趙淑芳，茍秉調(diào)，魏 敏，段盼盼，王永富，楊 楠，張高原，魏兵強

(甘肅農(nóng)業(yè)大學 園藝學院，蘭州 730070)

海藻糖(Trehalose)是一種由兩個吡喃環(huán)葡萄糖分子以α，α-1，1糖苷鍵連接而成非還原性雙糖[1-2]。海藻糖-6-磷酸合酶(TPS)和海藻糖-6-磷酸磷酸酶(TPP)是海藻糖合成途徑中的兩種關(guān)鍵酶。首先，UDP-葡萄糖(UDPG)和葡萄糖-6-磷酸在TPS的催化下合成海藻糖-6-磷酸(T6P)，其次，通過TPP將T6P去磷酸化生成海藻糖[3]。海藻糖作為一種碳水化合物的儲存形式、能量來源物質(zhì)和應(yīng)激保護物質(zhì)，普遍存在于細菌、酵母、真菌、線蟲和昆蟲及脊椎動物中[4-5]。在微生物中，海藻糖還通過穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和生物膜起到抵御高溫和干旱脅迫的作用，但其在植物中的含量極低[6-7]。盡管如此，微量的海藻糖及其生物合成的中間體T6P在植物的生長發(fā)育和代謝中起著關(guān)鍵作用[1,8]，其參與植物的生物合成[1]、胚胎形成[1]、碳同化[9]、衰老調(diào)控[9]、淀粉降解[10]、細胞分化[10]以及成花誘導[11-12]等過程。而TPS是海藻糖代謝過程中的一個關(guān)鍵酶，也有研究表明，TPS通過改變T6P的水平影響發(fā)育和代謝過程[1]，故TPS在植物生長發(fā)育和抗逆性中的作用備受關(guān)注。

TPS在高等植物響應(yīng)非生物脅迫中具有重要的調(diào)控作用。目前大多數(shù)高等植物基因組中都含有TPS基因家族[13]。過表達TPS或TPP基因的擬南芥[14]、煙草[5,15-16]、水稻[17-18]、馬鈴薯[5,19]和番茄[20]等轉(zhuǎn)基因植物通常都表現(xiàn)出對非生物脅迫的耐受性增強。將酵母TPS1基因 (ScTPS1)導入番茄(Solanumlycopersicum)，提高了番茄植株的葉綠素和淀粉含量，增強了對干旱、鹽和氧化脅迫的耐受性[20]。據(jù)報道，AtTPS1基因在煙草中的異體表達可以提高煙草對干旱、鹽和極端溫度等非生物脅迫的耐受性[21]。同樣，水稻TPS1(OsTPS1)基因的過表達提高了水稻幼苗對冷、高鹽和干旱處理的耐受性，但不引起顯著的表型變化[22]。在玉米(Zeamays)中，TPP過表達顯著增加了干旱和正常情況下的產(chǎn)量[23]。在擬南芥中，TPS1功能的喪失影響糖代謝和脫落酸(ABA)的生物合成，從而導致胚胎發(fā)育延遲，并擾亂營養(yǎng)生長[24-25]。這些研究都表明TPS基因?qū)Ψ巧锩{迫的響應(yīng)具有重要的作用，其在作物遺傳改良、改善品質(zhì)和提高產(chǎn)量中具有巨大潛力。

