梁競(jìng)臻，王翠，覃艷然，周師師，許宗麗，馬小蓉，盧軍，黃小武，李志源，嚴(yán)斯剛

（柳州市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣西柳州 545005）

高致病性禽流感（highly pathogenic avian influenza，HPAI）是由正黏病毒科流感病毒屬 A型流感病毒引起的一種烈性禽類傳染病[1]。HPAI是我國規(guī)定的一類動(dòng)物疫病，其暴發(fā)不僅給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，還會(huì)對(duì)人體健康、公共衛(wèi)生安全帶來嚴(yán)重威脅。HPAI 目前主要由H5 和H7亞型高致病性禽流感病毒（highly pathogenic avian influenza virus，HPAIV）引起[2]。HPAIV 易感動(dòng)物種類很多，包括雞、鴨、鵝等家禽，野鴨、天鵝、雁等野禽，以及部分哺乳動(dòng)物。水禽尤其是鴨、鵝被認(rèn)為是流感病毒的天然儲(chǔ)存庫和傳染源[3]。而我國是世界上最大的水禽生產(chǎn)國，因此監(jiān)測(cè)我國鴨場(chǎng)中HPAIV 流行情況意義重大。

肉鴨產(chǎn)業(yè)是我國傳統(tǒng)特色產(chǎn)業(yè)，鴨肉也是居民日常生活中不可或缺的肉類。隨著養(yǎng)鴨行業(yè)的集約化、規(guī)模化發(fā)展，“公司+基地+農(nóng)戶”模式的規(guī)模養(yǎng)殖逐漸成為主流。近年來，新模式下的規(guī)模肉鴨養(yǎng)殖業(yè)已成為柳州市農(nóng)業(yè)及農(nóng)村經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要支柱產(chǎn)業(yè)之一，也是農(nóng)民增收的重要途徑之一。我國對(duì)HPAI 實(shí)行H5+H7 三價(jià)滅活疫苗強(qiáng)制免疫制度，要求抗體合格率保持在70%以上，但該模式下有關(guān)廣西地區(qū)規(guī)模肉鴨養(yǎng)殖場(chǎng)HPAI 免疫效果和帶毒情況鮮有報(bào)道。為加強(qiáng)HPAI 防控，更好地了解柳州市轄區(qū)內(nèi)規(guī)模化養(yǎng)殖環(huán)境下肉鴨的H5、H7 亞型HPAIV 免疫抗體水平和流行情況，2021年采集轄區(qū)范圍內(nèi)各縣區(qū)規(guī)模肉鴨養(yǎng)殖場(chǎng)的血清和喉頭/泄殖腔棉拭子樣品進(jìn)行檢測(cè)，以期掌握本地區(qū)肉鴨群體中HPAI 免疫情況和病毒流行趨勢(shì)，為下一步禽流感防控工作提供依據(jù)。

1 材料

1.1 主要試劑

禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）H5亞型（H5N1 Re-11/Re-12 株）血凝抑制試驗(yàn)抗原，購自哈爾濱維科生物技術(shù)有限公司；H7亞型（H7N9 Re-3 株）血凝抑制試驗(yàn)抗原以及標(biāo)準(zhǔn)陰陽性血清，購自哈爾濱國生生物科技股份有限公司；H5、H7亞型AIV 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 檢測(cè)試劑盒，購自哈爾濱元亨生物藥業(yè)有限公司；病毒DNA/RNA 提取試劑盒（4.0），購自西安天隆科技有限公司。

1% SPF 雞紅細(xì)胞，按照《高致病性禽流感診斷技術(shù)》（GB/T 18936—2020）[5]配制。

1.2 主要儀器

10～1 000 μL 單道移液器及25～200 μL 微量移液器，購自德國Eppendorf 公司；96 孔V 型反應(yīng)板，購自廣西南寧神九生物制品有限責(zé)任公司；MicroFill 微孔板分液器，購自德國BioTek 公司；MM-2 型微量振蕩器，購自江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠；NPA-32P 自動(dòng)核酸純化儀，購自杭州博日科技有限公司；LightCycler96 熒光PCR 儀，購自瑞士Roche 公司。

