(biāo)準(zhǔn)中認(rèn)可的檢測(cè)方法。但該方法操作步驟繁瑣，每塊反應(yīng)板檢測(cè)數(shù)量少，試驗(yàn)所需時(shí)間長[1]。目前市面上有一種固相競爭ELISA（SPC-ELISA）抗體定性檢測(cè)試劑盒，它不需要對(duì)樣品進(jìn)行梯度稀釋，每塊反應(yīng)板的檢測(cè)量由LPB-ELISA 的最多20 份增多至92 份，從而有效解決了ELISA 定量檢測(cè)方法不適合大批量檢測(cè)的問題，但其尚未列入國家檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。

近年來，基層畜牧獸醫(yī)部門技術(shù)人員短缺是我國大多數(shù)地區(qū)普遍存在的問題。為減輕基層技術(shù)人員檢測(cè)壓力，需要一種操作簡單、適合大批量快速檢測(cè)的方法。為評(píng)價(jià)SPC-ELISA 定性檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)性能，本研究以2022 年春季從常州市金壇區(qū)采集的300 份豬、牛、羊血液樣本為試驗(yàn)對(duì)象，分別應(yīng)用SPC-ELISA 定性和LPB-ELISA 定量檢測(cè)方法同時(shí)進(jìn)行O 型、A 型FMDV 抗體檢測(cè)，并以國家標(biāo)準(zhǔn)方法LPB-ELISA檢測(cè)結(jié)果作為參考標(biāo)準(zhǔn)，比較兩種方法的符合率和一致性，以期為技術(shù)人員在實(shí)際工作中科學(xué)選擇檢測(cè)方法提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 血液樣本

分兩批次抽檢常州市金壇區(qū)2 家規(guī)模豬場，其中一家免疫的是新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)的豬O 型、A 型FMDV 二價(jià)滅活苗，另一家免疫的是中農(nóng)威特生物科技股份有限公司生產(chǎn)的豬O 型、A 型FMDV 二價(jià)滅活苗，每次每場采集30 份血樣；分2 批次抽檢 1 家規(guī)模牛場，免疫的是金宇保靈生物藥品有限公司生產(chǎn)的O 型、A 型二價(jià)滅活苗，每次采集30 份血樣；抽檢2 家規(guī)模羊場，其中一家分2 批次采集，另一家采集1次，免疫的是中牧實(shí)業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的O 型、A 型FMDV 二價(jià)滅活苗，每次每場采集30 份血樣。另外，采集未免疫家畜血樣30 份，作為陰性對(duì)照。共采集血液樣本300 份。

1.2 檢測(cè)試劑

O 型FMDV 抗體LPB-ELISA 檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：20210922101-5）、A 型FMDV 抗 體LPBELISA 檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：20210910103-1），購自蘭州獸研生物科技有限公司；O 型FMDV 抗體SPC-ELISA 檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：TE210802）、A型FMDV 抗體 SPC-ELISA 檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：E211002-1），購自洛陽萊普生信息科技有限公司。試劑均在有效期內(nèi)使用。

1.3 主要儀器

酶標(biāo)儀（型號(hào)：iMark），購自Bio-Rad 公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱（型號(hào)：DHP-420），購自常州崢嶸儀器有限公司；微量移液器，購自Eppendorf 公司。

1.4 檢測(cè)方法

血樣采集后，室溫靜置2 h，4 000 r/min 離心5 min，分離血清，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩７謩e應(yīng)用LPB-ELISA 和SPC-ELISA 對(duì)所有血清樣品進(jìn)行O型和A 型FMDV 抗體檢測(cè)。

LPB-ELISA 選擇20 份檢測(cè)樣品布局。在U型反應(yīng)板的A1～10、E1～10 孔分別加入87.5 μL PBST 和12.5 μL 被檢血清；B1～10、C1～10、D1～10、F1～10、G1～10、H1～10 各孔加入50.0 μL PBST，以50.0 μL/孔的量用PBST 2 倍連續(xù)稀釋血清，A1～10 孔的血清樣品稀釋至D1～10 孔后棄掉50.0 μL，E1～10 孔的血清樣品稀釋至H1～10 孔后棄掉50.0 μL。被檢血清即在第1～10 列從1:8 稀釋至1:64；在第11 列陽性對(duì)照血清，從1:2（即A11 孔50.0 μL PBST 加50 μL 陽性對(duì)照血清）稀釋至1:256；A12—B12 孔陰性對(duì)照，從1:2 稀釋至1:4；E12—H12 孔為病毒抗原對(duì)照孔。試驗(yàn)操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5 結(jié)果判定