辣椒(CapsicumannuumL.)屬于茄科(Solanaceae)辣椒屬(Capsicum)，是一種重要的蔬菜作物，還作為香料作物、觀賞植物和增值加工產(chǎn)品在世界范圍內(nèi)廣泛種植，具有很高的經(jīng)濟價值和社會效益[26]。在自然界中，植物面臨著來自外界環(huán)境的諸多挑戰(zhàn)，而海藻糖代謝是植物提高抗逆性的重要途徑之一。甘肅農(nóng)業(yè)大學園藝學院分子育種課題組(以下稱本課題組)前期在辣椒全基因組中共鑒定出11個辣椒TPS基因，依次命名為CaTPS1～CaTPS11[27]。本研究克隆得到CaTPS8基因CDS序列，并利用生物信息學的方法對CaTPS8編碼蛋白序列及結(jié)構(gòu)進行分析，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹分析不同物種間CaTPS8蛋白的親緣關(guān)系。同時利用qRT-PCR分析CaTPS8基因的組織特異性表達，以及該基因在低溫、IAA、ABA、SA、GA3和MeJA等非生物脅迫下的表達模式。為后續(xù)深入研究CaTPS基因的功能奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 植物材料 供試材料為辣椒品種‘強豐101’，由甘肅農(nóng)業(yè)大學園藝學院分子育種實驗室保存。挑取籽粒飽滿的種子用紗布包好，先用 55 ℃熱水溫湯浸種20 min，再用20%的磷酸三鈉消毒20 min，28 ℃催芽72 h后播種于基質(zhì)穴盤中，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。光周期參數(shù)設(shè)置為16 h / 8 h(光照/黑暗)，溫度為28 ℃/23 ℃(白天/黑夜)，光照度為12 000 lx。取根、莖、葉、花、幼果果肉、商品果果肉、成熟果果肉、幼果胎座、商品果胎座和成熟果胎座用于組織特異性 表達。

1.1.2 試驗試劑 大腸桿菌(Escherichiacoli)感受態(tài)Trans1-T1細胞購自北京全式金(北京)生物公司，RNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒和熒光定量PCR試劑均購于天根生化科技有限公司(北京)，DNA凝膠回收試劑盒購于擎科生物技術(shù)有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser和克隆載體pMDTM18-T Vector Cloning Kit均購于寶生物工程(大連)有限公司，2×TaqPCR MasterMix購自中科瑞泰(北京)生物公司，IAA、GA3、MeJA和ABA購自北京酷來搏科技有限公司，SA購自于上海滬試公司。

1.2 方 法

1.2.1 材料處理 低溫處理：待穴盤種植的辣椒幼苗生長至6片真葉時進行低溫處理，處理時光照培養(yǎng)箱的參數(shù)設(shè)置為：16 h/8 h(白天/黑夜)，溫度23 ℃/18 ℃(白天/黑夜)，光照度為2 000 lx。分別于處理0 h、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h和72 h取植株第4至第6片真葉，置于液氮速凍后，于-80 ℃保存，備用。

1.2.2 激素處理 種子經(jīng)消毒催芽后利用無土栽培技術(shù)使其在hoagland營養(yǎng)液中生長，人工氣候箱中溫度設(shè)為28 ℃/23 ℃(白天/黑夜)，光周期16 h/8 h(白天/黑夜)，白天12 000 lx光照。當辣椒幼苗長到6片真葉時，進行非生物脅迫處理，向營養(yǎng)液中分別加入150 mg/L脫落酸(Abscisic acid, ABA)、200 mg/L赤霉素(Gibberellic acid, GA3)、300 mg/L水楊酸(Salicylic acid, SA)、0.02 mg/L茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate, MeJA)和30 mg/L吲哚乙酸(Indole acetic acid, IAA)5種激素，對照組僅用營養(yǎng)液模擬處理。分別于處理0 h、1h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h和72 h取植株第4至第6片真葉，液氮速凍后，置于 -80 ℃保存，備用。

1.2.3CaTPS8基因克隆 從本課題組鑒定得到的CaTPS基因家族成員信息中得到CaTPS8基因參考序列，設(shè)計CaTPS8基因的特異性上游引物和下游引物(表1)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。提取‘強豐101’葉片RNA，以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為擴增模板。25 μL PCR 反應(yīng)體系包括：2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，cDNA 1 μL 和上下游引物各1 μL。PCR擴增程序為：94 ℃預變性 5 min； 94 ℃變性 30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min 40 s， 35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min后4 ℃保存。所得擴增產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。采用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段，與pMD 18-T連接后轉(zhuǎn)化Trans1-T1感受態(tài)，將菌液涂布于含有100 mg/mL氨芐青霉素的LB固體平板上，置于37 ℃培養(yǎng)箱中倒置過夜培養(yǎng)，挑取單菌落進行PCR鑒定，選取陽性克隆搖菌后提取質(zhì)粒再次驗證，送至擎科生物技術(shù)有限公司(西安)進行測序。保存測序正確的菌液，完成克隆。