1.3 樣品來源

2021 年，柳州市共有規(guī)模肉鴨養(yǎng)殖場(chǎng)183 個(gè)，總存欄約381.06 萬羽。對(duì)全市部分肉鴨規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)（存欄1 000 只以上，重點(diǎn)是快大型肉鴨），在第一季度3 月底前、第二季度5 月底前、第三季度9 月底前和第四季度11 月底前，各進(jìn)行1 次集中采樣檢測(cè)。采用配額抽樣方法[4]，每個(gè)縣區(qū)按要求選取轄區(qū)內(nèi)不少于25%的肉鴨規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)（不重復(fù)抽樣，盡量確保全年全覆蓋，根據(jù)每季度區(qū)域內(nèi)養(yǎng)殖情況適時(shí)調(diào)整數(shù)量），每季度采集樣品均為同一批次免疫HPAI 三價(jià)疫苗后21 d 的肉鴨樣品。依據(jù)國家和自治區(qū)動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)與流行病學(xué)調(diào)查計(jì)劃，每個(gè)規(guī)模場(chǎng)采集血清樣品不少于30 份，喉頭/泄殖腔棉拭子不少于5 份。樣品采集由各縣區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心實(shí)施，詳情見表1。

表1 柳州市各縣區(qū)規(guī)模肉鴨養(yǎng)殖場(chǎng)養(yǎng)殖情況及樣品采集信息統(tǒng)計(jì)

2 方法

2.1 免疫效果監(jiān)測(cè)

2.1.1 免疫抗體檢測(cè) 通過血凝抑制試驗(yàn)（HI）測(cè)定H5 亞型（H5N1 Re-11/Re-12 株）和H7 亞型（H7N9 Re-3 株）HA 抗原效價(jià)，根據(jù)抗原效價(jià)配置四單位病毒，通過血凝抑制試驗(yàn)（HI）檢測(cè)肉鴨血清中的免疫抗體滴度。具體操作方法參照《高致病性禽流感診斷技術(shù)》（GB/T 18936—2020）[5]。

2.1.2 結(jié)果判定 血清樣品HI 效價(jià)≥4.00log2，判為陽性；HI 效價(jià)＜4.00log2，判為陰性。標(biāo)準(zhǔn)陰性血清對(duì)照孔滴度≤2.00log2，標(biāo)準(zhǔn)陽性對(duì)照血清抗體效價(jià)與已知效價(jià)誤差不超過1 個(gè)滴度，試驗(yàn)結(jié)果成立。

2.1.3 數(shù)據(jù)分析 通過WPS Excel 軟件和SPSS 19.0 軟件對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、統(tǒng)計(jì)和分析。運(yùn)用卡方檢驗(yàn)分析H5 和H7 亞型免疫抗體合格率在不同區(qū)域和不同季度間的差異，P＞0.05 表示差異不顯著，P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。

2.2 感染情況監(jiān)測(cè)

2.2.1 病原檢測(cè) 按病毒DNA/RNA 提取試劑盒說明書提取核酸后，參照檢測(cè)試劑盒使用說明書配制H5、H7 亞型實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 反應(yīng)體系，通過熒光PCR 儀的循環(huán)反應(yīng)，擴(kuò)增特異片段。

2.2.2 結(jié)果判定 陽性對(duì)照Ct ≤30 并出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線，陰性對(duì)照無Ct 值并且無特異性擴(kuò)增曲線，試驗(yàn)結(jié)果成立。被檢樣品Ct ≤30 并出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線，判為陽性；被檢樣品Ct ≥37，判為陰性；被檢樣品30 ＜Ct ＜37 并出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線，需重新抽樣提取核酸，擴(kuò)增后再進(jìn)行結(jié)果判定，如仍是可疑，可判為陽性。

