雷 萍，張文雋，郝 哲，馬婧嘉，梁海燕，李雅茹，吳亞召

(1.陜西省微生物研究所，西安 710043；2.榆林市農(nóng)墾服務中心，陜西榆林 719000)

靈芝(Ganodermalucidum)隸屬擔子菌門(Basidiomycota)傘菌綱(Agaricomycetes)多孔菌目(Polyporales)靈芝科(Ganodermataceae)靈芝屬(Ganoderma)，別稱赤芝、紅芝、木靈芝、萬年蕈、靈芝草等[1]，是一類珍貴的藥用大型真菌。在中國已有2000多年的記載和應用歷史[2]，據(jù)《神農(nóng)本草經(jīng)》記載：靈芝主治胸中結、益心氣、增智慧、不忘、延年[3]。現(xiàn)代研究表明靈芝含有多糖、三萜類、甾醇類、黃酮類、酚類、氨基酸類、糖苷類等活性成分[4-5]，其具有抗腫瘤、抗衰老、抗氧化、保肝護肝、降血糖血脂、治療慢性腎病等顯著的藥理功效[6-13]，已被開發(fā)成多種藥品和保健品，成為現(xiàn)代醫(yī)學研究的熱點。

目前，中國已發(fā)現(xiàn)靈芝科4個屬種質(zhì)資源103種，占世界已知靈芝科種類的88%[14]。但現(xiàn)階段中國人工栽培的靈芝菌株基本引自韓國和日本等地，存在菌種活性退化、產(chǎn)量低、品質(zhì)差、抗雜抗病能力不強等問題，適宜中國各產(chǎn)地栽培、具有自主知識產(chǎn)權的優(yōu)良品種缺乏[15]。同時野生靈芝形態(tài)特征常受外部環(huán)境影響而發(fā)生變化，不同靈芝科的不同種經(jīng)常共有許多鑒別性特征，僅利用傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒定較為困難，有必要利用分子生物學技術鑒定其種屬。本研究對采自陜西省安康市平利縣山區(qū)的一株野生靈芝進行ITS序列分析鑒定，并系統(tǒng)研究其適合生長的培養(yǎng)條件，分析比較人工栽培子實體主要活性成分，以期為野生靈芝種質(zhì)資源的科學開發(fā)利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試菌株 2020-06-28于陜西省安康市平利縣山區(qū)一棵枯樹樁基部采集野生靈芝子實體，組織分離獲得純菌絲，編號為靈芝-LG；對照菌株靈芝SW01和泰山靈芝為陜西省微生物研究所微生物技術研究中心保藏菌種。

1.1.2 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯(去皮、浸汁)200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然；基礎培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，蛋白胨5 g，磷酸二氫鉀1 g，硫酸鎂0.5 g，維生素B110 mg，瓊脂粉20 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然；栽培培養(yǎng)基：木屑44%，棉籽殼44%，麩皮5%，玉米粉5%，蔗糖1%，石膏1%，料水比1∶1.2。

1.2 基于ITS序列分析的生物學鑒定

1.2.1 基因組DNA提取 取0.5 g菌絲體置于研缽，加入液氮充分研磨，將樣品粉末移入盛有CTAB的小管55～65 ℃孵育1 h，放置室溫后加入等體積氯仿/異戊醇抽提，12 000 r/min、室溫離心10 min取上清液，加入1倍體積NaAC和異丙醇沉淀DNA，12 000 r/min、4 ℃離心20 min棄上清液，70%乙醇洗滌沉淀2次，干燥后加入TE緩沖液溶解，以0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量和濃度。

1.2.2 ITS序列擴增及檢測 采用通用引物ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)和ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)進行rDNA ITS區(qū)段的PCR擴增[16]。擴增條件：94 ℃預變性4 min，94 ℃變性60 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，30個循環(huán)；72 ℃反應10 min，10 ℃終止。用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行電泳檢測。

1.2.3 rDNA ITS序列克隆與測序 擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，以PCR純化試劑盒回收后連接入pEASY○R-T1載體，使用TOP10轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物，培養(yǎng)1 h后涂平板培養(yǎng)，隨機挑選陽性克隆送至北京天一輝遠生物公司進行序列 測定。

