羅曉燕，楊耀蘭，楊秋楠，宋詩雅，李晶，呂嶸，趙煥云

（1.玉溪市動物疫病預(yù)防控制中心，云南玉溪 653100；2.云南省動物疫病預(yù)防控制中心，云南昆明 650201）

禽流感是由正黏病毒科流感病毒屬A 型流感病毒引起的一種從呼吸系統(tǒng)到全身嚴(yán)重敗血癥等多種癥狀的禽類傳染病。根據(jù)禽流感病毒（AIV）對禽類的致病性，可分為高致病性禽流感病毒（HPAIV）與低致病性禽流感病毒（LPAIV）。目前只發(fā)現(xiàn)H5 和H7 亞型屬于HPAIV[1]。LPAIV 一般情況下僅造成禽類輕度的呼吸系統(tǒng)疾病，在禽間表現(xiàn)為隱性傳播。近年來不斷有關(guān)于LPAIV 流行的報道[2-5]，其流行和污染面呈上升和擴大趨勢。很多報道[6-8]顯示，H9 亞型是影響我國養(yǎng)禽業(yè)的主要禽流感病毒亞型，幾乎存在于所有的養(yǎng)禽場，可引起發(fā)病禽輕度呼吸道癥狀和產(chǎn)蛋性能下降。2003 年在我國香港地區(qū)還出現(xiàn)了人感染H9N2 亞型禽流感病毒病例[9]。

活禽市場中的活禽流動性大、品種繁多，又普遍缺乏嚴(yán)格的消毒和隔離措施，是AIV 的重要儲存庫，是AIV 在禽間以及人禽間傳播的重要環(huán)節(jié)[10]。為了解活禽交易市場的AIV 污染狀況及流行趨勢，2021 年對玉溪市轄區(qū)內(nèi)的活禽交易市場進行了AIV 檢測，以期為玉溪市活禽市場管理及禽流感防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2021 年，按照云南省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳印發(fā)的《2021年云南省動物疫病監(jiān)測與流行病學(xué)調(diào)查計劃》，對玉溪市轄區(qū)8 個縣（市、區(qū)）的24 個活禽市場進行檢測。每周輪流對其中的2 個縣（市、區(qū)），各隨機選擇1 個活禽市場進行采樣。每個活禽市場隨機選擇3 個售賣活禽攤位，每個攤位采集5 份活禽咽喉/泄殖腔雙拭子樣品；同時采集市場內(nèi)環(huán)境棉拭子樣品（案板、地面、污水等）5 份，運輸工具棉拭子樣品（雞籠、推車等）5 份。每份樣品裝入1 個離心管中，加入保存液低溫保存送實驗室檢測。

1.2 主要儀器與試劑

NP968C 型核酸自動提取儀，西安天隆科技有限公司產(chǎn)品；QuantStudio 7 Flex 熒光定量PCR 儀，美國ABI 公司產(chǎn)品。

病毒DNA/RNA 核酸提取試劑盒（4.0），西安天隆科技有限公司產(chǎn)品；A 型流感病毒熒光RTPCR 檢測試劑盒，寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；H5/H7/H9 亞型AIV 三重?zé)晒釸T-PCR 檢測試劑盒，中山大學(xué)達安基因股份有限公司產(chǎn)品。

1.3 檢測方法

使用NP968C 型核酸自動提取儀，參照試劑盒說明書，提取病毒RNA。采用寶生物工程（大連）有限公司One Step PrimeScript RT-PCR Kit（Perfect Real Time）流感病毒A 型通用核酸檢測試劑盒方法配制體系，在實時熒光定量PCR 儀上進行檢測；若檢測為陽性，再用中山大學(xué)達安基因股份有限公司H5/H7/H9 亞型AIV 三重?zé)晒釸T-PCR 檢測試劑盒進行分型檢測。

1.4 統(tǒng)計分析

應(yīng)用Excel 軟件對數(shù)據(jù)進行整理，再通過SPSS 24.0 軟件對陽性率進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 總體情況

全年累計檢測63 場次共1 455 份樣品，其中雞咽喉/泄殖腔雙拭子樣品860 份、環(huán)境拭子樣品317 份、運輸工具拭子樣品278 份。累計在44場次檢出A 型流感病毒核酸陽性435 份，進一步分型未檢出H5 和H7 亞型AIV 核酸陽性，檢出H9 亞型AIV 核酸陽性428 份，另有7 份未確定亞型。H9 亞型AIV 場次陽性率為69.84%（44/63），樣品陽性率為29.42%（428/1 455），其中活禽、環(huán)境、運輸工具拭子的樣品陽性率分別為32.56%（280/860）、25.87%（82/317）、23.74%（66/278）。7 份未確定型陽性樣品分別為禽咽喉/泄殖腔雙拭子2 份、環(huán)境拭子5 份。

