李 丹，李 孟，謝芝勛，羅思思，張民秀，謝麗基，黃嬌玲，華 俊，粟永春，阮志華

（1.廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所/廣西獸醫(yī)生物技術重點實驗室，廣西 南寧 530001；2.廣西金陵農牧集團有限公司，廣西 南寧 530049）

禽流感（Avian influenza，AI）是一種由禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）引起的禽類傳染性病毒病［1］。AIV具有亞型多、傳染性強和分布廣且具有一定的宿主特異性且變異快的特點［2-5］。依據(jù)AIV對雞致病力的不同，AIV可分為高致病性禽流感病毒（HPAIV）和低致病性禽流感病毒（LPAIV），HPAIV引起的禽類感染死亡率極高，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經濟損失［6-8］。能引起HPAI發(fā)生的主要是H5和H7亞型AIV，其中影響最大的是H5亞型HPAIV。目前，H5亞型AIV已在60多個國家的家禽和野鳥中被檢測出，包括H5N1、H5N2、H5N3、H5N5、H5N6和H5N8等組合，而且該亞型組合的病毒還在不斷地進化和變異［9-10］。近年來，H5N8亞型AIV作為其中一個重要亞型組合，逐漸引起了人們的關注。1983年H5N8疫情首次在冰島發(fā)生過流行，中國于2010年首次在家禽中檢測出H5N8亞型AIV［11］。2014年初在韓國和日本的家禽中發(fā)現(xiàn)該亞型AIV，并傳播至歐洲和北美洲［12-13］。2020年以來，世界動物衛(wèi)生組織（OIE）通報發(fā)現(xiàn)，沙特阿拉伯和匈牙利等國家的家禽中再次暴發(fā)了H5N8亞型AI，并蔓延至其他國家［14-15］。2020年12月，國際上首次報告俄羅斯養(yǎng)殖場工作人員感染H5N8亞型AIV的病例［16］。H5N8禽流感病毒在亞歐大陸和非洲大流行，已成為影響全球家禽養(yǎng)殖、野生動物安全的一個重要因素。同時，新發(fā)生的H5N8禽流感病毒可造成人感染，已成為值得關注的公共衛(wèi)生問題，須引起高度重視。因此，建立能迅速、有效地鑒別H5和N8亞型禽流感病毒的檢測方法，對禽流感的防控及保障人類公共衛(wèi)生安全具有十分重要的意義。

目前，病毒分離鑒定是診斷AIV感染的“黃金標準”，由于AIV亞型眾多且新的變異株不斷出現(xiàn)，采用傳統(tǒng)方法對其進行分型和診斷，不僅存在著操作方法復雜，而且檢測周期長、容易受抗體等因素影響，使得檢測結果不能準確和及時地判斷［17-18］。AIV分子生物學檢測技術主要包括RT-PCR和熒光定量PCR等方法，納米PCR技術是近年來新興起的一種將納米技術與分子生物學技術相結合的核酸檢測技術，該技術在改善PCR反應特異性和敏感性等諸多方面具有一定的優(yōu)勢，可以有效地提高PCR檢測結果的準確性和可靠性［19-21］。隨著科學技術日新月異地發(fā)展，人們不斷地改良和優(yōu)化納米PCR檢測方法并擴展至其他應用領域。目前，納米PCR技術在動物疫病檢測領域已經有一些報道［22-25］，而雙重納米PCR（nano-dPCR）技術的反應體系能同時擴增H5和N8基因并用于檢測和鑒別H5N8亞型AIV的核酸檢測技術尚未見相關報道。本研究旨在建立一種同時檢測H5和N8亞型AIV的雙重納米PCR方法，以期為監(jiān)測H5亞型和N8亞型AIV的流行情況及其鑒別診斷提供新的技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和儀器 納米PCR試劑盒（NPK02）購自上海滬崢生物科技有限公司；DNA/RNA共提試劑盒、小量質粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒、感受態(tài)細胞、PCR產物快速連接載體和DNA Marker均購自北京全式金生物技術有限公司；購自寶生物（北京）有限公司的試劑有M-MLV、隨機引物、dNTP、RNA抑制劑。其他試劑均購自商業(yè)公司。PCR儀購自美國Bio-Rad Laboratories公司，超微量分光光度計購自美國Thermo公司，實驗所用SPF雞胚購自北京勃林格殷格翰維通生物技術有限公司。