3 結(jié)果與分析

3.1 總體情況

2021 年，共檢測(cè)151 家肉鴨規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)，采集4 540 份血清樣品進(jìn)行H5、H7 亞型免疫抗體檢測(cè)，檢出H5 亞型免疫抗體合格樣品3 472 份，免疫合格率為76.48%，平均滴度為5.52log2；檢出H7 亞型免疫抗體合格樣品3 087 份，免疫合格率為68.00%，平均滴度為4.20log2。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，H5 亞型免疫抗體總合格率極顯著高于H7 亞型（P＜0.01）。檢測(cè)病原學(xué)樣品803 份，結(jié)果均為陰性。

3.2 不同縣區(qū)情況

不同縣區(qū)的抗體檢測(cè)結(jié)果（表2）顯示：H5、H7 亞型免疫抗體合格率在不同區(qū)域間存在一定差異，縣級(jí)地區(qū)的H5、H7 亞型免疫抗體總合格率均顯著高于城區(qū)（P＜0.01）。H5 亞型免疫抗體合格率，E 縣最高（P＜0.01），其次為D 縣和H 區(qū)，J 區(qū)最低（P＜0.05）；H7 亞型免疫抗體合格率，H 區(qū)最高（P＜0.05），其次為E 縣和D 縣，G 區(qū)最低（P＜0.05）。各縣區(qū)的H5 亞型平均抗體滴度為（3.72～8.50）log2，H7 亞型為（2.58～6.71）log2，均為E 縣最高?？贵w合格率和平均滴度未完全呈正相關(guān)關(guān)系，如某些地區(qū)合格率雖然未達(dá)70%以上，但其平均滴度大于4.00log2。

表2 柳州市各縣區(qū)免疫抗體檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

3.3 不同季度情況

3.3.1 抗體合格率 如表3、圖1 所示，各季度不同縣區(qū)規(guī)模場(chǎng)肉鴨的禽流感免疫抗體水平存在差異。H5 亞型免疫合格率，第二季度最高（P＜0.05），第三季度最低（P＜0.01），其中第一、二、四季度抗體總合格率均達(dá)到70.00%以上，而第三季度未達(dá)到70.00%；H7 免疫合格率，第四季度最高（P＜0.01），第一季度最低，抗體合格率呈逐漸上升趨勢(shì)，其中僅第四季度達(dá)到70.00% 以上。綜合分析發(fā)現(xiàn)，禽流感抗體合格率依次為第四季度＞第二季度＞第一季度＞第三季度。通過變異系數(shù)可看出，抗體合格率越高，離散程度越低。

表3 柳州市各縣區(qū)不同季度免疫抗體結(jié)果統(tǒng)計(jì)

圖1 不同季度免疫抗體合格率分布

3.3.2 平均抗體滴度 如表4～5 所示，不同縣區(qū)各季度禽流感平均抗體滴度均呈現(xiàn)不同幅度的波動(dòng)，其中H5 亞型平均滴度為（2.56～9.62）log2，H7 亞型為（1.97～9.17）log2。H5 亞型平均滴度第二季度最高，第三季度最低，H7 亞型第四季度最高。H5、H7 亞型抗體最高平均滴度均來自E 縣，D縣各季度的平均抗體滴度均大于4.00log2。各縣區(qū)不同季度的合格抗體滴度多數(shù)處于（4.00～7.00）log2。

表4 不同季度平均免疫抗體滴度統(tǒng)計(jì) 單位：log2

4 討論

目前，疫苗免疫是預(yù)防禽流感的經(jīng)濟(jì)、有效途徑，而抗體檢測(cè)是評(píng)價(jià)疫苗免疫效果的主要方法，也是免疫水平監(jiān)測(cè)的重點(diǎn)。禽流感病毒變異快，因此及時(shí)掌握HPAIV 的變化情況至關(guān)重要[6]。此次監(jiān)測(cè)將抗體檢測(cè)與病原學(xué)檢測(cè)有機(jī)結(jié)合，旨在進(jìn)一步確保監(jiān)測(cè)的整體準(zhǔn)確性[7]。

