賴成霞，陽(yáng) 妮，瑪依拉·玉素音，姜夢(mèng)竹，楊延龍，李春平，葉夢(mèng)迪

(1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院 經(jīng)濟(jì)作物研究所，烏魯木齊 830091； 2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，烏魯木齊 830091；3.新疆自治區(qū)植物保護(hù)站，烏魯木齊 830049)

由大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae Kleb)引起的棉花黃萎病是嚴(yán)重制約棉花生產(chǎn)的逆境因素之一[1]。由于其初侵染源是以微菌核為主[2-3]，化學(xué)農(nóng)藥對(duì)該病的防治防效甚微，因此，抗病品種的培育是控制棉花黃萎病發(fā)病的最有效方式。常規(guī)育種培育抗病棉花品種周期長(zhǎng)，加之棉花黃萎病致病菌大麗輪枝菌變異速度快。因此，快速、安全有效地篩選抗黃萎病棉花種質(zhì)資源，加速抗黃萎病的育種進(jìn)程對(duì)黃萎病防治具有積極的推進(jìn)作用[4-5]。

大麗輪枝菌的毒素被認(rèn)為是導(dǎo)致黃萎病發(fā)病的關(guān)鍵因素，研究表明：分離的糖肽是植株致萎的活性部分，該物質(zhì)是由脂和糖蛋白組成的復(fù)合體(protein-lipopolysaccharide complex，PLPC)[6]，目前認(rèn)為該毒素是由致病菌大麗輪枝菌分泌到體外而產(chǎn)生的，已從黃萎病培養(yǎng)液中分離獲得的糖蛋白具有致萎作用[7-8]，其中分泌蛋白VdSCP41在侵入棉花體內(nèi)后[9]，能與棉花免疫調(diào)節(jié)蛋白GhCBP60b的C端部分結(jié)合從而抑制其轉(zhuǎn)錄因子活性，使植物發(fā)病。分泌蛋白PevD1可誘導(dǎo)壞死現(xiàn)象及植物的超敏反應(yīng)[10-11]。由于泌外毒素可誘導(dǎo)植物產(chǎn)生黃萎病病癥，研究者試圖利用毒素獲得抗黃萎病的種質(zhì)資源，如利用黃萎病毒素浸根法和浸泡葉圓盤(pán)法檢測(cè)棉花對(duì)黃萎病的抗性資源[12]，利用粗毒素浸根鑒定棉花的致萎特性[13-14]。

目前黃萎病致病菌泌外毒素已從T9，VD8，SS-43等菌株[15-16]中獲得，從20世紀(jì)中葉至今，大麗輪枝菌泌外毒素的獲得一直采用傳統(tǒng)方法，如超濾法[17]、沉淀法[18]以及離子交換富集法[19]等，由于分泌蛋白的濃度低，且分泌的蛋白毒素是存在培養(yǎng)基的上清液之中，因此需要對(duì)上清液先濃縮，再進(jìn)行分離、鑒定，該過(guò)程不僅繁瑣而且工作量大，致病泌外毒素蛋白的獲得也成為研究難點(diǎn)之一，因此革新泌外毒素蛋白獲取的方式是毒素接種法鑒定抗黃萎病種質(zhì)資源的前提條件。光合作用是植物生長(zhǎng)發(fā)育重要的過(guò)程，在受到生物、非生物等逆境脅迫后植物光合系統(tǒng)對(duì)光能的吸收、傳遞和分配等情況會(huì)發(fā)生變化，因而影響葉綠素?zé)晒庑盘?hào)。利用葉綠素?zé)晒獾倪@個(gè)特點(diǎn)，解析葉綠素?zé)晒鈪?shù)的信號(hào)變化已成為篩選作物抗病性的一種重要方式，如大豆[20]，山葡萄[21]等抗病品種的篩選。