1.2.4 分子鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析 對所得ITS序列進行校正，在GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫中進行同源性比較搜索(BLASTn)。根據(jù)搜索結果下載與之相關的序列，以ClustalX(1.83)進行序列比對，采用MEGA 7.0進行系統(tǒng)學分析，構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 生物學特性試驗

1.3.1 碳源選擇試驗 按照基礎培養(yǎng)基，分別以葡萄糖、蔗糖、甘露醇、乳糖、D-麥芽糖、可溶性淀粉、玉米粉各20 g/L作為碳源，以不加碳源作為對照。采用直徑80 mm的培養(yǎng)皿，每個培養(yǎng)皿分別加入20 mL培養(yǎng)基，制備好平板培養(yǎng)基后于中央接種一塊直徑0.5 cm的菌種塊，26 ℃恒溫培養(yǎng)，每個處理6次重復，觀察記錄菌絲生長情況。

1.3.2 氮源選擇試驗 按照基礎培養(yǎng)基，分別以蛋白胨、酵母膏、硝酸鉀、硫酸銨、硝酸銨、尿素、麩皮各5 g/L作為氮源，以不加氮源作為對照。方法同上。

1.3.3 無機鹽選擇試驗 按照基礎培養(yǎng)基，分別以磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、硫酸鈉各1 g/L作為無機鹽，以不加無機鹽作為對照。方法同上。

1.3.4 初始pH選擇試驗 配制PDA培養(yǎng)基，以濃度1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)初始pH分別為：5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和9.0。方法同上。

1.3.5 溫度選擇試驗 以PDA培養(yǎng)基制備平板，采用直徑80 mm的培養(yǎng)皿，每個培養(yǎng)皿分別加入20 mL培養(yǎng)基，制備好平板培養(yǎng)基后于中央接種一塊直徑0.5 cm的菌種塊，分別于18 ℃、 20 ℃、22 ℃、24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃和 34 ℃條件下恒溫培養(yǎng)，每個處理6次重復，觀察記錄菌絲生長情況。

1.3.6 正交優(yōu)化試驗 在單因素篩選的基礎上，選擇最佳碳源(葡萄糖∶蔗糖=1∶1)、氮源、無機鹽及初始pH進行四因素三水平正交試驗，試驗因素及其各水平見表1。

1.3.7 測定方法 待菌絲萌發(fā)2 d后，采用十字交叉法測量菌落直徑，繼續(xù)培養(yǎng)5 d再測量一次并計算菌絲生長速度。計算公式如下：

菌絲生長速度(mm/d)=菌落半徑增長度(mm)/菌絲生長時間(d)

1.4 活性成分分析

1.4.1 樣品制備 按照栽培培養(yǎng)基制備栽培袋，分別接入待測菌種和對照菌種，菌絲滿袋成熟后常規(guī)管理方法出芝，待子實體成熟采收。于65 ℃鼓風干燥箱中烘干至恒質(zhì)量，粉碎，過孔徑為 0.25 mm(60目)篩網(wǎng)，收集粉末密封保存，備用。

表1 L9(34)正交試驗的因素及水平Table 1 Factors and its levels in L9(34) orthogonal test

1.4.2 多糖含量測定 準確稱取樣品0.5 g于250 mL具塞錐形瓶中，加入15 mL蒸餾水，95 ℃水浴提取2 h，過濾，濾液置50 mL容量瓶，濾渣重復提取1次，過濾，合并兩次濾液于同一容量瓶中，加入蒸餾水定容至刻度，搖勻，即得水提液。吸取5 mL水提液加入95%乙醇20 mL，4 ℃醇沉24 h，離心，沉淀用蒸餾水定容至10 mL，搖勻，即得供試品溶液。以葡萄糖為標準品，采用蒽酮-硫酸法測定多糖含量[17]。

1.4.3 三萜含量測定 參考《中國藥典》2020年版靈芝三萜含量測定方法[18]。準確稱取樣品2.0 g于250 mL具塞錐形瓶中，加入90%乙醇50 mL，超聲處理(功率140 W，頻率42 kHz)45 min，過濾，濾液置100 mL容量瓶，90%乙醇分次洗滌濾器和濾渣，洗液并入同一容量瓶中，加入90%乙醇定容至刻度，搖勻，即得供試品溶液。以齊墩果酸為標準品，采用香草醛-冰醋酸法測定三萜含量。