表5 免疫合格抗體平均滴度比例分布 單位：%

從總體檢測(cè)情況來看，H5 亞型免疫抗體總合格率達(dá)到70.00%以上，H7 亞型免疫抗體總合格率略低于70.00%，說明本地區(qū)肉鴨群體的禽流感整體免疫效果良好，但仍有很大的提升空間。本次監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，H5 亞型免疫抗體總合格率極顯著高于H7亞型，這與張輝等[8]、牟愛生等[9]的研究結(jié)果相符，說明H5 亞型疫苗免疫原性更佳，也可能與水禽自身機(jī)體相關(guān)[10]。本地區(qū)規(guī)模肉鴨養(yǎng)殖場(chǎng)中未檢測(cè)出H5、H7 亞型禽流感病毒，說明HPAIV（H5+H7）三價(jià)滅活疫苗強(qiáng)制免疫政策有效防控了H5、H7 亞型禽流感病毒的侵襲，免疫屏障得到了有效建立，從而增強(qiáng)了動(dòng)物抵御疫病的能力。因此，在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)不斷加強(qiáng)肉鴨群體的禽流感免疫監(jiān)測(cè)，進(jìn)一步提高其免疫抗體水平，強(qiáng)化免疫屏障。

從不同區(qū)域來看，各縣區(qū)肉鴨規(guī)模場(chǎng)的免疫抗體水平差異較大，存在免疫效果不平衡現(xiàn)象，個(gè)別縣區(qū)抗體水平離散程度偏大，且群體免疫合格情況存在不穩(wěn)定性。這一方面可能與養(yǎng)殖場(chǎng)的養(yǎng)殖模式、人員操作以及免疫時(shí)間、次數(shù)和方法等有關(guān)，另一方面可能與不同廠家的重組H5+H7 三價(jià)疫苗的抗原含量、生產(chǎn)工藝、免疫佐劑以及保存運(yùn)輸?shù)确矫嬗嘘P(guān)，從而造成免疫后抗體水平存在偏差[11-12]。本次監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，各縣的禽流感總體免疫水平優(yōu)于各區(qū)，其中E 縣、D 縣的禽流感抗體免疫水平較好，H5、H7 亞型抗體總合格率均達(dá)70.00%以上，尤其是E 縣，除第二季度外，H5、H7 亞型抗體合格率均達(dá)100%。楊彩娟等[13]對(duì)2014—2018 年廣東省禽流感疫苗強(qiáng)制免疫效果調(diào)查發(fā)現(xiàn)，水禽在二次免疫后抗體合格率有明顯上升，免疫效果維持在較高水平。本研究對(duì)象為快大型肉鴨，生長周期短，大多數(shù)養(yǎng)殖場(chǎng)只進(jìn)行1 次免疫，而E 縣、D 縣的規(guī)模場(chǎng)肉鴨使用的是2 次免疫程序，這可能是其免疫效果較好的原因之一。因此，在現(xiàn)有養(yǎng)殖環(huán)境下，養(yǎng)殖場(chǎng)應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況適當(dāng)調(diào)整免疫程序和增加免疫次數(shù)。