1.1.2 毒株 毒株（H1N2、H3N2、H4N2、H6N8、H6N1、H9N2、NDV、IBV、ARV、ILTV和ChPV）均由廣西獸醫(yī)生物技術重點實驗室保存；H7N2、H13N6、H14N5、H16N3和H15N9亞 型AIV的cDNA模板由美國賓夕法尼亞州立大學惠贈；H5N1和H5N2亞型AIV的cDNA模板由美國康涅狄格州立大學惠贈；其他AIV（H2N3、H8N4、H10N3、H12N5和H11N3）毒株或cDNA模板均由香港大學惠贈。

1.2 方法

1.2.1 引物的設計與合成 運用DNAStar軟件，將GenBank中下載的N8亞型AIVNA和H5亞 型AIVHA基因的核苷酸序列進行比對，分別對2種目的基因進行特異性保守區(qū)域的篩選，采用Primer 6.0和Oligo 6.0軟件設計特異性引物，并通過NCBI BLAST在線驗證其特異性，篩選出分別針對2種目的基因的2對特異性引物。設計出的引物序列見表1。上述引物均由華大基因廣州分公司合成。

表1 H5和N8亞型AIV HA和NA基因的引物序列

1.2.2 病毒RNA/DNA的提取與RNA的反轉錄 參照試劑盒使用說明書，運用DNA/RNA抽提試劑盒對實驗中所用到的AIV、NDV、IBV、ARV和ILTV的DNA/RNA進行抽提，并用DEPC水溶解抽提后的DNA/RNA。參照反轉錄酶說明書，對RNA病毒的抽提產物進行反轉錄合成cDNA，所有DNA和cDNA產物均置于-30 ℃冰箱中保存。

1.2.3 雙重納米PCR反應體系及其條件的優(yōu)化 nanodPCR方法的PCR反應體系為25 μL：2×Nano-QPCR buffer 12.5 μL，Taq DNA polymerase（5 U/μL）0.5 μL，作為模板N8亞型AIV和H5亞型AIV的cDNA各加入1 μL；再分10個梯度各加入0.1～1.0μL對引物H5-F、H5-R、N8-F和N8-R（25 pmol/μL）進行引物濃度的優(yōu)化；最后，用超純水將反應總體積補足至25 μL。為最終確定最佳的反應體系及條件，根據(jù)實驗結果對退火溫度和時間進行優(yōu)化。

1.2.4 特異性實驗 為驗證所建立的nano-dPCR檢測方法的特異性，按照優(yōu)化后的條件，用該法對H1N2、H2N3、H3N2、H4N2、H5N1、H5N2、H6N8、H6N1、H7N2、H8N4、H9N2、H10N3、H11N3、H12N5、H13N6、H14N5、H15N9、H16N3、NDV、IBV、ILTV和ARV進行特異性擴增，檢驗其特異性。對擴增出的目的片段進行純化和回收，PCR產物快速連接至載體上，并轉化到感受態(tài)細胞中進行克隆，挑選陽性單克隆菌送賽默飛廣州分公司進行測序和驗證。

1.2.5 標準品的制備 分別以N8亞型AIV與H5亞型AIV的cDNA為模板，用特定的引物對N8亞型AIVNA和H5亞型AIVHA基因的全長片段進行PCR擴增，得到其N8亞型AIVNA和H5亞型AIVHA基因的全長目的片段，再分別將2個基因片段連接到PCR產物快速連接載體中，并轉化到感受態(tài)細胞中進行克隆，挑選陽性單克隆菌送華大基因廣州分公司進行測序驗證。將含有N8亞型AIVNA和H5亞型AIVHA基因片段的2種重組質粒分別命名為N8-T和H5-T。分別提取N8-T和H5-T的質粒，并用微量核酸檢測儀對其進行核酸濃度的測定，根據(jù)分子質量和核酸濃度計算對應的拷貝數(shù)，將N8-T和H5-T等拷貝數(shù)混合，并稀釋10倍，以得到N8-T和H5-T質粒DNA濃度均為5× 100～5×109拷貝/μL的標準品。