1.4.4 蛋白質(zhì)含量測定 準確稱取樣品0.25 g放入凱氏定氮瓶中，同時加入6 g硫酸鉀和0.4 g硫酸銅，然后加入10 mL濃硫酸，充分搖勻。采用微量凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量[19]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用ClustalX(1.83)和MEGA 7.0軟件，對待測菌株和與之相關的ITS序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析；采用SPSS 17.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，對相關試驗數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 基于ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

通過ITS序列檢測分析，確定靈芝-LG菌株的ITS片段序列長度為635 bp；通過GenBank數(shù)據(jù)庫同源性比對，結果表明靈芝-LG與Ganodermalucidum(GenBank號EU021456.1)序列同源性為100%；下載與之相關的靈芝屬菌株ITS序列，利用MEGA 7.0構建系統(tǒng)發(fā)育樹，由圖1可以看出，靈芝-LG與Ganodermalucidum以100%支持率聚在一起，系統(tǒng)發(fā)育樹結果與同源性比對結果表現(xiàn)出較高的一致性，進一步說明系統(tǒng)進化樹的可靠性。因此，可以確定該野生菌株靈芝-LG為赤芝[Ganodermalucidum(Curtis) P.Karst.]。

圖1 基于rDNA ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree based on rDNA ITS sequence

2.2 菌絲生物學特性

2.2.1 碳源對靈芝-LG菌絲生長的影響 試驗考察不同碳源對靈芝-LG菌絲生長的影響，結果如表2所示，靈芝-LG菌絲在7種培養(yǎng)基上均能生長，且優(yōu)于空白對照。其中以玉米粉為碳源時菌絲生長速度最快(7.69 mm/d)，但菌絲生長勢較差，菌絲白色、較纖弱無力、較稀疏、邊緣較整齊；當以葡萄糖、蔗糖為碳源時，菌絲生長速度次于前者，分別為5.59 mm/d和5.56 mm/d，兩者之間差異不顯著，且菌絲生長勢均較好；以乳糖作為碳源時，菌絲生長速度最慢(2.95 mm/d)，菌絲生長勢也較差，菌絲白色、較纖弱無力、較稀疏、邊緣較整齊。因此，綜合考察菌絲生長速度和生長勢，靈芝-LG菌絲生長最適碳源為葡萄糖和蔗糖。

表2 碳源對靈芝-LG菌絲生長的影響Table 2 Effect of carbon source on mycelia growth of G.lucidum-LG

2.2.2 氮源對靈芝-LG菌絲生長的影響 試驗考察不同氮源對靈芝-LG菌絲生長的影響，結果如表3所示，從表中可以看出靈芝-LG在7種培養(yǎng)基上均能生長，不添加任何氮源則菌絲幾乎不生長，各組之間差異顯著。其中，以酵母膏為氮源時菌絲生長速度最快(7.30 mm/d)，菌絲生長勢好，潔白、粗壯有力、濃密、邊緣整齊；以麩皮為氮源時菌絲生長速度次之(7.01>mm/d)，但菌絲生長勢差，菌絲白色、纖弱無力、稀疏、邊緣較整齊；以硝酸銨為氮源時菌絲生長速度最差(2.91 mm/d)，菌絲白色、較纖弱無力、較稀疏、邊緣不整齊。因此，綜合考察菌絲生長速度和生長勢，靈芝-LG菌絲生長最適氮源為酵母膏。

表3 氮源對靈芝-LG菌絲生長的影響Table 3 Effect of nitrogen source on mycelia growth of G.lucidum-LG