應(yīng)用大麗輪枝菌泌外毒素研究棉花抗黃萎病品種的篩選較為普遍，而研究大麗輪枝菌孢內(nèi)毒素在棉花抗黃萎病鑒定中的作用鮮見(jiàn)報(bào)道。并且病原菌侵染植物后，會(huì)導(dǎo)致植物葉片光合組織破壞，葉綠素?zé)晒鉁y(cè)定技術(shù)可快速、靈敏地反應(yīng)植物光系統(tǒng)的變化，實(shí)現(xiàn)對(duì)抗病種質(zhì)資源快速精準(zhǔn)鑒定。本試驗(yàn)擬在前人研究的基礎(chǔ)上，試圖尋求一種應(yīng)用范圍廣，方法便捷，快速篩選抗黃萎病棉花品種的新方法。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 病原菌 棉花黃萎病原菌-大麗輪枝菌V991(VerticilliumdaliaeKleb)由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院朱龍付課題組提供。

1.1.2 棉花品種 供試棉花品種(系)‘湘棉13號(hào)’‘中棉所12號(hào)’‘遼棉15號(hào)’‘渝棉1號(hào)’等23個(gè)，均由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所資源課題組提供，幼苗傷根接菌水培法及孢內(nèi)毒素浸泡的葉盤(pán)法所用的棉花品種為‘遼棉15號(hào)’。

1.1.3 供試試劑 馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Potato dextrose agar，PDA)培養(yǎng)基為Oxoid公司生產(chǎn)，其他的化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)試劑。

1.1.4 主要儀器 恒溫培養(yǎng)振蕩器HZ2-Ⅱ由金壇市醫(yī)療儀器廠生產(chǎn)，溫度梯度恒溫箱MT1-202B由日本東京理化公司生產(chǎn)，葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)IMAGING-PAM由德國(guó) Walz 公司生產(chǎn)。

1.2 方 法

1.2.1 培養(yǎng)基配制 培養(yǎng)大麗輪枝菌固體培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Potato dextrose agar，PDA)培養(yǎng)基，培養(yǎng)孢子的液體培養(yǎng)基是查氏(Czapek)培養(yǎng)基，PDA培養(yǎng)基按照生產(chǎn)商提供的方法配制，查氏(Czapek)培養(yǎng)基的配制方法：1 L水中加入葡萄糖30 g，NaNO32 g，K2HPO4·3H2O 1 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g， FeSO4·7H2O 0.01 g，完全溶解后，121 ℃高壓滅菌15 min。

1.2.2 大麗輪枝菌顯微觀察及分子鑒定 25 ℃下將大麗輪枝菌在PDA平板上培養(yǎng)10～14 d后，在菌落邊緣區(qū)域，用直徑5 mm的無(wú)菌打孔器制成菌餅，并將菌餅放置在斜插入蓋玻片的固體PDA培養(yǎng)基上，待菌絲長(zhǎng)至蓋玻片時(shí)，用光學(xué)顯微鏡觀察菌絲及分生孢子梗的形態(tài)，并以大麗輪枝菌DNA為模板，采用真菌通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGGTTATTGATATGC-3′)對(duì)病原菌rDNA-ITS序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.3 棉苗準(zhǔn)備及栽培 選取健康、飽滿的棉花種子，用70%乙醇處理1 min，再用15%過(guò)氧化氫消毒處理3～4 h，最后用去離子水沖洗3～4遍后，在28 ℃下催芽24 h 至種子露白，植入穴盤(pán)，土壤中蛭石與營(yíng)養(yǎng)土的體積比為2∶1， pH為 6.3，放入溫室中生長(zhǎng)，溫度28 ℃，光/暗周期為14 h/10 h，待子葉完全展開(kāi)后將苗移栽至營(yíng)養(yǎng)缽中，兩葉期的苗用于分生孢子水培浸根法，花期的葉片用于毒素侵染試驗(yàn)，苗生長(zhǎng)期所用的水均為去離子水。