LPB-ELISA：牛羊抗體效價(jià)≥27，豬抗體效價(jià)≥26，判定為個(gè)體免疫合格，即為陽性，否則為陰性。

SPC-ELISA：O 型抗體S/N＜0.4，判定為抗體陰性，S/N≥0.4，判定為抗體陽性；A 型抗體S/N＜0.7，判定為抗體陰性，S/N≥0.7，判定為抗體陽性。

1.6 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件GraphPad Prism 8 中的χ2檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性統(tǒng)計(jì)與分析。其中，P≤0.01為差異極顯著，0.01 ＜P≤0.05 為差異顯著，P＞0.05 為差異不顯著。采用Kappa 統(tǒng)計(jì)量分析兩種ELISA 檢測(cè)方法的一致性[5]，Kappa 統(tǒng)計(jì)量一致性強(qiáng)度參考判斷指標(biāo)：將Kappa 值從大到小劃分為6 個(gè)區(qū)段，分別代表一致性強(qiáng)弱程度。Kappa值＜0，為極差；0～0.2，為微弱；＞0.2～0.4，為弱；＞0.4～0.6，為中度；＞0.6～0.8，為高度；＞0.8～1.0，為極強(qiáng)[6]。應(yīng)用公式（1）計(jì)算兩種方法檢測(cè)結(jié)果的符合率。

式中，P0為符合率，Aii為c×c表中主對(duì)角線上的實(shí)際值，N為總計(jì)數(shù)[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 O 型抗體檢測(cè)

從表1 可以看出，應(yīng)用SPC-ELISA 檢測(cè)的O 型FMDV 抗體陽性率（88.15%）總體略高于LPB-ELISA（85.93%），但差異不顯著（P＞0.05）。不同畜種兩種檢測(cè)方法所得結(jié)果有所區(qū)別，但差異不顯著（P＞0.05）。其中：豬的SPCELISA 抗體陽性率（97.50%）高于LPB-ELISA（90.83%），牛的SPC-ELISA 抗體陽性率（93.33%）低于LPB-ELISA（96.67%），羊的二者相等，均為72.22%。兩種方法檢測(cè)陰性對(duì)照樣品的O 型FMDV 抗體陽性率均為0。

表1 O 型FMDV 抗體LPB-ELISA與SPC-ELISA 檢測(cè)結(jié)果

2.2 A 型抗體檢測(cè)

從表2 可以看出，應(yīng)用SPC-ELISA 檢測(cè)的A型FMDV 抗體陽性率（85.56%）總體略高于LPBELISA（81.48%），但差異不顯著（P＞0.05）。除兩種方法檢測(cè)羊A 型FMDV 抗體陽性率相同外，SPC-ELISA 檢測(cè)豬和牛的抗體陽性率均高于LPBELISA，但差異不顯著（P＞0.05）。兩種方法檢測(cè)陰性對(duì)照樣品的A 型FMDV 抗體陽性率均為0。

表2 A 型FMDV 抗體LPB-ELISA與SPC-ELISA 檢測(cè)結(jié)果

2.3 檢測(cè)結(jié)果一致性比較

2.3.1 O 型抗體 根據(jù)表3 可以得出，兩種方法的總符合率為94.81%[P0=（228+28）/270=0.948 1]；Kappa 值為0.8，表明一致性強(qiáng)度為高度。應(yīng)用LPB-ELISA 和SPC-ELISA 同時(shí)檢測(cè)羊O型FMDV 抗體，兩者的總符合率為100%[P0=（65+25）/90=1]，即為完全符合。

表3 O 型FMDV 抗體SPC-ELISA 與LPB-ELISA檢測(cè)結(jié)果一致性比較 單位：份

2.3.2 A 型抗體 根據(jù)表4 可以得出，兩種方法的總符合率為91.48%[P0=（214+33）/270=0.914 8]；Kappa 值為0.7，表明一致性強(qiáng)度為高度。應(yīng)用LPB-ELISA 和SPC-ELISA 檢測(cè)羊A 型FMDV 抗體，兩者的總符合率為100%[P0=（65+25）/90=1]，即為完全符合。

