趙杰，蘇啟表，李之琛，鄒瑜聰，劉曉欽，邱學軍，3

（1.廣東藥科大學健康學院，廣東 廣州 510000；2.廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院關節(jié)外科，廣東 廣州 510000；3.廣東省光與健康工程技術研究中心，廣東 廣州 510000）

膝關節(jié)骨關節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種以關節(jié)軟骨的磨損退變并伴隨膝關節(jié)周圍骨贅增生的關節(jié)退行性疾病。隨著KOA的病理進展，患者膝關節(jié)將有不同程度的關節(jié)畸形、活動障礙、關節(jié)疼痛、肌肉萎縮等臨床表現(xiàn)，終末期KOA 嚴重影響患者的生活質量。臨床報道甘草附子湯（GCFZ）對KOA 具有一定療效，但其作用機制尚不明確[1-2]。本實驗探討GCFZ 對KOA 大鼠的作用及相關分子機制，為其應用于KOA的治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF 級SD 雄性大鼠，體質量200～220 g，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號：SCXK（粵）2019-0035；動物飼養(yǎng)于SPF 實驗室，正式實驗前適應性飼養(yǎng)1周。

1.1.2 藥物、試劑和儀器 中藥飲片炙甘草、淡附片、白術、桂枝均購自廣東康美藥業(yè)有限公司（批號分別為200108、200203、191020、191221）。木瓜蛋白酶、L-半胱氨酸購自美國Sigma-Aldric 公司（批號分別為：19812TE、158K1284）；BCA 蛋白定量分析試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司（貨號：P001S）；大鼠IL-6、TNF-α和IL-1βElisa 試劑盒購自深圳達科為生物技術有限公司（批號分別為：

372019121、392020019、152019113 ）；P65、IκBα、p-IκBα及β-actin 抗體購自美國CST 公司（貨號：9936）；IKKα/β和p-IKKα/β抗體購自英國ABCam公司（批號分別為：ab235402、ab244563）；逆轉錄試劑盒購自大連Takara 公司（批號：RR047A）；雙氯芬酸鈉購自廣東臺城制藥股份有限公司（批號：201908015）；引物由上海生工生物工程公司合成。Multiskan Sky 全波長酶標儀購自美國Thermo Fisher 公司；37450 電子觸覺測試儀購自意大利Ugo Basile 公司；SDS 電泳系統(tǒng)、濕轉膜系統(tǒng)購自美國Bio-Rad 公司；FluorChem R 多功能成像分析系統(tǒng)購自美國Proteinsimple 公司；ABI7500 基因擴增儀購自美國Applied Biosystems 公司；600R 雙足平衡測痛儀購自美國IITC公司。

1.2 方法

1.2.1 藥物制備 GCFZ 制備方法如下：稱取炙甘草15 g、淡附片15 g、白術15 g、桂枝30 g，全方用10 倍量水浸泡30 min后煎煮30 min，反復煎煮2次，合并煎液，過濾減壓濃縮至含生藥質量濃度為1 g/mL 的溶液，置4 ℃冰箱保存，臨用前用生理鹽水稀釋至所需濃度。木瓜蛋白酶混合液制備：在無菌條件下用生理鹽水將木瓜蛋白酶、L-半胱氨酸分別配制成質量濃度為0.04 g/mL、0.03 mol/L 的溶液，置4 ℃冰箱保存，于實驗前將木瓜蛋白酶溶液與L-半胱氨酸溶液按體積比2∶1混勻，靜置10 min備用。陽性藥物雙氯芬酸鈉臨用前用生理鹽水稀釋至濃度為0.25 mg/mL的溶液備用。

1.2.2 動物分組、模型建立及給藥[3]采用隨機數(shù)字表法將大鼠分為空白組、模型組、陽性藥物組、GCFZ高劑量組和低劑量組，每組8只。模型建立方法：以造模當天計為第1 天，于第1、4、7 天，麻醉大鼠后將其仰臥位固定，空白組每只大鼠右側膝關節(jié)腔注射生理鹽水0.2 mL，其余4 組注射木瓜蛋白酶混合液0.2 mL。第2 天，空白組和模型組均給予生理鹽水；陽性藥物組給予雙氯芬酸鈉溶液，劑量為0.002 5 g/kg；GCFZ 高劑量組和低劑量組分別給予GCFZ 9.0 g/kg、4.5 g/kg，各組動物每天灌胃1 次，給藥容積均為10 mL/kg，連續(xù)灌胃至第28天。