2.2.3 無機鹽對靈芝-LG菌絲生長的影響 考察不同無機鹽對靈芝-LG菌絲生長的影響，結果如表4所示，從表中可以看出靈芝-LG在6種無機鹽培養(yǎng)基上均能生長，且不添加任何無機鹽時菌絲仍然可以正常生長，各組之間差異顯著。其中，以磷酸二氫鉀為無機鹽時菌絲生長速度最快(5.43 mm/d)，菌絲生長勢好，潔白、粗壯有力、濃密、邊緣整齊；以硫酸鎂為無機鹽時菌絲生長速度次之(5.04 mm/d)，菌絲生長勢也好；以氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、硫酸鈉為無機鹽時，菌絲生長速度均較不添加任何無機鹽時還差，其中以氯化鉀效果最差，菌絲生長速度2.74 mm/d，菌絲生長勢也較差，菌絲潔白、較纖弱無力、較稀疏、邊緣較整齊。因此，綜合考察菌絲生長速度和生長勢，靈芝-LG菌絲生長最適無機鹽為磷酸二氫鉀。

表4 無機鹽對靈芝-LG菌絲生長的影響Table 4 Effect of inorganic salts on mycelia growth of G.lucidum-LG

2.2.4 初始pH對靈芝-LG菌絲生長的影響 考察培養(yǎng)基不同初始pH對靈芝-LG菌絲生長的影響，結果如表5所示。靈芝-LG在初始pH 5.0～9.0之間均能生長，其中初始pH為7.0時菌絲生長速度最快(6.32 mm/d)，菌絲生長勢好，潔白、粗壯有力、濃密、邊緣整齊；初始pH為7.5時菌絲生長速度次之 (6.01 mm/d)，菌絲生長勢較好，潔白、較粗壯有力、較濃密、邊緣較整齊；當初始pH為5.5和5.0時，菌絲生長速度均最差，兩者之間差異不顯著，但初始pH 5.0的菌絲生長勢更差，菌絲潔白、較纖弱無力、較稀疏、邊緣較整齊。因此，綜合考察菌絲生長速度和生長勢，靈芝-LG菌絲生長最適初始pH為7.0。

表5 初始pH對靈芝-LG菌絲生長的影響Table 5 Effect of initial pH on mycelia growth of G.lucidum-LG

2.2.5 溫度對靈芝-LG菌絲生長的影響 考察不同培養(yǎng)溫度對靈芝-LG菌絲生長的影響，結果如表6所示。靈芝-LG菌絲在溫度18～34 ℃之間均能生長，其中26 ℃、 28 ℃條件下菌絲生長速度均最快，兩者之間無顯著差異，分別為5.23 mm/d和5.17 mm/d，菌絲生長勢均較佳；培養(yǎng)溫度為30 ℃時菌絲生長速度次之(3.12 mm/d)，但菌絲生長勢較弱，24 ℃菌絲生長速度較前者稍慢(2.75 mm/d)，但菌絲生長勢較好；18 ℃時菌絲生長速度與生長勢均最差。因此，綜合考察菌絲生長速度和生長勢，靈芝-LG菌絲生長適宜溫度為26～28 ℃。

2.2.6 正交試驗優(yōu)化結果與直觀分析 根據(jù)單因素篩選試驗結果，選取最佳碳源、氮源、無機鹽及初始pH進行四因素三水平正交試驗，結果見表7。由表中可以看出，4個因素碳源、氮源、無機鹽和初始pH的極差R分別為2.19、1.23、0.89和0.92，所以影響靈芝-LG菌絲生長的因素依次為A(碳源)>B(氮源)>D(初始pH)>C(無機鹽)；其中，碳源均值由大至小依次為X3>X2>X1，氮源為X2>X1>X3，無機鹽為X2>X1>X3，初始pH為X1>X3>X2，可以得出最佳因子組合為A3B2C2D1，即靈芝-LG的最佳培養(yǎng)條件為葡萄糖15 g/L、蔗糖15 g/L、酵母膏5 g/L、磷酸二氫鉀1 g/L、初始pH 6.5。

表6 溫度對靈芝-LG菌絲生長的影響Table 6 Effect of temperature on mycelia growth of G.lucidum-LG

2.3 主要活性成分

考察試驗菌株靈芝-LG與對照菌株靈芝SW01、泰山靈芝人工栽培子實體主要活性成分含量，結果見表8。同等培養(yǎng)條件下，靈芝-LG的多糖含量最高(1.42%)，泰山靈芝次之，靈芝SW01最差，三者之間差異顯著；靈芝-LG的三萜含量也最高(3.05%)，靈芝SW01和泰山靈芝次之，前者與后兩者之間差異顯著，后兩者之間無顯著差異；靈芝-LG的蛋白質(zhì)含量為17.74%，稍低于對照菌株靈芝SW01(18.43%)，泰山靈芝最差，三者之間差異顯著。綜合考察3種主要活性成分多糖、三萜和蛋白質(zhì)的總含量，靈芝-LG明顯高于2個對照菌株靈芝SW01和泰山靈芝，為一株活性成分含量較高的栽培品種。