2.2 不同月份情況

月份統(tǒng)計結(jié)果（圖1）顯示：2021 年玉溪市轄區(qū)內(nèi)活禽市場每個月均能檢測到H9 亞型AIV 陽性樣品。不同月份的H9 亞型AIV 核酸樣品陽性率存在差異，其中3—6 月陽性率低于年均陽性率，1、2、7、10、12 月陽性率明顯高于其他月份，各月份間陽性率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

圖1 2021 年不同月份H9 亞型AIV 陽性率分布

2.3 不同地區(qū)情況

地區(qū)統(tǒng)計結(jié)果（表1）顯示：8 個縣（市、區(qū)）的活禽市場中均檢出H9 亞型AIV 陽性樣品，但場次陽性率不一。澄江市、通?？h、紅塔區(qū)場次陽性率較高，在90%以上，其他縣市區(qū)均在80%以內(nèi)，其中華寧縣場次陽性率最低（33.33%）。不同地區(qū)間的場次陽性率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而樣品陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 不同縣區(qū)H9 亞型AIV 檢測結(jié)果統(tǒng)計

2.4 不同樣品情況

活禽咽喉/泄殖腔雙拭子的H9 亞型AIV 陽性率較高，達32.56%，明顯高于環(huán)境（25.87%）和運輸工具（23.74%）棉拭子（表2），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 不同樣品H9 亞型AIV 檢測結(jié)果統(tǒng)計

3 討論

本研究對玉溪市轄區(qū)內(nèi)8 個縣（區(qū)、市）的活禽市場開展禽流感監(jiān)測，未檢出H5、H7 亞型AIV 陽性。這可能與國家全面實施高致病性禽流感強制免疫（H5+H7 二價疫苗）政策，且疫苗毒株更新及時，從而在養(yǎng)殖環(huán)節(jié)有效控制了疫病的發(fā)生有關(guān)?；钋荨⑹袌霏h(huán)境、運輸工具中均檢出H9 亞型AIV，且陽性率較高，病毒污染面較廣。不同樣品H9 亞型AIV 陽性率差異顯著，說明雞群在進入市場時已攜帶病毒，并污染市場和運輸工具，如果閉市時市場管理方嚴(yán)格清洗消毒市場和車輛，會降低市場和運輸工具樣品的陽性率?；钋萁灰资袌鍪遣煌瑏碓?、批次和種類活禽的聚集地，加之場地狹小，衛(wèi)生條件差，且部分當(dāng)天未售賣完的活禽要么在市場過夜，要么流出市場，病毒極易大量復(fù)制增殖并在家禽群體及環(huán)境中持續(xù)傳播和擴散，導(dǎo)致活禽零售市場成為禽流感病毒持續(xù)存在的高風(fēng)險區(qū)域[11]。因此，應(yīng)加強對流入市場家禽的監(jiān)管和檢疫，盡量避免外表健康的隱性感染家禽進入市場，同時也應(yīng)嚴(yán)格執(zhí)行活禽交易市場“1110 制度”（一日一清洗、一周一消毒、一月一休市、過夜零存欄），有條件的市場可推行白條雞上市。

從不同月份看，偏冷季節(jié)（1、2、12 月）H9亞型AIV 陽性率較高，這可能與玉溪市冬季寒冷、潮濕，有利于病毒存活有關(guān)。隨著天氣轉(zhuǎn)暖，陽性率逐漸降低，除10 月份外（該月陽性率異常升高，懷疑與當(dāng)月檢測數(shù)量少有關(guān)），其余月份陽性率趨于平穩(wěn)，維持在20%～30%的水平，季節(jié)性差異縮小，這與朱建翠等[12]的研究結(jié)果一致。因此，除應(yīng)重點加強冬春季節(jié)的禽流感防控外，其余季節(jié)的防控也不可掉以輕心。

從不同區(qū)域看，全市8 個縣（市、區(qū)）的H9亞型AIV 樣品陽性率為12.00%～52.22%，說明各地區(qū)活禽市場H9 亞型AIV 污染率較高。其中：通?？h樣品陽性率最高，這可能與該縣為全市蛋雞養(yǎng)殖大縣，活禽交易比較頻繁有關(guān)；華寧縣和元江縣陽性率較低，可能與樣品采集主要來自于鄉(xiāng)鎮(zhèn)農(nóng)貿(mào)市場，禽類來源單一有關(guān)，也可能與這些地區(qū)的活禽交易市場的衛(wèi)生環(huán)境管理較好有關(guān)。因此，每個縣區(qū)可根據(jù)各自活禽交易市場的H9 亞型AIV 流行特點，結(jié)合自身實際，制定切實可行的綜合防控措施。

本次監(jiān)測的對象主要是雞，未涉及到其他禽類，監(jiān)測結(jié)果未能全面反映活禽市場的AIV 污染情況。下一步將繼續(xù)加強對其他禽類（鴨、鵝）及其他環(huán)節(jié)的禽流感監(jiān)測，以期充分了解和掌握本地區(qū)AIV 流行趨勢，提出有針對性的防控建議和措施，為本地區(qū)禽流感防控工作提供更有力依據(jù)。