1.2.4CaTPS8生物信息學分析 利用ExPASy(https://web.expasy.org/protparam/)預測CaTPS8的理化性質(zhì)，蛋白跨膜結(jié)構(gòu)采用TMHMM Server v.2.0在線軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預測，在NCBI數(shù)據(jù)庫中預測CaTPS8編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，利用SignalP-5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進行蛋白信號肽預測，利用NetPhos 3.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)進行蛋白磷酸化位點預測，利用ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)進行蛋白親疏水性預測，蛋白二級結(jié)構(gòu)預測采用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/NPSA/npsa_sopma.html)，三級結(jié)構(gòu)預測采用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)。通過NCBI網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的Blastp對辣椒CaTPS8的氨基酸序列進行同源檢索，獲得其他物種的同源序列，并利用DNAMAN軟件對氨基酸序列進行多序列比對，然后采用鄰近法(Neighbor- joining method，NJ)在MEGA中構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap 設(shè)置為 1 000次重復。

1.2.5CaTPS8基因表達模式分析 提取辣椒不同組織以及不同處理葉片的總RNA，按照試劑盒的方法反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以辣椒Actin(GenBank Accession：GQ339766.1)為內(nèi)參基因，根據(jù)CaTPS8序列設(shè)計熒光定量PCR引物(表1)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。qRT-PCR反應(yīng)在StepOnePlus(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)中國公司產(chǎn)品)儀器上完成，反應(yīng)體系包括SYBR Green Master mix 10 μL，ddH2O 6 μL，上下游引物各 1 μL和cDNA 2 μL；擴增程序為： 95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。使用2-△△CT法計算CaTPS8基因的相對表達量。利用SPSS 22軟件對數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析(P<0.05)，使用Origin 2019作圖。

表1 CaTPS8基因引物信息及功能Table 1 Primer information and function of CaTPS8 gene

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒 CaTPS8基因的克隆

利用CaTPS8-F/CaTPS8-R(表1)對辣椒品種‘強豐101’的cDNA進行擴增，經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到一條2 500 bp左右特異性條帶(圖1)，與預期結(jié)果一致。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收純化后轉(zhuǎn)化，篩選陽性克隆送測序。經(jīng)測序產(chǎn)物長度為2 553 bp，編碼850個氨基酸(圖2)。

M.DNA標準物5 000；1～2. CaTPS8基因的cDNA PCR產(chǎn)物

圖2 CaTPS8全長核苷酸序列及預測氨基酸序列Fig.2 Full-length nucleotide sequence and predicted amino acid sequence of CaTPS8

2.2 CaTPS8的蛋白結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)進化關(guān)系分析

對CaTPS8的理化性質(zhì)分析表明，該蛋白的分子質(zhì)量為96 ku，理論等電點為 5.65，不穩(wěn)定系數(shù)為48.09，推測為不穩(wěn)定蛋白，脂肪系數(shù)為 87.69。通過保守結(jié)構(gòu)域分析，發(fā)現(xiàn)CaTPS8該蛋白含有Glyco_transf_20(位于59～543 aa)和GT20_TPS(位于59～542 aa)保守結(jié)構(gòu)域，以及非特異性保守結(jié)構(gòu)域PLN02205(位于1～843aa)，屬于TPS基因家族(圖3)。蛋白結(jié)構(gòu)預測顯示CaTPS8蛋白沒有蛋白跨膜結(jié)構(gòu)(圖4)和信號肽序列(圖5)。NetPhos 3.1分析表明CaTPS8蛋白具有50個絲氨酸、13個蘇氨酸、12個酪氨酸的磷酸化位點(圖6)，進一步預測發(fā)現(xiàn)CaTPS8蛋白屬于親水性蛋白(圖7)。二級結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)CaTPS8的二級結(jié)構(gòu)由42.47%的α-螺旋、 34.59%的無規(guī)則卷曲、17.88%的延伸片段和 5.06%的β-轉(zhuǎn)角構(gòu)成(圖8)。通過SWISS-MODEL同源建模預測CaTPS8蛋白的三級結(jié)構(gòu)，結(jié)果也顯示該蛋白以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主 (圖9)。