1.2.3 大鼠膝關節(jié)寬度測定[4]在第1天造模前和第14、28 天采用電子游標卡尺測定大鼠膝關節(jié)寬度，觀察膝關節(jié)腫脹情況。

1.2.4 機械性痛閾測定[5]按照文獻采用電子觸覺測試儀測定大鼠機械刺激縮爪閾值（paw with‐drawal threshold，PWT），測定時間與“1.2.3”項相同。方法如下：將刺激針對準大鼠后爪足底并逐漸增加刺激壓力，大鼠感覺到痛覺瞬間出現(xiàn)縮足、舔腳等陽性反應時移開刺激針，記錄此時所給予刺激壓力的數(shù)值，每只大鼠重復測定3次，每次測定間隔時間為5 min，取其平均值為PWT。

1.2.5 雙足平衡法測痛實驗[6]將大鼠放入測痛儀測定通道中，使其前足立于通道隔板，兩側后足分別放置于兩側稱量踏板，待儀器檢測數(shù)值穩(wěn)定后，按下開始鍵記錄此時雙側下肢的負重值，連續(xù)測量3 次，每次測定間隔時間為3 min，計算其平均值，按公式計算右下肢負重百分比。右下肢負重百分比=100×右下肢負重值/（右下肢負重值+左下肢負重值），測定時間與“1.2.3”項相同。

1.2.6 Elisa法檢測大鼠膝關節(jié)腔關節(jié)液TNF-α、IL-6和IL-1β水平[7]第28天灌胃4 h后，麻醉大鼠于右側膝關節(jié)腔穿刺取關節(jié)液，并用100 μL PBS 灌洗關節(jié)腔，收集灌洗液，3 500 r/min離心10 min，取上清液按ELISA試劑盒說明書檢測TNF-α、IL-6和IL-1β水平。

1.2.7 RT-PCR方法檢測膝關節(jié)滑膜組織TNF-α、IL-6和IL-1βmRNA表達情況[8]第28天處死動物后分離收集大鼠右側膝關節(jié)滑膜組織，稱取30 mg剪碎加入1 mL Trizol試劑，冰浴中迅速勻漿，按文獻［8］提取總RNA，用核酸蛋白儀檢測RNA濃度，取1 μg總RNA使用cDNA 第一鏈合成試劑盒對樣本逆轉錄合成cDNA，用Sybr Green RT-PCR Master Mix配置20 μL反應體系，置PCR儀進行PCR擴增，記錄PCR反應過程中的Ct值，以GAPDH為內參，采用2-△△Ct計算TNFα、IL-6和IL-1βmRNA相對表達量。引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列Table 1 Primer sequences for RT-PCR

1.2.8 Western blot 方法檢測滑膜組織p65、IκBα、p-IκBα、IKKα/β、p-IKKα/β蛋白表達情況[8]第28天，處死動物后稱取30 mg 大鼠右側膝關節(jié)滑膜組織，提取組織總蛋白，采用BCA 法測蛋白濃度。取適量體積的蛋白樣品20μg 與去離子水和2×SDS 加樣染料混合均勻后，置蛋白變性儀97 ℃加熱5 min，使蛋白質變性，然后進行SDS-PAGE 電泳分離目標蛋白，電泳條件：80 V，30 min；120 V，70 min，隨后采用250 mA 恒流條件下轉膜90 min 將電泳分離后的蛋白轉移至PVDF 膜，用5%脫脂奶粉封閉1 h，TBST 洗滌5次，5 min/次，放入含相應一抗的稀釋液（一抗用5% BSA 溶液按1∶1 000 稀釋），4 ℃孵育過夜，TBST 洗滌3 次，10 min/次，然后加入HRP 標記的二抗室溫孵育1 h，TBST 洗滌3 次，10 min/次，采用ECL化學發(fā)光法顯影檢測蛋白表達情況。