1.2.4 大麗輪枝菌孢內(nèi)毒素的提取 將直徑為0.5 cm的棉花黃萎病菌餅接種到經(jīng)高溫高壓滅菌的Czapek’s培養(yǎng)液中，在25 ℃ 130 r/min的搖床中振蕩培養(yǎng)5～6 d，至分生孢子在三角瓶壁上有成團(tuán)結(jié)構(gòu)出現(xiàn)為止，經(jīng)140目和400目鋼篩雙層過(guò)濾后即可獲得孢子懸浮液，在常溫條件下， 14 000 r/min離心10 min，收集沉淀；并用滅菌水洗滌沉淀1 次，重復(fù)上次離心步驟，收集沉淀；加入相應(yīng)pH的0.05 mol/L磷酸緩沖液懸浮沉淀。設(shè)置高壓勻漿機(jī)的壓力為120 Mpa，在4 ℃條件下，高壓勻漿機(jī)反復(fù)研磨3～4 次，顯微觀察分生孢子破碎情況，統(tǒng)計(jì)不同研磨次數(shù)下的分生孢子的破碎率，直至分生孢子破碎為止，隨后， 在4 ℃，18 000 r/min離心25 min，取上清，并用 0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾除雜菌，最終得到濾液為供試毒素。

1.2.5 不同條件下大麗輪枝菌孢內(nèi)毒素的提取及致病力鑒定 分別設(shè)置毒素孢內(nèi)提取的pH為6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，按照“1.2.4”步驟提取毒素，將獲得的毒素的pH均調(diào)至7.0，用于不同pH條件下毒素葉盤(pán)浸泡試驗(yàn)；將pH 7.0條件下獲得的毒素，經(jīng)10 ℃、100 ℃(沸水浴煮沸)處理 1 h后用于毒素葉盤(pán)浸泡試驗(yàn)。毒素濃度采用Bradford法統(tǒng)計(jì)，所有葉盤(pán)毒素浸泡法試驗(yàn)所用毒素質(zhì)量濃度均為16 μg/μL。以去離子水作為對(duì)照，試驗(yàn)葉盤(pán)放入25 ℃溫室中，弱光培養(yǎng)15 d。統(tǒng)計(jì)病害等級(jí)，計(jì)算病情指數(shù)。

1.2.6 棉花品種對(duì)黃萎病的抗性鑒定 分生孢子水培浸根法：棉苗長(zhǎng)到一葉一心時(shí)，從盆栽中取出，用純凈水小心沖洗掉棉苗根部附著的蛭石與營(yíng)養(yǎng)土，用吸水紙吸去多余水分，并剪去棉苗根尖1 cm，將棉苗根部浸入20 mL濃度107mL-1的大麗輪枝菌V991孢子懸浮液中40 min，每個(gè)品系選取10株苗，3次重復(fù)，移入1/3MS水培培養(yǎng)液中，放入溫度25 ℃，光/暗周期14 h/10 h的溫室中生長(zhǎng)，10 d后統(tǒng)計(jì)病害等級(jí)，計(jì)算病情指數(shù)。

孢內(nèi)毒素圓盤(pán)鑒定法：依據(jù)文獻(xiàn)[8]毒素聯(lián)合法鑒定抗性，略做修改：在棉花花期，每個(gè)品系分別選取大小一致的15株棉花，取其正數(shù)第3片葉片，用圓形打孔器在葉片上打出30個(gè)直徑為1.5 cm的葉圓盤(pán)，然后將這些葉圓盤(pán)按照葉正面朝下的方式放入24孔板中，每一孔中分別加入200 μL的毒素，蓋上一層濾紙，以磷酸緩沖液處理為對(duì)照，放入24 ℃溫室中，進(jìn)行弱光培養(yǎng)15 d。統(tǒng)計(jì)病害等級(jí)，計(jì)算病情指數(shù)。

1.2.7 病情指數(shù)調(diào)查方法 在第15天調(diào)查分生孢子蘸根法處理的棉花黃萎病發(fā)病情況，按照溫室棉花苗期發(fā)病的5級(jí)制進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)算病情指數(shù)，劃分黃萎病的致病類型，分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)，健株，無(wú)癥狀；1級(jí)，1～2片子葉發(fā)??；2級(jí)，1片真葉發(fā)?。?級(jí)，2片以上真葉發(fā)病或脫落，僅剩心葉；4級(jí)，植株生長(zhǎng)點(diǎn)或全株枯死。