圖3 CaTPS8蛋白保守結(jié)構(gòu)域預測結(jié)果 Fig.3 Prediction of CaTPS8 protein conserved domain

圖4 CaTPS8蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預測Fig.4 Transmembrane structure prediction of CaTPS8 protein

圖5 CaTPS8蛋白信號肽預測Fig.5 Signal peptide prediction of CaTPS8 protein

圖6 CaTPS8蛋白磷酸化位點預測Fig.6 Phosphorylation site prediction of CaTPS8 protein

圖7 CaTPS8蛋白疏水性/親水性預測Fig.7 Hydrophobicity/hydrophilicity prediction of CaTPS8 protein

藍色. α-螺旋；紫色. 無規(guī)則卷曲；紅色. 延伸片段；綠色. β-轉(zhuǎn)角

圖9 CaTPS8蛋白的三級結(jié)構(gòu)預測Fig.9 Tertiary structure prediction of CaTPS8 protein

通過Blastp比對，從NCBI中下載其他物種的同源蛋白序列，包括馬鈴薯Solanumtuberosum(XP 006358103.1)、番茄Solanumlycopersicum(XP 004233035.1)、葡萄Vitisvinifera(XP 002268174.1)、木薯Manihotesculenta(XP 021596125.1)、甜瓜Cucumismelo(XP 008439718.1)、黃瓜Cucumissativus(XP 011658255.1)、大豆Glycinemax(XP 003540002.1)、擬南芥Arabidopsisthaliana(NP 001321475.1)、水稻OryzasativaIndica Group (AEB53178.1)、小麥Triticumaestivum(KAF7030703.1)、高粱Sorghumbicolor(XP 002440081.1)。同源序列比對結(jié)果顯示CaTPS8蛋白與番茄、馬鈴薯同源序列相似度最高，分別為87.78%和86.92%，與高粱相似度最低，為 64.76%。系統(tǒng)進化樹也顯示CaTPS8與番茄、馬鈴薯在同一分支上，并且Bootstrap值高達100(圖10)。推測CaTPS8基因的功能可能與馬鈴薯、番茄中的同源基因功能相似。

圖10 CaTPS8系統(tǒng)進化關(guān)系分析Fig.10 Phylogenetic relationship analysis of CaTPS8

2.3 CaTPS8基因的表達模式分析

2.3.1CaTPS8基因的組織表達特異性 實時熒光定量PCR分析結(jié)果表明(圖11)，CaTPS8基因在辣椒不同組織中表達存在顯著差異，其在花中的相對表達量最高，其次是葉和莖，在幼果胎座中表達量最低，且花中的表達量約為幼果胎座的40倍。除了幼果果肉，CaTPS8基因在辣椒其他發(fā)育時期的果肉和胎座中表達量都比較低。

YFF.幼果果肉；YFP.幼果胎座；BFF.商品果果肉；BFP.商品果胎座；RFF.成熟果果肉；RFP.成熟果胎座；R.根；S.莖；L.葉；F.花；不同小寫字母表示 CaTPS8基因表達量在辣椒不同組織間差異顯著(P<0.05)