1.2.9 統(tǒng)計分析 采用軟件SPSS 25.0進行統(tǒng)計學處理，計量數(shù)據(jù)以表示，組間多重比較采用One-way ANOVA 分析，方差齊時采用LSD 法，方差不齊時采用Dunnett'sT3法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠膝關節(jié)寬度比較

第1天造模前，比較各組大鼠膝關節(jié)寬度，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），組間具有可比性。第14、28 天，與空白組比較，模型組膝關節(jié)寬度顯著增加，腫脹明顯（P<0.01）；與模型組比較，3 個給藥組（陽性藥物組、GCFZ 高、低劑量組）膝關節(jié)寬度均顯著下降（P<0.01），抑制關節(jié)腫脹效果明顯。見圖1。

圖1 各組大鼠膝關節(jié)寬度比較Figure 1 Comparison of knee joint width of rats in each group

2.2 各組大鼠機械性痛閾比較

造模前，比較各組大鼠PWT，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。第14、28 天，與空白組比較，模型組PWT 顯著下降（P<0.01）；與模型組比較，3 個給藥組PWT均顯著提高（P<0.05，P<0.01）。見圖2。

圖2 各組大鼠機械性痛閾比較Figure 2 Comparison of mechanical pain threshold of rats in each group

2.3 各組大鼠右下肢負重能力比較

下肢負重力量分布的變化與疼痛行為相關。第1天，各組大鼠右下肢負重百分比約為50，組間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。第14，28 天，與空白組比較，模型組右下肢負重百分比顯著下降（P<0.01），表明注射木瓜蛋白酶混合液能誘導KOA 大鼠膝關節(jié)疼痛，導致雙下肢不對稱負重明顯；與模型組相比，3個給藥組均能提高右下肢負重能力（P<0.05，P<0.01）。見圖3。

圖3 各組大鼠右下肢負重能力比較Figure 3 Comparison of weight-bearing capacity of right lower limb of rats in each group

2.4 各組大鼠膝關節(jié)腔關節(jié)液炎性細胞因子水平比較

與空白組比較，模型組關節(jié)液TNF-α、IL-6和IL-1β濃度均顯著增加（P<0.01）。與模型組比較，陽性藥物組和GCFZ 高劑量組能明顯降低TNF-α水平（P<0.05，P<0.01），GCFZ低劑量組有降低TNF-α水平的趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；各給藥組均能降低IL-6和IL-1β水平（P<0.05）。見表2。

表2 各組大鼠膝關節(jié)腔關節(jié)液中炎性細胞因子水平比較Table 2 Comparison of the levels of inflammatory factors in the synovial fluid of knee joint of rats in each group(±s，n=8)ρ/(pg·mL-1)

表2 各組大鼠膝關節(jié)腔關節(jié)液中炎性細胞因子水平比較Table 2 Comparison of the levels of inflammatory factors in the synovial fluid of knee joint of rats in each group(±s，n=8)ρ/(pg·mL-1)

與空白組比較：**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01。

IL-1β 14.95±3.54 79.02±9.79**54.55±9.71##65.02±5.10##66.22±5.55#組別空白組模型組陽性藥物組GCFZ高劑量組低劑量組劑量/（g·kg-1）--0.002 5 9.0 4.5 TNF-α 27.94±5.57 229.92±43.68**149.53±15.82##166.61±14.20#195.63±13.99 IL-6 10.77±2.35 31.31±4.09**16.93±3.71##22.89±3.52##23.79±2.62##

2.5 各組大鼠膝關節(jié)滑膜組織TNF-α、IL-6 和IL-1β mRNA表達的比較

與空白組比較，模型組大鼠滑膜組織TNF-α、IL-6 和IL-1βmRNA 表達均顯著上調（P<0.01）；與模型組相比，3個給藥組能下調TNF-α、IL-6和IL-1βmRNA表達（P<0.01）。見圖4。

圖4 各組大鼠膝關節(jié)滑膜組織TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表達的比較Figure 4 Comparison of the expression of TNF-α，IL-6 and IL-1β mRNA in knee joint synovial tissue of rats in each group