在毒素侵染15 d后調(diào)查葉圓盤(pán)棉花黃萎病發(fā)病情況，以個(gè)為單位，采用全面調(diào)查法，病情指數(shù)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)，葉片無(wú)病班；1級(jí)，整個(gè)葉面積中病斑面積占1～25%，葉片出現(xiàn)褐色斑點(diǎn)；2級(jí)，整個(gè)葉面積中病斑面積占26%～50%，葉片變黃或有部分褐色病斑；3級(jí)，整個(gè)葉面積中病斑面積占51%～74%，葉片變黃或有大部分褐色病斑；4級(jí)，整個(gè)葉面積中病斑面積占75%，葉片基本偏黃或褐色。根據(jù)病指對(duì)品種抗性進(jìn)行分類：病指=0，免疫；病指≤10，高抗；病指10.1～20.0，抗??；病指20.1～35.0，耐??；病指>35.1，感病。

1.2.8 調(diào)制葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)對(duì)感染毒素的葉盤(pán)成像過(guò)程的采集 棉花葉圓盤(pán)經(jīng)暗適應(yīng)30 min后，置于樣品臺(tái)，每個(gè)葉圓盤(pán)設(shè)定直徑為1.5 cm的感興趣區(qū)域AOI(area of interesting)，持續(xù)時(shí)間為15 s，在軟件的Kinetics窗口檢測(cè)出各葉圓盤(pán)葉綠素?zé)晒鈪?shù)的動(dòng)力學(xué)變化曲線，并由Report窗口導(dǎo)出。選用葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)，測(cè)定光系統(tǒng)Ⅱ最大光量子產(chǎn)量(Fv/Fm)，光系統(tǒng)Ⅱ?qū)嶋H光量子產(chǎn)量Y(Ⅱ)，非光化學(xué)淬滅(NPQ)，非調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量Y(NO)等葉綠素?zé)晒鈪?shù)，并對(duì)熒光參數(shù)的數(shù)字指標(biāo)和成像圖片進(jìn)行分析。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理 采用Microsoft Excel 2019及SPSS 26.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素(one-way ANOVA)和Duncan氏法進(jìn)行方差分析和差異顯著性檢驗(yàn)(α=0.05)，數(shù)據(jù)表示形式為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。利用Sigmaplot 14.0、Photoshop 2017對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析及作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 大麗輪枝菌V991的顯微觀察及菌株 ITS測(cè)序鑒定

進(jìn)一步對(duì)棉花大麗輪枝菌V991進(jìn)行顯微形態(tài)學(xué)鑒定，如圖(圖1-A，圖1-B)所示，菌絲和分生孢子為無(wú)色透明狀，菌絲與分生孢子梗不具備典型的輪枝菌屬形態(tài)，菌絲分枝及分生孢子梗存在輪枝(圖1-A,B中箭頭所指)與非輪枝兩種形態(tài)， 用通用引物ITS1/ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增rDNA -ITS(internal transcribed spacer, ITS)區(qū)段，并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果如圖1-C所示，在http://www.ncbi.nlm.nih.gov中利用BLAST比對(duì)分析，與大麗輪枝菌序列同源性為100%。結(jié)合其菌落的形態(tài)學(xué)特征將其鑒定為大麗輪枝菌。

