趙朋寬

（南樂縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河南南樂 457400）

犢牛腹瀉是危害養(yǎng)牛業(yè)的主要疾病之一，臨床中尤以細(xì)菌性腹瀉最為常見，如大腸桿菌、沙門氏菌、巴氏桿菌、奇異變形桿菌等引起的腹瀉，其中沙門氏菌和大腸桿菌危害最嚴(yán)重[1-3]。犢牛大腸桿菌病由不同血清型的致病性大腸桿菌引起，臨床以腹瀉、脫水、消瘦為主，呈地方性或散發(fā)性流行，10 日齡以內(nèi)犢牛最易感，發(fā)病率和死亡率均較高，嚴(yán)重影響牛養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展[4-6]。相關(guān)研究[7-8]表明，大腸桿菌抗原結(jié)構(gòu)復(fù)雜，具有多種致病性血清型且無交叉保護(hù)性，無有效疫苗預(yù)防其感染，導(dǎo)致大腸桿菌病廣泛發(fā)生與流行。細(xì)菌生物被膜（bacterial biofilm，BBF）是組成結(jié)構(gòu)性細(xì)菌群落的主要物質(zhì)，其形成能力與細(xì)菌毒力及耐藥性具有一定相關(guān)性[9]。當(dāng)前，犢牛大腸桿菌病主要用抗生素進(jìn)行治療，而抗生素的濫用，致使大腸桿菌耐藥性增強(qiáng)，且出現(xiàn)了多重耐藥菌株，因而加大了該病的治療難度，同時大腸桿菌的耐藥性和藥物殘留問題也威脅著人類健康[10-11]。

本試驗采集243 份腹瀉犢牛的肛拭子、糞便、肝臟等病料樣品進(jìn)行大腸桿菌分離鑒定，然后對致病性大腸桿菌進(jìn)行致病性、血清型、生物被膜形成能力及耐藥性等相關(guān)生物學(xué)特性檢測，以期為該地區(qū)犢牛大腸桿菌性腹瀉防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

從2018—2020 年采集的243 份腹瀉犢牛肛拭子、糞便、肝臟等病料樣品中進(jìn)行大腸桿菌分離鑒定，其中肛拭子樣品96 份、糞便樣品86 份、肝臟樣品61 份。

1.2 主要材料

麥康凱培養(yǎng)基、96 孔細(xì)菌培養(yǎng)板、大腸桿菌顯色培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯，購自北京雙旋微生物培養(yǎng)基制備科技公司；藥物紙片，購自杭州天和微生物制劑有限公司；細(xì)菌生化試紙條，購自上海研晶生物科技有限公司；大腸桿菌O 抗原鑒定因子，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；460 只體質(zhì)量（25±2）g的昆明系小白鼠，購自北京維通利華實驗動物有限公司。

1.3 細(xì)菌分離與培養(yǎng)

對腹瀉犢牛樣品處理后，無菌接種于麥康凱培養(yǎng)基進(jìn)行鑒別培養(yǎng)；37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h 后，挑取單個菌落接種于大腸桿菌顯色培養(yǎng)基；37 ℃培養(yǎng)12～18 h，再挑取單個菌落接種于營養(yǎng)肉湯純化培養(yǎng)，然后進(jìn)行鏡檢和生化試驗。

1.4 致病性試驗

參考文獻(xiàn)[12]的方法，將分離菌株接種于營養(yǎng)肉湯中，200 r/min 37 ℃震蕩培養(yǎng)2～4 h 至對數(shù)期，用平板計數(shù)法進(jìn)行菌落計數(shù)；調(diào)整菌液濃度為107cfu/mL，每株分離菌株灌服4 只昆明系小鼠，劑量為0.25 mL，對照組給予等量的無菌生理鹽水。試驗期為7 d，試驗期間觀察小鼠發(fā)病情況，對死亡小鼠進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定。

1.5 細(xì)菌血清型檢測

參考文獻(xiàn)[7]方法，將分離菌株接種于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)斜面上，37 ℃培養(yǎng)12 h 后取出，在無菌條件下用無菌生理鹽水洗脫滅菌管，121 ℃滅菌3 h，破壞分離菌株K 抗原、O 抗原鑒定因子后進(jìn)行玻板凝集試驗，用5%石碳酸作對照，對分離菌株進(jìn)行血清型檢測。