2.6 各組大鼠膝關節(jié)滑膜組織NF-κB 信號通路相關蛋白表達的比較

如圖5A、5B 所示，與空白組比較，模型組大鼠膝關節(jié)滑膜組織NF-κB p65 蛋白表達升高，IκBα蛋白表達下降、蛋白降解明顯，磷酸化蛋白p-IκBα、p-IKKα/β表達增加。與模型組相比，3 個給藥組能明顯抑制p65 蛋白表達、抑制IκBα蛋白的降解和磷酸化，并能下調p-IKKα/β蛋白表達。各組對IKKα/β蛋白的表達沒有明顯差異。

圖5 各組大鼠膝關節(jié)滑膜組織NF-κB信號通路相關蛋白表達的比較Figure 5 Comparison of the expression of NF-κB signaling-related proteins in knee joint synovial tissue of rats in each group

3 討論

GCFZ 始載于張仲景的《傷寒論》，臨床報道有不少醫(yī)者應用此方或加味方治療KOA，可以有效緩解患者癥狀、改善膝關節(jié)功能，但其機制有待研究[1]。

本實驗首先采用木瓜蛋白酶和L-半胱氨酸復制KOA大鼠模型，該模型操作簡便、動物生存率高，造模型4 周符合早期KOA 的癥狀表現(xiàn)，是一種較為成熟的造模方法[9-10]。如圖1－圖3所示，GCFZ能抑制KOA大鼠膝關節(jié)寬度增加、提高機械疼痛閾和右下肢負重能力，表明GCFZ 能夠緩解早期KOA 大鼠的膝關節(jié)腫脹、減輕疼痛，對KOA具有一定療效。

有研究表明KOA 是一種涉及持續(xù)性低度炎癥和炎癥通路激活的疾病，其發(fā)生和加重與炎性細胞因子有著密切聯(lián)系，關節(jié)囊滑膜組織和關節(jié)腔內TNF-α、白介素等細胞因子的過度分泌能促進軟骨降解、滑膜炎癥和軟骨下骨的吸收，加快關節(jié)軟骨退變的速度和炎癥的生成，使膝關節(jié)的功能活動發(fā)生障礙[11-13]。本實驗結果顯示，GCFZ 能降低KOA大鼠膝關節(jié)腔關節(jié)液TNF-α、IL-6 和IL-1β的濃度、下調膝關節(jié)滑膜組織3 種細胞因子mRNA 的表達，表明GCFZ能夠抑制膝關節(jié)TNF-α等炎性細胞因子的分泌。

NF-κB 在炎癥反應、免疫反應以及正常細胞和惡性細胞的存活中起著重要作用，關節(jié)炎、自身免疫性疾病等多種病變均存在NF-κB 通路功能失調的現(xiàn)象[14-15]。有研究表明KOA 患者滑膜組織中存在大量的NF-κB，NF-κB 的激活先于關節(jié)炎的臨床表現(xiàn)[16-17]。在哺乳動物中，NF-κB 是由多肽鏈p50 與p65 形成的同源/異源二聚體，該二聚體與IκB 蛋白結合形成三聚體復合物使其處于失活狀態(tài)。當受創(chuàng)傷、炎性因子的刺激時，細胞膜受體激活導致IκB 激酶（IκBkinases，IKKs）的磷酸化，進一步激活IκB發(fā)生磷酸化和泛素化，導致IκB 構象改變并被降解、三聚體復合物的p65和p50從而被釋放，NF-κB進入細胞核啟動和調控TNF-α、IL-1β等靶基因的表達[18-19]。已有研究表明，治療KOA 的部分藥物如阿司匹林、布洛芬等可以抑制IKKα/β活性，進而抑制IκB 磷酸化阻止NF-κB 通路的激活[21]。如圖5結果所示，GCFZ可以明顯抑制滑膜組織p65的表達，減少IκBα的降解、磷酸化以及IKKα/β的磷酸化，由此推斷GCFZ可能是通過介導NF-κB信號通路抑制KOA大鼠膝關節(jié)炎性細胞因子的分泌，改善膝關節(jié)癥狀。

綜上所述，GCFZ 能緩解KOA 大鼠的膝關節(jié)腫脹、減輕疼痛、抑制膝關節(jié)炎性細胞因子的分泌，其機制可能與調控NF-κB信號通路的激活有關。