從不同季度情況來看，各季度不同縣區(qū)的規(guī)模場(chǎng)肉鴨免疫抗體水平存在差異，其中第一、二季度全市規(guī)模肉鴨場(chǎng)的H5、H7 亞型免疫抗體水平相差較大。經(jīng)調(diào)查，這可能與免疫程序有關(guān)。謝向萌等[14]研究表明，一免后21 d 的H5 和H7 亞型抗體合格率分別為93%、53%，有一定的差異，而二免后兩者抗體水平一致。肉鴨生長期較短，因此大多養(yǎng)殖場(chǎng)只進(jìn)行1 次免疫。針對(duì)這種現(xiàn)象，各縣區(qū)后期對(duì)肉鴨免疫程序做出了相應(yīng)調(diào)整，致使到第三、四季度H5、H7 亞型免疫抗體水平相對(duì)一致。對(duì)各季度進(jìn)行研究分析可知，H5 亞型抗體合格率最低為39.05%，H7 亞型最低為13.33%，無縣區(qū)出現(xiàn)0 滴度現(xiàn)象，說明柳州市肉鴨養(yǎng)殖場(chǎng)的抗體合格率雖然與農(nóng)業(yè)農(nóng)村部規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)（不低于70.00%）還有較大差距，但禽流感疫苗免疫工作未曾中斷，不少肉鴨體內(nèi)已存在抗體，形成一定的保護(hù)力；但是，只有E 縣和D 縣的H5、H7 亞型抗體合格率全年大部分時(shí)間維持在70.00%以上，其他縣區(qū)均存在2 個(gè)季度以上不達(dá)標(biāo)現(xiàn)象，甚至個(gè)別縣區(qū)全年合格率均小于70.00%；還有一些雖然平均抗體滴度大于4.00log2，但抗體合格率卻低于規(guī)定的70.00%，說明還存在漏免、漏補(bǔ)現(xiàn)象，這為禽流感防控埋下了一定隱患。各縣區(qū)每季度的禽流感平均抗體效價(jià)均呈現(xiàn)不同幅度的波動(dòng)，僅D 縣每季度的平均抗體滴度均大于4.00log2。研究[15]表明，抗體水平較高的禽群在受到野毒感染時(shí)，如果抗體水平在8.00log2 及以上，則健康狀態(tài)相對(duì)穩(wěn)定、安全，無死亡，且影響較小。本次監(jiān)測(cè)中，合格抗體滴度多數(shù)處于（4.00～7.00）log2，占合格比例的75.36%，說明疫苗免疫對(duì)肉鴨起到了不同效力的保護(hù)作用，但要達(dá)到高效的保護(hù)力還需繼續(xù)加強(qiáng)免疫。整體分析發(fā)現(xiàn)，不同季度的禽流感抗體合格率依次為第四季度＞第二季度＞第一季度＞第三季度。冬春季節(jié)是禽流感高發(fā)期[6]，但炎熱干燥的夏季同樣值得注意。劉麗貞等[16]進(jìn)行不同月份水禽H5亞型免疫抗體監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，7—10 月各項(xiàng)免疫數(shù)據(jù)全面下降。這一方面是大多數(shù)養(yǎng)殖戶認(rèn)為天氣炎熱的情況下不會(huì)發(fā)生禽流感而減少免疫次數(shù)，另一方面與熱天氣下的環(huán)境應(yīng)激導(dǎo)致免疫力降低有關(guān)。因此，在此期間更要加強(qiáng)警惕。本次監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，H5、H7亞型免疫抗體總合格率在第四季度均達(dá)到75%以上，這為禽流感防控工作打下了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。因此，有必要定期進(jìn)行禽流感抗體水平檢測(cè)，根據(jù)實(shí)際情況不斷合理改進(jìn)免疫程序和更新疫苗，對(duì)于免疫不到位現(xiàn)象，應(yīng)立即開展免疫或補(bǔ)免，及時(shí)建立保護(hù)屏障，增強(qiáng)肉鴨抵御禽流感病毒感染的能力，有效避免禽流感發(fā)生。

受養(yǎng)殖模式、采樣條件、人手不足等條件限制，本研究采用的是配額抽樣方法。該方法雖然易于實(shí)施，但每個(gè)場(chǎng)點(diǎn)抽樣檢測(cè)的數(shù)量不多，存在主觀性強(qiáng)，場(chǎng)點(diǎn)數(shù)和抽樣數(shù)量有偏差等問題，與實(shí)際情況可能存在一定差異，但整體上能反映柳州市規(guī)模肉鴨養(yǎng)殖場(chǎng)的HPAI 免疫抗體水平及病毒流行情況，可為本地進(jìn)一步開展HPAI 防控工作提供參考。

5 結(jié)論

本次監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)：柳州市規(guī)模肉鴨養(yǎng)殖場(chǎng)H5、H7 亞型HPAI 免疫效果整體良好，尤其是H5 亞型免疫效果更好，也未檢測(cè)到H5、H7 亞型病原，說明柳州市肉鴨養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生HPAI 的風(fēng)險(xiǎn)較低；但部分城區(qū)免疫效果較差，第三季度免疫抗體水平偏低，因此還需繼續(xù)加強(qiáng)禽流感免疫監(jiān)測(cè)，做好補(bǔ)免和加強(qiáng)免疫工作。