A,B分別為大麗輪枝菌菌絲及分生孢子梗顯微形態(tài),Bar=20 μm；C為ITS1/ITS4 PCR擴(kuò)增序列

2.2 不同pH條件不同研磨次數(shù)下大麗輪枝菌V991的破碎情況

根據(jù)文獻(xiàn)[8]提取V991在培養(yǎng)過(guò)程中的泌外毒素，但植物無(wú)任何發(fā)病表征，猜測(cè)其致病毒素可能在分生孢子體內(nèi)，因此設(shè)定不同pH，使用在查氏培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d的分生孢子進(jìn)行破碎，結(jié)果如圖2-A所示，各分生孢子經(jīng)過(guò)高壓超聲破壁進(jìn)行第1次研磨后，孢子形態(tài)變化明顯，其中在pH 6.5和pH 8.5緩沖液中的分生孢子形態(tài)變化小，而在pH 7.0、 pH 7.5、 pH 8.0 緩沖液中的分生孢子經(jīng)過(guò)第一次研磨后分生孢子形態(tài)變化明顯，分生孢子互相連接成較大的結(jié)構(gòu)，成連片狀態(tài)，在所有pH中分生孢子經(jīng)過(guò)3次高壓超聲研磨后，各pH處理中大麗輪枝菌的分生孢子破碎率差異顯著(圖2-B)，pH 8.0緩沖液中的分生孢子破碎率最高為96.15%，pH 7.0緩沖液中的分生孢子破碎率最低為74.16%，說(shuō)明pH 8.0緩沖液是最佳的破碎緩沖液。

2.3 不同溫度、pH條件下獲得的大麗輪枝菌V991孢內(nèi)毒素對(duì)棉花致病力鑒定

設(shè)置毒素質(zhì)量濃度為16 μg/mL，采用葉圓盤(pán)毒素浸泡法對(duì)棉葉圓盤(pán)進(jìn)行致病力鑒定，比較不同pH、溫度條件下獲得的大麗輪枝菌V991孢內(nèi)毒素對(duì)棉花的致病性，結(jié)果如圖3所示，葉圓盤(pán)被大麗輪枝菌孢內(nèi)毒素侵染10 d后，病癥變化明顯，被pH 7.0、8.0、8.5 條件下提取的毒素侵染后各葉圓盤(pán)病癥較輕，僅個(gè)別葉圓盤(pán)黃化，有少數(shù)枯斑出現(xiàn)，被pH 6.5、7.5條件下提取的毒素侵染后各葉圓盤(pán)病癥較重，尤其是在pH 6.5條件下提取的孢內(nèi)毒素，葉圓盤(pán)不僅有黃化現(xiàn)象，并且枯斑面積顯著加大，說(shuō)明提取溫度10 ℃、提取液pH為 6.5時(shí)提取的孢內(nèi)毒素具有較高的致病力。將孢內(nèi)毒素在100 ℃煮沸1 h 后，比較 10 ℃、100 ℃條件下提取的孢內(nèi)毒素對(duì)葉圓盤(pán)的致病力，如圖3所示，提取緩沖液為10 ℃時(shí)葉圓盤(pán)的病癥明顯重于100 ℃時(shí)的病癥，黃化和枯斑現(xiàn)象顯著加重，說(shuō)明10 ℃提取的孢內(nèi)毒素具有較高的致病力。

圖3 不同pH、溫度下提取的大麗輪枝菌孢內(nèi)毒素對(duì)棉花致病力鑒定Fig.3 Identification of cotton pathogenicity treated with endotoxin from V.dahlia conidia extracted at different pH and temperatures

2.4 分生孢子浸根法與孢內(nèi)毒素圓盤(pán)浸泡法對(duì)抗黃萎病棉花品種鑒定

選取分生孢子浸根水培法與孢內(nèi)毒素葉盤(pán)法對(duì)5個(gè)棉花品種(系)的抗黃萎病性進(jìn)行比較，計(jì)算各棉花材料的病情指數(shù)，結(jié)果如表1所示，2890水培法病情指數(shù)為13.3，圓盤(pán)法病情指數(shù)為 16.6，均在20以內(nèi)，根據(jù)棉花品種抗性鑒定標(biāo)準(zhǔn)可定性為抗性品種，‘湘棉13號(hào)’水培法病情指數(shù)為28.3，圓盤(pán)法病情指數(shù)為33.3，均在21～35以內(nèi)，根據(jù)棉花品種抗性鑒定標(biāo)準(zhǔn)定為耐病品種，‘渝棉1號(hào)’‘遼棉15號(hào)’‘中棉12號(hào)’的水培法病情指數(shù)分別為53.3、76.6、73.3，圓盤(pán)法病情指數(shù)分別為56.25、72.91、54.16，病情指數(shù)均大于35，根據(jù)棉花品種抗性鑒定標(biāo)準(zhǔn)可定為感病品種，說(shuō)明孢內(nèi)毒素浸泡葉圓盤(pán)法進(jìn)行抗性鑒定的結(jié)果與分生孢子浸根法鑒定結(jié)果一致，獲得的大麗輪枝菌的孢內(nèi)毒素可用于棉花抗黃萎病鑒定。

