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        2022 年鄂西地區(qū)PRRSV ORF5 基因遺傳進(jìn)化分析

        2022-12-09 10:07:04歐陽艷劉發(fā)志王孝忠李祚丹熊同舟杜建豐
        中國動(dòng)物檢疫 2022年12期
        關(guān)鍵詞:檢測

        歐陽艷,劉發(fā)志,王孝忠,李祚丹,熊同舟,杜建豐

        (1.湖北三峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院,湖北宜昌 443000;2.宜昌市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,湖北宜昌 443000;3.宜昌正大畜牧有限公司,湖北宜昌 443000)

        豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)是引發(fā)豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)的病原。目前,在全球范圍內(nèi),除瑞士等少數(shù)國家沒有暴發(fā)PRRS 疫情外,其他國家的養(yǎng)豬業(yè)都深受其害[1]。豬感染PRRSV 后表現(xiàn)厭食、發(fā)熱、耳發(fā)紺、流鼻涕等癥狀,母豬感染后在懷孕110 d 左右可發(fā)生流產(chǎn),產(chǎn)弱胎、死胎或木乃伊胎,產(chǎn)出的弱胎也會(huì)很快死亡[2-4]。

        PRRSV 屬于RNA 病毒,其結(jié)構(gòu)蛋白GP5 是重要的保護(hù)性抗原蛋白,具有高度變異性,因此GP5 蛋白編碼基因開放閱讀框ORF5 常被用于遺傳變異分析[5]。為了解鄂西地區(qū)PRRSV 的遺傳變異情況,本研究對2022年采自該地區(qū)的672份豬血液、肺臟組織等樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 檢測,并對部分陽性樣品進(jìn)行ORF5 基因序列遺傳進(jìn)化分析,以期為鄂西地區(qū)PRRS 防控提供參考。

        1 材料和方法

        1.1 材料

        1.1.1 主要試劑 PRRSV 通用型實(shí)時(shí)熒光RTPCR 檢測試劑盒,購自元亨生物藥業(yè)有限公司;DNA/RNA核酸提取試劑盒,購自天隆科技有限公司。

        1.1.2 主要儀器設(shè)備 高速組織勻漿機(jī)(TissueLyser LT),德國凱杰公司產(chǎn)品;渦旋震蕩儀(Mx-S)、賽洛捷克公司產(chǎn)品;高速冷凍離心機(jī)(Centriguge 5417R),德國艾本德公司產(chǎn)品;Ⅱ級生物安全柜(AC2-4S1),新加坡藝思高科技有限公司產(chǎn)品;熒光定量 PCR 擴(kuò)增儀(LightCycler 96),德國羅氏診斷公司產(chǎn)品;生化培養(yǎng)箱(SPX-250B-Z),上海博訊實(shí)驗(yàn)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品;醫(yī)用冷藏箱(HYC-940),青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司產(chǎn)品;核酸提取儀(NP968),西安天隆科技有限公司產(chǎn)品。

        1.2 方法

        1.2.1 病料采集和處理 在鄂西地區(qū)采集疑似PRRS 發(fā)病豬血液、肺臟組織等樣品共672 份,其中伍家崗區(qū)、夷陵區(qū)、興山縣、長陽自治縣(簡稱長治縣)、猇亭區(qū)、五峰自治縣(簡稱五峰縣)、恩施市7 個(gè)縣(市、區(qū))的血液、肺組織樣品采自小規(guī)模育肥豬場,枝江市的血液、肺組織樣品采自規(guī)模化種豬場。組織樣品剪碎混勻后,加生理鹽水充分勻漿,高速離心后,取上清液用于RNA 提取;血液樣品采集后先放置在37 ℃生化培養(yǎng)箱中2 h,然后轉(zhuǎn)移至4 ℃冰箱過夜,待血清析出后無菌分裝,用于RNA 提?。豢鼓獦悠坊靹蚝笾苯佑糜赗NA提取。

        1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成 使用歐陽艷等[6]設(shè)計(jì)的針對Nsp2基因的引物和1 對檢測并擴(kuò)增完整ORF5 基因序列的引物(表1)進(jìn)行擴(kuò)增。