表4 A 型FMDV 抗體SPC-ELISA 與LPB-ELISA檢測(cè)結(jié)果一致性比較 單位：份

3 討論

LPB-ELISA 是國家標(biāo)準(zhǔn)中的FMDV 抗體定量檢測(cè)方法，敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好，但操作繁瑣、耗時(shí)長，對(duì)操作人員的技術(shù)水平要求較高，不適合基層大批量檢測(cè)，多適用于科學(xué)研究、比對(duì)試驗(yàn)等有特殊需要或考察檢測(cè)能力的場景。2018 年后，我國在《口蹄疫診斷技術(shù)》（GB/T 18935—2018）[7]和《2022 年國家動(dòng)物疫病免疫技術(shù)指南》中均增加了SPC-ELISA 定量檢測(cè)方法。SPC-ELISA 定量檢測(cè)方法延續(xù)了LPB-ELISA 方法的優(yōu)點(diǎn)[8]，而且特異性更高，結(jié)果更為穩(wěn)定[9]，但仍未解決操作繁瑣、檢測(cè)通量少等問題。而SPCELISA 定性檢測(cè)試劑盒，操作簡便、用時(shí)短，1 塊反應(yīng)板同時(shí)能檢測(cè)92 份血清樣品，可大大提高檢測(cè)效率，較適合于流行病學(xué)調(diào)查等的大批量檢測(cè)以及基層獸醫(yī)工作人員使用。SPC-ELISA 定性檢測(cè)優(yōu)勢(shì)明顯，但還不是國標(biāo)中規(guī)定的檢測(cè)方法。

為驗(yàn)證兩種方法檢測(cè)結(jié)果的符合度和一致性，便于檢測(cè)人員根據(jù)具體情況選擇一種更適合的方法，對(duì)2022 年春季采集的規(guī)模豬場、牛場、羊場共300 份血液樣本，分別用LPB-ELISA 試劑盒和SPC-ELISA 定性檢測(cè)試劑盒進(jìn)行O 型、A 型FMDV 抗體測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)應(yīng)用SPC-ELISA 檢測(cè)O 型和A 型FMDV 抗體的陽性率均總體略高于LPB-ELISA，但差異不顯著（P＞0.05），說明兩種方法的陽性檢出率相當(dāng)。

本試驗(yàn)采用LPB-ELISA 和SPC-ELISA 測(cè)得的羊O 型、A 型FMDV 抗體總符合率均為100%，即完全符合，測(cè)得的陰性對(duì)照樣品抗體陽性率均為0，也為完全符合。應(yīng)用兩種方法，對(duì)接種了不同廠家疫苗的不同畜種、不同免疫時(shí)段的血清，同時(shí)進(jìn)行O、A 型FMDV 抗體檢測(cè)，所得總符合率均在90%以上，Kappa 值均大于0.6，表現(xiàn)出高度一致，說明兩種方法的檢測(cè)結(jié)果符合程度高，一致性強(qiáng)。朱愛發(fā)[1]分別應(yīng)用LPB-ELISA和SPC-ELISA定量、定性檢測(cè)豬O 型FMDV 抗體，發(fā)現(xiàn)兩種方法的總符合率為91.67%，符合程度高。陳小麗等[10]應(yīng)用同樣的兩種方法檢測(cè)A 型FMDV 抗體，發(fā)現(xiàn)總符合率為90.00%，Kappa 值為0.8，證明二者的符合率和一致性均較高。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果一致。

雖然應(yīng)用兩種方法檢測(cè)豬、牛的符合率略低，但對(duì)于結(jié)果不一致的樣品，其LPB-ELISA 抗體效價(jià)均在陽性判定標(biāo)準(zhǔn)的±1 滴度以內(nèi)，屬于正常誤差范圍。因LPB-ELISA 對(duì)操作要求較高，其準(zhǔn)確性受多種因素影響，當(dāng)樣品抗體水平剛好處于臨界值附近時(shí)，較易出現(xiàn)與SPC-ELISA 結(jié)果不符合的情況。之所以兩種方法檢測(cè)不同畜種的符合率有所差別，可能與樣品質(zhì)量有關(guān)。ELISA 對(duì)血清樣品質(zhì)量要求較高，溶血、嚴(yán)重混濁或被細(xì)菌污染等都可能產(chǎn)生非特異性顯色，影響檢測(cè)結(jié)果[3]。從外觀上看，此次抽檢的羊血清樣品無溶血，質(zhì)量好，兩種檢測(cè)方法得到的結(jié)果完全一致；而豬、牛有部分血清樣品溶血嚴(yán)重、質(zhì)量差，可能導(dǎo)致兩種方法得到的結(jié)果有所出入，符合率相對(duì)低一點(diǎn)。

4 結(jié)論

應(yīng)用SPC-ELISA 定性檢測(cè)和LPB-ELISA 定量檢測(cè)FMDV 抗體，符合率高，結(jié)果高度一致。在實(shí)際工作中，可以根據(jù)具體需要，任意選擇其中一種合適的方法進(jìn)行檢測(cè)，但均需保證樣品質(zhì)量。