表1 幼苗傷根接菌水培法與孢內(nèi)毒素浸泡的葉盤(pán)法病情指數(shù)比較Table 1 Disease index comparison between hydroponic cultivation of injured roots of seedlings inoculated with pathogen and leaf disc soaked with endotoxin

2.5 接種大麗輪枝菌V991孢內(nèi)毒素后的葉盤(pán)外觀特征及葉綠素?zé)晒獬上褡兓?/h3>

選取孢內(nèi)毒素葉圓盤(pán)法對(duì)上述5個(gè)參試棉花品種(系)的抗黃萎病特性進(jìn)行葉綠素?zé)晒獬上裼^察，比較各棉花品種(系)接種大麗輪枝菌孢內(nèi)毒素后的葉盤(pán)外觀特征及葉綠素?zé)晒獬上竦淖兓?。如圖4所示，不同品種被大麗輪枝菌毒素侵染3 d后，與侵染1 d后的進(jìn)行對(duì)比，可看到圓盤(pán)發(fā)病面積有明顯差異，抗病品系2890不管是從掃描儀下觀察，或者各熒光參數(shù)成像圖都沒(méi)有明顯的變化，維持較為健康的組織形態(tài)。耐病品種‘湘棉1號(hào)’

A為不同棉花品種接種大麗輪枝菌V991孢內(nèi)毒素后的葉盤(pán)外觀特征；B、C、D、E分別為接種大麗輪枝菌V991孢內(nèi)毒素后各棉花品種葉盤(pán)葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm、Y(NO)、Y(Ⅱ)及NPQ的日變化成像圖； F為熒光強(qiáng)度值

經(jīng)毒素侵染3 d后，葉盤(pán)外觀和最大光量子產(chǎn)量(Fv/Fm)，實(shí)際光量子產(chǎn)量Y(Ⅱ)、非光化學(xué)淬滅系數(shù)(NPQ)熒光參數(shù)圖像變化不明顯，而非調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量Y(NO)熒光圖在第3天顏色發(fā)生明顯變化；感病品種‘渝棉1號(hào)’‘中棉12號(hào)’‘遼棉15號(hào)’的Fv/Fm、Y(Ⅱ)、NPQ、NO 4種熒光圖在第3天就發(fā)生明顯變化，其中‘中棉12號(hào)’‘遼棉15號(hào)’，隨著毒素侵染時(shí)間的加長(zhǎng)，F(xiàn)v/Fm、Y(Ⅱ)、NPQ、Y(NO)熒光圖像響應(yīng)變?nèi)酰诙舅厍秩? d后，F(xiàn)v/Fm，Y(Ⅱ)，NPQ甚至熒光響應(yīng)逐漸為0。

圖5 棉花接種大麗輪枝菌孢內(nèi)毒素后的葉綠素?zé)晒鈪?shù)的天變化趨勢(shì)及傳統(tǒng)病指法抗黃萎病鑒定Fig.5 Day-to-day variation trend of chlorophyll fluorescence parameters inoculated with V.dahliae endotoxin and resistance identification to Verticillium wilt by the traditional disease index method

2.6 接種大麗輪枝菌V991后葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化

比較上述5個(gè)棉花品種(系)被大麗輪枝菌毒素侵染11 d的葉綠素?zé)晒鈪?shù)變化情況，分析抗、感病棉花品種葉綠素?zé)晒鈪?shù)變化的差異，結(jié)果如圖5，抗/耐病棉花品種(系)2890‘湘棉13號(hào)’與感病品種相比，在11 d的毒素侵染過(guò)程中， 葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm變化趨勢(shì)并不明顯，而熒光參數(shù)Y(Ⅱ)、NPQ、Y(NO)則變化明顯，抗/耐病品種的熒光參數(shù)Y(Ⅱ)、NPQ、Y(NO)能分別形成倒勺狀、緊湊的“W”型及“M”型，感病品種的Y(Ⅱ)無(wú)明顯形狀，而NPQ、Y(NO)則分別形成松散的“W”型及“M”型，并且抗/耐病品種形成的“W”“M”型的中心明顯早于感病品種。