        表1 本研究使用的引物

        1.2.3 RNA 提取與實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 檢測 用DNA/RNA 核酸提取試劑盒提取病毒總RNA,再使用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 檢測試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。PCR 反應(yīng)體系25.0 μL:無菌無核酸酶水5.0 μL、RT-PCR 反應(yīng)液12.5 μL、酶混合液1.0 μL、熒光探針4.5 μL、模板RNA 2.5 μL。PCR 反應(yīng)程序:42 ℃5 min,95 ℃變性10 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 35 s,40個(gè)循環(huán),在每個(gè)循環(huán)第二步(60 ℃ 35 s)收集熒光信號。報(bào)告基團(tuán)FAM,淬滅基團(tuán)NONE。結(jié)束后根據(jù)樣品Ct 大小及擴(kuò)增曲線形成情況判定結(jié)果[7-8]。

        1.2.4 ORF5 基因擴(kuò)增與測序 將陽性樣品用病毒核酸提取試劑盒提取RNA 后進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增,將反應(yīng)產(chǎn)物送擎科生物工程有限公司進(jìn)行序列測定。

        1.2.5 ORF5 基因遺傳進(jìn)化分析 應(yīng)用DNAstar軟件對測序獲取的ORF5 基因序列與參考毒株序列進(jìn)行比對分析,利用Clustal 2.1 和Mega-7.0 軟件,基于Neighbor-Joining 運(yùn)算法,繪制遺傳進(jìn)化樹[6]。參考毒株的背景信息見表2。

        表2 參考毒株信息

        2 結(jié)果與分析

        2.1 臨床樣品RT-PCR 檢測

        2022 年,共收集檢測來自鄂西地區(qū)8 個(gè)縣(市、區(qū))的血液、肺組織等樣品672 份,使用PRRSV 實(shí)時(shí)熒光 RT-PCR 試劑盒檢測。結(jié)果(表3、圖1)顯示:33 份樣品為PRRSV 陽性,陽性檢出率為5%;使用歐陽艷等[6]設(shè)計(jì)的針對Nsp2基因引物進(jìn)行分類,其中高致病性毒株(HP-PRRSV)23 份,占69.7%,分布于伍家崗區(qū)、夷陵區(qū)、興山縣、長陽縣、猇亭區(qū)等5 個(gè)縣(區(qū)),是鄂西地區(qū)主要流行毒株;類NADC30 毒株(NADC30-like PRRSV)10 份,占30.3%,分布于興山縣、長陽縣、枝江市、猇亭區(qū)等4 個(gè)縣(市、區(qū)),是次要流行毒株。

        圖1 PRRSV Nsp2 基因部分片段擴(kuò)增結(jié)果

        表3 2022 年病料檢測結(jié)果

        2.2 ORF5 基因同源性分析

        本研究共擴(kuò)增獲得4 份陽性樣品(2022YCLPFA、2022YCLPFA1、2022YCYZD、2022 YCZDBLZ)ORF5基因序列,其中2022YCLPFA、2022YCLPFA1采自長陽縣,2022YCYZD采自夷陵區(qū),2022YCZDBLZ 采 自枝江市。與參考毒株序列經(jīng)同源性比對分析發(fā)現(xiàn):4 份陽性樣品間的ORF5 基因序列同源性為81.4%~98.5%,其與HP-PRRSV代表株JXA1同源性為80.3%~95.9%,與NADC30-like PRRSV代表株HENAN-XINX 同源性為80.8%~81.6%,與經(jīng)典PRRSV 代表株VR-2332 同源性為80.3%~84.7%(圖2)。

        圖2 ORF5 基因序列之間同源性分析結(jié)果

        2.3 ORF5 序列遺傳進(jìn)化樹分析

        由圖3可知:2022YCLPFA(長陽)、2022YCLPFA1(長陽)、2022YCYZD(夷陵)3份陽性樣品ORF5 序列與JXA1、TJ-M 在同一分支(Lineage 8.7),屬于HP-PRRSV;2022YCZDBLZ(枝江)樣 品 與ZJ1407、JL580、HENAN-XINX、NADC30LIKEXD-HN-004 遺傳關(guān)系較近,在同一分支(Lineage 1.9),屬于類NADC30 毒株。