1.2.6 敏感性實驗 為檢測該方法的敏感性，運用所建立的H5和N8亞型禽流感病毒雙重普通PCR（dPCR）和nano-dPCR的檢測方法，同時對N8-T和H5-T質粒濃度為5×100～5×109拷貝/μL的樣品進行特異性擴增，并比較這2種方法的敏感性。

1.2.7 臨床樣品檢測 對活禽市場采集的130份家禽咽喉及泄殖腔拭子樣品運用建立的nano-dPCR檢測方法進行檢測和鑒定，同時將樣品處理后接種SPF雞胚進行病毒分離鑒定，將病毒分離鑒定結果與nano-dPCR檢測結果進行比較；然后將陽性樣品進行HA和NA基因全長擴增，并將HA和NA基因全長克隆送測序公司進行測序和分析，以驗證nano-dPCR檢測結果的準確性和可靠性。

2 結果與分析

2.1 雙重納米PCR方法的建立

通過nano-dPCR方法分別對H5亞型AIV和N8亞型AIV的目的基因進行擴增，經瓊脂糖凝膠電泳檢測，可分別獲得207和428 bp的特異性目的片段（圖1），與預期片段大小相符。

圖1 H5和N8亞型AIV目的基因nano-dPCR擴增圖譜

2.2 H5亞型和N8亞型AIV nano-dPCR檢測方法的最佳退火溫度和最佳反應條件的確定

H5亞型和N8亞型AIV nano-dPCR經退火溫度（46～53 ℃）優(yōu)化，瓊脂糖凝膠電泳結果見圖2。由圖2可知，49～50 ℃下nano-dPCR擴增效果均表現(xiàn)為良好，最終選擇50 ℃為nano-dPCR檢測方法的最佳退火溫度。nano-dPCR方法的PCR最佳反應體系為25 μL：2×Nano-QPCR buffer 12.5 μL，Taq DNA polymerase（5 U/μL）0.5 μL，作為模板N8亞型AIV和H5亞 型AIV cDNA各 加 入1 μL，引 物H5-F和H5-R（25 pmol/μL）0.8 μL、引物N8-F和N8-R（25 pmol/μL）1.2 μL，加ddH2O補足25 μL。最終優(yōu)化的反應條件為：94 ℃、3 min；進入94 ℃、20 s，50 ℃、30 s，72 ℃、30 s，共30個循環(huán)；然后，再72 ℃延伸5 min，最后，4 ℃結束反應。

圖2 nano-dPCR退火溫度優(yōu)化結果

2.3 特異性實驗

在H5、N8亞型AIV擴增結果中出現(xiàn)2條特異性條帶，分別為207和428 bp；在H5N2亞型AIV即H5Ny（y≠8）亞型AIV擴增結果中僅出現(xiàn)1條特異性條帶，片段大小為207 bp；在H6N8亞型AIV即HxN8（x≠5）亞型AIV擴增中僅出1條特異性條帶，片段大小為428 bp。對其他亞型AIV以及常見的禽病病原體的擴增中均未出現(xiàn)條帶（圖3），由此表明nano-dPCR檢測方法的特異性良好。

圖3 特異性擴增實驗結果

2.4 敏感性實驗

以初始濃度均為5×109拷貝/μL的H5-T和N8-T，經過ddH2O 10倍系列的稀釋，取每個稀釋度的重組質粒模板進行nano-dPCR和dPCR檢測。敏感性實驗結果表明：nano-dPCR可檢測H5亞型AIVHA和N8亞型AIVNA基因的最低拷貝數(shù)均為5×102拷貝/μL；而使用dPCR方法檢測的最低拷貝數(shù)均為5×104拷貝/μL（圖4）。nano-dPCR檢測方法的敏感性比dPCR檢測方法高100倍。