2.7 抗黃萎病棉花品種鑒定的可靠性應(yīng)證

以感/耐病品種(系)2890‘湘棉13號(hào)’為抗/耐棉花品種的陽(yáng)性對(duì)照，以‘中棉12號(hào)’為感病品種的陽(yáng)性對(duì)照，采用葉綠素?zé)晒鈪?shù)的天變化趨勢(shì)為抗性鑒定依據(jù)，采用孢內(nèi)毒素葉圓盤(pán)法對(duì)15個(gè)棉花品種(系)進(jìn)行抗病性鑒定，結(jié)果表明(圖6-A,6-B,6-C)，‘冀棉8號(hào)’在11 d的毒素侵染過(guò)程中，熒光參數(shù)Y(Ⅱ)、NPQ、Y(NO)與抗/耐棉花品種(系)2890‘湘棉13號(hào)’的熒光參數(shù)形成的趨勢(shì)圖相似，均分別形成平緩的倒勺狀、緊湊的“W”型及“M”型，并且“W”型及“M”型形成中心的時(shí)間也與抗/耐品種接近，而其他棉花品種的葉綠素?zé)晒飧鲄?shù)均無(wú)顯著的變化趨勢(shì)，暗示‘冀棉8號(hào)’為抗/耐病棉花品種。采用分生孢子浸根法和孢內(nèi)毒素葉盤(pán)浸泡法，進(jìn)一步比較18個(gè)棉花品種的病情指數(shù)，結(jié)果如圖6-D所示，‘冀棉8號(hào)’為耐病品種，說(shuō)明采用孢內(nèi)毒素葉盤(pán)法鑒定棉花抗病性，由棉花品種所產(chǎn)生的相應(yīng)葉綠素?zé)晒鈪?shù)Y(Ⅱ)、NPQ、Y(NO)的變化趨勢(shì)可作為抗/耐棉花種質(zhì)資源鑒定的方式之一。

圖6 不同棉花品種接種大麗輪枝菌V991孢內(nèi)毒素后的葉綠素?zé)晒鈪⒌奶熳兓厔?shì)Fig.6 Day-to-day change trend of chlorophyll fluorescence of different cotton varieties inoculated with endotoxin from V.dahliae V991

3 討 論

棉花黃萎病一直是世界各國(guó)想要解決的一種嚴(yán)重棉花病害，最經(jīng)濟(jì)有效的方法就是選育、種植抗病品種，人工室內(nèi)接種鑒定是棉花種質(zhì)資源抗病性鑒定的重要方法之一，該方法可有效控制環(huán)境因子，確保接菌種類的純度，避免其他雜菌的侵染，從而確保試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。目前分生孢子浸根法是室內(nèi)棉花黃萎病苗期鑒定的一種重要方式，但該方法周期較長(zhǎng)，并且可能因?yàn)閭潭鹊恼`差導(dǎo)致被侵染棉苗出現(xiàn)“假抗性”，毒素鑒定法是近年來(lái)一直采用的并不斷改進(jìn)的方法，解決了因傷根不均一造成的試驗(yàn)誤差，是鑒定棉花黃萎病抗病性的理想材料。但其獲取的毒素大多是采用泌外方式獲得，這種方式費(fèi)工費(fèi)力，并且分離致病毒素的菌株有限，限制了試驗(yàn)的進(jìn)一步進(jìn)行。鑒于這種情況，本研究以大麗輪枝菌V991為研究對(duì)象，從分生孢內(nèi)獲取了毒素，突破了原有毒素提取的泌外方式的瓶頸限制，得到了毒素提取的新方法，獲得滿足試驗(yàn)需求的致病毒素，并利用葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)監(jiān)控由毒素引發(fā)的寄主植物葉綠素?zé)晒獬上窦盁晒鈪?shù)的變化，實(shí)現(xiàn)快速對(duì)抗黃萎病棉花品種的篩選。