1.6 細(xì)菌生物被膜形成能力檢測

參考文獻(xiàn)[13]方法，在96 孔細(xì)菌培養(yǎng)板，加入190 μL 普通營養(yǎng)肉湯，然后接種10 μL 菌液，對照孔加200 μL 營養(yǎng)肉湯，37 ℃培養(yǎng)18 h；用PBS 洗滌3 次，用甲醛固定20 min；加入結(jié)晶紫染色5 min，PBS 洗滌烘干；每孔加入200 μL 95%乙醇洗脫30 min，用酶標(biāo)儀測OD600，對分離菌株進(jìn)行被膜形成能力測定。判定標(biāo)準(zhǔn)以陰性對照孔OD 的2 倍作為判斷能否形成被膜的臨界點ODc。當(dāng)OD=ODc 時，表示被膜形成能力為0；當(dāng)OD ＜ODc 時，表示被膜形成能力較弱；當(dāng)ODc ＜OD ≤2ODc 時，表示被膜形成能力中等；當(dāng)OD ≥2ODc 時，表示被膜形成能力較強(qiáng)。

1.7 藥敏試驗

參照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（CLSI）2013 年推薦的標(biāo)準(zhǔn)藥敏試驗法[14]進(jìn)行操作和試驗結(jié)果判斷。將分離菌株培養(yǎng)至對數(shù)期，調(diào)整菌液濃度為107cfu/mL，無菌條件下取100 μL 菌液均勻涂布在90 mm普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，貼上藥敏紙片，每種藥做3 個重復(fù)；37 ℃培養(yǎng)18 h 后，測定抑菌圈直徑，取平均值。藥物敏感性標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 常用藥物的藥敏試驗判定標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)

經(jīng)麥康凱培養(yǎng)基、大腸桿菌顯色培養(yǎng)基培養(yǎng)及鏡檢，從采集的243 份樣品中分離到113 株符合大腸桿菌培養(yǎng)特性和形態(tài)學(xué)的細(xì)菌。

2.2 細(xì)菌生化試驗

參照細(xì)菌生化試紙條說明書，對分離的疑似大腸桿菌菌株進(jìn)行生化試驗，結(jié)果分離的113 株細(xì)菌全部被鑒定為大腸桿菌，大腸桿菌平均分離率為46.5%（113/243），其中肛拭子樣品的分離率為43.8%，糞便樣品為45.3%，肝臟樣品為52.5%（表2）。

表2 不同病料樣品中的大腸桿菌分離情況

2.3 致病性試驗

攻毒組小鼠在攻毒后2～4 d 出現(xiàn)發(fā)病情況，個別小鼠出現(xiàn)急性死亡。剖檢死亡小鼠發(fā)現(xiàn)，腸道出血，腸黏膜脫落，肝、脾出現(xiàn)不同程度出血，且均分離到大腸桿菌，而對照組小鼠健康存活。經(jīng)統(tǒng)計，引起小鼠發(fā)病的有9 株大腸桿菌，引起死亡的有78 株（表3），表明引起小鼠發(fā)病和死亡的87株大腸桿菌為致病性大腸桿菌。

表3 大腸桿菌致病性試驗結(jié)果

2.4 血清型檢測

用玻板凝集試驗對分離的87 株致病性大腸桿菌進(jìn)行血清鑒定。結(jié)果（表4）顯示：分離的致病性大腸桿菌分屬于14 種血清型，分布在不同樣品中，其中O101（18.4%）、O38（17.2%）和O142（14.9%）型占比較高，為該地區(qū)致犢牛腹瀉的優(yōu)勢血清型。

表4 分離的致病性大腸桿菌血清型分布

2.5 生物被膜形成能力檢測

分離的87 株犢牛源致瀉性大腸桿菌中，膜形成能力較強(qiáng)的24株（26.6%），中等的34株（43.6%），較弱的17株（19.5%），不形成被膜的12株（15.4%），不同生物被膜形成能力的菌株分布在不同血清型中（表5）。

表5 分離的致病性大腸桿菌血清型和生物被膜形成能力相關(guān)性分析結(jié)果

2.6 藥敏試驗

藥敏試驗結(jié)果（表6）顯示：分離的87 株致病性大腸桿菌對阿莫西林、氨芐西林、鏈霉素等6種藥物的耐藥率較高，為77.0%～98.9%，其次是對新霉素、慶大霉素、大觀霉素等4 種藥物，耐藥率為49.4%～52.9%；對頭孢噻呋、頭孢噻肟、氟苯尼考等7 種藥物的耐藥率較低，為9.2%～26.4%。