圖4 H5和N8亞型AIV nano-dPCR和dPCR敏感性實驗結果

2.5 臨床樣品檢測

運用該方法對廣西獸醫(yī)生物技術重點實驗室從南寧活禽市場采集的130份雞口腔及泄殖腔棉拭子品進行檢測。樣品nano-dPCR檢測的結果顯示：6份樣品能擴增出478 bp的目的條帶，為H5NxAIV，陽性率為2.31%；15份樣品能擴增出428 bp的目的條帶，為HyN8 AIV，陽性率為11.54%；所有樣品同時接種SPF雞胚進行病毒分離，病毒分離結果與nano-dPCR方法檢測結果完全一致。nanodPCR獲得的產物測序結果顯示，nano-dPCR獲得的207、428 bp特異片段分別與H5亞型AIVHA、N8亞型AIVNA基因序列的符合率均為100%。

3 討論

近年來，由于不同組合H5亞型AIV感染引發(fā)的高致病性禽流感疫情持續(xù)出現(xiàn)，已經威脅家禽養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展，并引發(fā)嚴重的公共衛(wèi)生危機［26-27］。另外，某些N8亞型AIV（例如H10N8、H3N8和H5N8等）還能直接感染人類，對人類公共衛(wèi)生安全構成了嚴重的威脅［28-29］。由于不同亞型禽流感病毒感染家禽后的臨床癥狀、剖檢病變極其相似，肉眼和常規(guī)的方法難以對其進行快速、準確的鑒別診斷。普通PCR在臨床檢測上比較常用，雖然實時熒光定量PCR檢測的敏感性比普通PCR高，但需要昂貴的精密儀器且操作程序復雜。納米技術已經廣泛應用到生命科學的各個領域，隨著對納米材料在PCR反應過程中作用機制的深入研究，更多研究團隊開發(fā)了檢測不同動物疫病的納米PCR技術［30］。目前，納米PCR已成功應用于感染豬、牛、雞、犬和貓等多種動物病原的臨床檢測中［31-32］，上述研究所建立的納米PCR檢測方法靈敏度均比普通PCR檢測方法的高，且特異性更好。

前期納米PCR的研究多集中在對單一病原檢測方法的研究。近年來，多重納米PCR逐漸成為研究熱點。在多重PCR反應體系中，引物的設計至關重要，它是決定多重PCR反應成功與否的關鍵。本研究在引物設計時，充分平衡各種影響多重PCR的因素，同時將擴增H5亞型AIVHA和N8亞型AIVNA基因的引物，進行多個引物組合的比對和篩選優(yōu)化，并依據(jù)長期的實踐經驗，選擇最佳的引物對組合進行nano-dPCR擴增，為nano-dPCR方法的成功建立奠定了基礎。退火溫度優(yōu)化實驗的結果表明：nano-dPCR產物在49～50 ℃的低退火溫度條件下均能得到很好的擴增，在增加PCR產物量的同時，避免了引物間的非特異性擴增。本實驗對所獲得的特異性PCR產物進行了測序和比對分析，結果表明：nano-dPCR擴增獲得了預期片段大小一致的特異條帶，且測序結果與所設計基因片段高度一致。敏感性實驗對比的結果表明，nano-dPCR的最低核酸檢測量比普通dPCR最低核酸檢測量高100倍，與其他研究者的結果基本一致［33］，表明本研究建立的nano-dPCR反應具有良好的敏感性。

應用本實驗所建立的nano-dPCR對臨床樣品進行檢測，N8亞型AIV的感染率為11.54%，H5亞型AIV感染率為2.31%。由檢測結果可知，N8亞型AIV在雞群中存在普遍感染，N8亞型AIV的陽性率遠高于H5亞型AIV的陽性率。此外，在本次檢測中未出現(xiàn)了H5亞型AIV和N8亞型AIV的混合感染現(xiàn)象，這提示在禽流感防控的過程中，應該對H5亞型AIV和N8亞型AIV給予關注。

4 結論

本研究成功地建立了能同時檢測H5亞型和N8亞型的雙重納米PCR檢測方法，該方法具有比普通PCR方法靈敏性更高，又比實時熒光定量PCR方法更簡便的特點，更有利于在基層推廣應用，為H5亞型和N8亞型AIV的臨床檢測及防控提供了新的技術支撐。