前期研究結(jié)果表明，葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)已成為作物抗病育種過(guò)程中的一種重要的輔助手段[22-24]，可有效加速育種進(jìn)程，比較不同抗性的山葡萄接種病菌后，病斑周圍組織ФPSⅡ與 rETR這兩個(gè)熒光參數(shù)指標(biāo)可作為篩選山葡萄抗霜霉病種質(zhì)鑒定的評(píng)價(jià)指標(biāo)。對(duì)8個(gè)枸杞品種接種枸杞根腐病致病菌尖孢鐮刀菌后[25]，感病品種中的Fm/Fv、ΦPSⅡ、Fv/Fm、qP以及NPQ 5個(gè)葉綠素?zé)晒鈪?shù)指標(biāo)的變化可以作為感病初期判斷的標(biāo)志。

本研究綜合了前人研究結(jié)果，以大麗輪枝菌孢內(nèi)毒素為研究對(duì)象，利用葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)監(jiān)測(cè)毒素與棉花葉盤(pán)互作過(guò)程中各熒光指標(biāo)的變化，以5個(gè)不同棉花品種的棉葉盤(pán)進(jìn)行毒素浸泡接種，各棉花品種(系)的Y(Ⅱ)、NPQ 、Y(NO)這3個(gè)熒光參數(shù)天變化趨勢(shì)明顯，在11 d的調(diào)查中，分別呈現(xiàn)緊湊的倒勺狀、“W”型和“M”型，該方法通過(guò)分生孢子水培法進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，證明上述方法的可靠性，進(jìn)一步確定抗/感棉花-毒素互作時(shí)與葉綠素?zé)晒庾兓南嚓P(guān)性，建立棉花黃萎病抗性鑒定方法。由于植物受到逆境影響后，存在生態(tài)適應(yīng)性問(wèn)題[26-27]，因此，本研究采用熒光指數(shù)天變化趨勢(shì)作為鑒定抗病性的指標(biāo)，以前期獲得的5個(gè)棉花品種(系)中的抗(耐)病品種(系)‘2890’‘湘棉13號(hào)’作為陽(yáng)性對(duì)照，隨后比較17個(gè)棉花品種接種大麗輪枝菌V991孢內(nèi)毒素后的Y(Ⅱ)、NPQ、Y(NO)這3個(gè)熒光參數(shù)天變化趨勢(shì)，最終獲得1個(gè)耐病品種‘冀棉8號(hào)’，該方法也經(jīng)過(guò)了分生孢子水培法的進(jìn)一步驗(yàn)證。通過(guò)棉花黃萎病致病菌V991孢內(nèi)毒素葉盤(pán)鑒定法，初步確定Y(Ⅱ)、NPQ、Y(NO)葉綠素?zé)晒庵笜?biāo)的天變化趨勢(shì)可用于棉花抗黃萎病種質(zhì)資源鑒定中，但是因參與測(cè)試的品種較少，其形成的鑒定機(jī)制仍需大量數(shù)據(jù)應(yīng)證。

4 結(jié) 論

確定了棉花黃萎病致病菌大麗輪枝菌V991孢內(nèi)毒素提取的方法，最佳的提取溫度為10 ℃，pH為6.5；通過(guò)葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)建立適用于大批量快速鑒定棉花黃萎病抗性的技術(shù)，即當(dāng)棉花長(zhǎng)至花期采用倒3～4 片真葉，使用16 μg/mL的毒素質(zhì)量濃度，采用毒素葉圓盤(pán)浸泡法進(jìn)行接種，接種后管理溫度為 25 ℃左右，每隔2 d調(diào)查各棉花品種葉圓盤(pán)葉綠素?zé)晒鈪?shù)Y(Ⅱ)，NPQ，Y(NO)天變化趨勢(shì)，以抗/耐病品種(系)‘2890’‘湘棉13號(hào)’為對(duì)照，在11 d的調(diào)查中，當(dāng) Y(Ⅱ)，NPQ，Y(NO)分別呈現(xiàn)緊湊的倒勺狀、“W”型和“M”型時(shí)，可用于棉花抗/耐黃萎病種質(zhì)資源的鑒定。