表6 藥敏試驗結(jié)果

3 討論

國內(nèi)外研究[15-16]表明，大腸桿菌是引起犢牛腹瀉的主要的病原菌之一，引起的發(fā)病率和死亡率較高，對犢牛危害較大，嚴(yán)重影響?zhàn)B牛業(yè)發(fā)展。大腸桿菌為條件性致病菌，廣泛存在于環(huán)境中，尤其是衛(wèi)生較差的牛舍，當(dāng)發(fā)生冷熱等外在因素應(yīng)激時，機(jī)體抵抗力下降，繼而引起大腸桿菌病，因此，注意環(huán)境衛(wèi)生及環(huán)境消毒也是有效防控大腸桿菌病的重要措施。致病性大腸桿菌在我國廣泛分布，因此應(yīng)做好控制，降低該疾病發(fā)病率[17-18]。本研究從濮陽市243 份腹瀉犢牛病料中分離到87 株致病性大腸桿菌，分離率為35.8%，說明致病性大腸桿菌可能在該地呈地方性流行。大腸桿菌血清型多樣化，同一宿主不同地區(qū)，其優(yōu)勢血清型分布也存在一定差異。吳孟等[19]報道，巴州地區(qū)犢牛腹瀉大腸桿菌血清型以O(shè)78、O111 為主；史量全等[20]報道，內(nèi)蒙古地區(qū)犢牛腹瀉大腸桿菌血清型主要為O132 型；高?；鄣萚11]報道，寧夏地區(qū)犢牛腹瀉大腸桿菌的優(yōu)勢血清型是O20 和O26。而本研究發(fā)現(xiàn)，濮陽市犢牛致病性大腸桿菌優(yōu)勢血清型為O38（17.2%）、O101（18.4%）和O142（14.9%）。因此，各地應(yīng)根據(jù)當(dāng)?shù)氐膬?yōu)勢血清型研制相應(yīng)血清型的疫苗，如濮陽市可以研制O38、O101 和O142血清型多價疫苗。本研究為研制該地區(qū)犢牛腹瀉性大腸桿菌疫苗提供了參考。

研究[8-9]表明，細(xì)菌生物被膜可以抵抗外界不利環(huán)境因素，其形成是細(xì)菌的一種自我保護(hù)機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)，分離的87 株致病性大腸桿菌中，膜形成能力強(qiáng)的 24 株，中等的34 株，占66.7%。張召興等[13]報道，河北省蛋雞源大腸桿菌具有生物被膜形成能力；麻海瀾等[18]報道，內(nèi)蒙古地區(qū)犢牛源大腸桿菌具有生物被膜形成能力。綜合上述報道與本研究結(jié)果，說明各地的致病性大腸桿菌外界生存能力均較強(qiáng)。因此，在養(yǎng)殖過程中，對于環(huán)境消毒，可考慮不同種類消毒藥交替使用，以減少環(huán)境中大腸桿菌對消毒藥的耐藥性。

在臨床防治大腸桿菌病過程中，不合理使用抗菌藥物現(xiàn)象較多，導(dǎo)致大腸桿菌出現(xiàn)較強(qiáng)的耐藥性，且耐藥性在不同菌株之間傳播，導(dǎo)致大腸桿菌耐藥性加重[4-5]。麻海瀾等[18]報道，內(nèi)蒙古地區(qū)分離的51 株犢牛源大腸桿菌對甲氧芐啶、磺胺嘧啶、氨芐西林等20 種藥物產(chǎn)生耐藥性；高海慧等[11]報道，寧夏地區(qū)犢牛腹瀉大腸桿菌的耐藥率高，多重耐藥普遍，耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重；石凱元等[21]報道，湘西北地區(qū)某肉牛養(yǎng)殖場犢牛腹瀉性大腸桿菌對22種藥物產(chǎn)生了耐藥性。本研究發(fā)現(xiàn)，分離的87 株致病性大腸桿菌對阿莫西林、氨芐西林、鏈霉素等10 種藥物的耐藥率較高，均在49.4%以上。上述研究結(jié)果說明，犢牛腹瀉性大腸桿菌耐藥性普遍，應(yīng)該引起重視。不同地區(qū)的大腸桿菌耐藥譜并不相同，這可能與不同地區(qū)使用的抗生素種類不同有關(guān)。因此，在臨床治療犢牛腹瀉大腸桿菌病過程中應(yīng)注意抗生素的合理使用，結(jié)合藥敏試驗科學(xué)用藥。