        圖3 PRRSV ORF5 基因進(jìn)化樹

        2.4 GP5 蛋白氨基酸序列分析

        經(jīng)序列比對分析,GP5 蛋白氨基酸序列高變區(qū),在誘騙表位(27~30 aa)出現(xiàn)29G →29C;在中和表位,HP-PRRSV 毒株出現(xiàn)氨基酸替換39A →39T,類NADC30 毒株出現(xiàn)38A →38T(圖4)。

        3 討論

        本研究共檢測了來自鄂西地區(qū)8 個(gè)縣(市、區(qū))的672 份病料樣品,發(fā)現(xiàn)PRRSV 陽性檢出率為5%。其中:HP-PRRSV 陽性樣品占69.7%,來自于伍家崗區(qū)、夷陵區(qū)、興山縣、長陽縣、猇亭區(qū)等5 個(gè)縣(市、區(qū)),可能是鄂西地區(qū)的主要流行毒株;類NADC30 陽性樣品占30.3%,來自于興山縣、長陽縣、枝江市、猇亭區(qū)等4 個(gè)縣(市、區(qū)),可能是鄂西地區(qū)的次要流行毒株。從上述結(jié)果可以看出,長陽縣、興山縣、猇亭區(qū)等地存在2 個(gè)毒株的混合流行,因此各場疫苗接種時(shí)要先進(jìn)行檢測,一定要選擇與本場流行毒株匹配的疫苗,否則會(huì)導(dǎo)致免疫失敗。

        本研究獲得4 份陽性樣品的ORF5 基因序列同源性為81.4%~98.5%,其與HP-PRRSV代表株JXA1同源性為80.3%~95.9%,與NADC30-like PRRSV代表株HENAN-XINX同源性為80.8%~81.6%,與經(jīng)典PRRSV 代表株VR-2332 同源性為80.3%~84.7%,說明鄂西地區(qū)流行毒株的ORF5 基因序列正在發(fā)生一些新的變化。

        自1996 年郭寶清等[9]首次分離到PRRSV CH-1a毒株以來,Lineage8.7分支PRRSV 在我國已流行20 多年。通過遺傳進(jìn)化分析可知,本研究獲得的2022YCLPFA、2022YCLPFA1、2022YCYZD 3 份陽性樣品ORF5 序列與毒株JXA1、TJ-M在同一分支(Lineage 8.7),屬于HP-PRRSV 毒 株;2022YCZDBLZ 與JL580、HENAN-XINX 遺傳關(guān)系較近,在同一分支(Lineage 1.9),屬于NADC30-like PRRSV 毒株。Lineage 1.9 分支PRRSV 自2013 年以來也在我國廣泛流行,并不斷發(fā)生變異和重組[10]。我國先后研制了經(jīng)典株滅活疫苗、高致病性毒株減毒活疫苗等商品化疫苗,雖然在控制PRRS 大規(guī)模暴發(fā)方面發(fā)揮了一定作用,但PRRSV 易變異,類NADC30 毒株也開始廣泛流行,因而期待更為安全有效,特別是針對類NADC30 毒株的疫苗盡早問世。

        研究[11]表明,GP5 蛋白上存在的中和抗原位點(diǎn)與免疫保護(hù)有關(guān)。本研究獲得的4 份PRRSV GP5 氨基酸序列與參考毒株比對,在誘騙表位(27~30 aa)發(fā)現(xiàn)氨基酸替換29G →29C,在中和表位,HP-PRRSV 毒株出現(xiàn)氨基酸替換39A →39T,類NADC30 毒株出現(xiàn)38A →38T。這些變異有可能會(huì)影響機(jī)體中和抗體的產(chǎn)生,但需進(jìn)一步研究。

        綜上所述,鄂西地區(qū)存在HP-PRRSV 和NADC30-like PRRSV 兩種毒株的流行,并且其GP5 蛋白氨基酸序列已發(fā)生了多個(gè)變異,有可能會(huì)影響疫苗的免疫保護(hù)效果。建議持續(xù)加強(qiáng)監(jiān)測,一定要選擇與本場流行毒株匹配的疫苗進(jìn)行免疫。

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