表7 L9(34)正交試驗結果直觀分析表Table 7 Intuitive analysis table for result of L9(34) orthogonal test

表8 不同靈芝活性成分含量比較Table 8 Comparison of active components of different kinds of G.lucidum

3 討 論

靈芝是一類具有重要經(jīng)濟價值的藥用真菌，在我國應用歷史悠久，目前文獻記載可栽培或有利用價值的靈芝屬種類大約有17種。靈芝屬傳統(tǒng)分類方法以子實體的外部特征、形態(tài)結構解剖及擔孢子的特征為主，易受環(huán)境因素影響，無法客觀的區(qū)別各菌株間的類源關系，分子生物學鑒定手段具有客觀性、穩(wěn)定性、準確性，是傳統(tǒng)分類手段的重要補充[20]。本研究采用ITS序列分析技術對靈芝-LG菌株的ITS序列進行同源性比對和系統(tǒng)發(fā)育樹構建，確定采集自陜西省安康市平利縣山區(qū)的野生菌株靈芝-LG為赤芝[Ganodermalucidum(Curtis) P.Karst.]，明確了該野生菌株的分類學地位。

菌絲生長速度和長勢是優(yōu)質(zhì)菌株選擇的重要指標之一[21]。本研究通過單因素試驗，確定了野生菌株靈芝-LG菌絲生長最適碳源為葡萄糖和蔗糖，最適氮源為酵母膏，最適無機鹽為磷酸二氫鉀，最適初始pH為7.0，適宜培養(yǎng)溫度為26～ 28 ℃；進一步正交優(yōu)化得到最佳培養(yǎng)條件：葡萄糖15 g/L，蔗糖15 g/L，酵母膏5 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，初始pH 6.5。與其他研究結果對比發(fā)現(xiàn)不同種類的靈芝培養(yǎng)條件有一定差異，馬博等[22]報道有柄靈芝最適碳源為果糖或葡萄糖，氮源為酵母提取物，溫度為30 ℃，pH 5.5；陳旭等[23]報道鹿角靈芝優(yōu)質(zhì)碳氮源分別為可溶性淀粉、蛋白胨，最佳培養(yǎng)條件為初始pH 6.0和 30 ℃；蘭玉菲等[24]報道靈芝、樹舌靈芝和紫芝的最適碳源分別為蔗糖、葡萄糖和麥芽糖，最適氮源均為酵母膏，靈芝菌絲最適培養(yǎng)溫度為25 ℃，樹舌靈芝和紫芝為25～30 ℃。不同靈芝菌株菌絲培養(yǎng)條件之所以存在差異，可能和菌株所在生境長期馴化有關。因此，只有研究明確野生菌株的生物學特性，才有利于進一步研究應用。

中國野生靈芝種質(zhì)資源豐富，但由于其不合理的開發(fā)利用，近年來成功商業(yè)栽培的靈芝種類有限，部分菌種出現(xiàn)菌種退化現(xiàn)象，有必要選擇性能優(yōu)良的野生菌株進行進一步馴化栽培，開發(fā)活性物質(zhì)高的栽培品種[25]。本研究中同等培養(yǎng)條件下，靈芝-LG人工栽培子實體多糖、三萜含量分別為1.42%和3.05%，明顯高于對照菌株；蛋白質(zhì)含量為17.74%，雖稍低于對照菌株靈芝SW01，但3種主要活性成分多糖、三萜和蛋白質(zhì)的總含量明顯高于2株對照菌株靈芝SW01和泰山靈芝。綜上所述，野生菌株靈芝-LG為一株活性成分含量較高的栽培品種，可進一步系統(tǒng)研究其栽培特性和藥理功效，以期通過科學的栽培管理更好的提高活性成分含量，并充分開發(fā)利用其藥用價值。