2.3.2CaTPS8基因在不同非生物脅迫下的表達模式分析CaTPS8基因在經(jīng)過低溫處理后在辣椒葉片中的表達量顯著上調(diào)(圖12)，在處理3 h時表達量最高，約為對照的25倍。但其表達量在處理3 h之后又迅速下降，然后在處理12～72 h時保持較低的水平，且與對照基本一致。所以CaTPS8基因在低溫處理后表達量呈現(xiàn)顯著升高又迅速下降后保持穩(wěn)定的趨勢。

不同小寫字母表示 CaTPS8基因表達量在不同非生物脅迫下差異顯著(P<0.05)

在SA、IAA、ABA、GA3和MeJA 5種激素處理下CaTPS8基因的表達量均下調(diào)(圖12)。其中，在SA處理后1 h下調(diào)最明顯，約為對照的 1/10。隨著處理時間的推移，CaTPS8基因的表達量開始上升，在處理48 h時達到峰值，并超過對照的表達量。IAA、GA3處理下CaTPS8基因的表達量均呈先下降后上升再下降的趨勢，但在處理前期IAA中的下降更顯著，且IAA處理下在24 h達到峰值，而GA3處理下峰值出現(xiàn)在 1 h。CaTPS8基因的表達量在ABA處理下大致為先下調(diào)后上調(diào)的趨勢，在處理3 h達到最大值，且在處理后期表達量基本穩(wěn)定。在MeJA處理下CaTPS8基因的表達量大致呈逐步降低的趨勢。

3 討 論

植物的生長發(fā)育經(jīng)常受到各種不利環(huán)境的影響，包括干旱、鹽堿地、冷害和熱害等[28]。這些非生物脅迫是影響作物品質(zhì)和產(chǎn)量的重要因素。而海藻糖代謝途徑在調(diào)節(jié)蔗糖的利用和分配、協(xié)調(diào)源庫關(guān)系、碳水化合物的有效利用等方面具有重要作用[29-30]。海藻糖-6-磷酸合酶(TPS)對應(yīng)激反應(yīng)和海藻糖代謝至關(guān)重要。越來越多的研究表明，一些TPS/TPP基因家族成員與非生物脅迫響應(yīng)有關(guān)，并在改良作物品質(zhì)、提高作物產(chǎn)量以及抗逆性方面發(fā)揮重要作用[23,31]。水稻中的海藻糖可以在低水平NaCl處理下積累，外源添加海藻糖可以降低NaCl對水稻的生長抑制作用[32]。過表達AtTPS1顯著提高了擬南芥的抗旱性[33]，過表達OsTPS1能提高水稻對非生物脅迫的耐受性[22]，激活OsTPP1表達可以提高水稻的耐冷性[15]，這些研究證實了TPS成員在植物生長發(fā)育和逆境應(yīng)答中的功能特性。

本研究從辣椒中克隆出的CaTPS8基因長度為2 553 bp，共編碼850個氨基酸。通過NCBI比對，選取不同作物的同源序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，發(fā)現(xiàn)CaTPS8與馬鈴薯和番茄親緣關(guān)系最近，與高粱親緣關(guān)系相對較遠。這可能是由于辣椒、馬鈴薯和番茄都屬于雙子葉茄科植物，因此CaTPS8在這兩種植物中存在較高的同源保守性。從玉米中克隆出的cDNAs結(jié)果顯示，TPS-2和TPS-3含有Glyco_transf_20和 GT20_TPS兩個保守結(jié)構(gòu)域，TPP-1基因有一個Trehalose_PPase結(jié)構(gòu)域[34]。Wang等[35]研究發(fā)現(xiàn)，短柄草BdTPS和BdTPP基因也顯示了這種類型的結(jié)構(gòu)域，這與本研究結(jié)果一致，即使在不同物種中，這些蛋白也具有相同的催化位點，并且大多數(shù)保守結(jié)構(gòu)域參與酶-底物結(jié)合和海藻糖-6-磷酸合成[34]。

本研究對CaTPS8的組織特異性表達分析發(fā)現(xiàn)，該基因在花中相對表達量顯著高于其他組織，表明該基因可能調(diào)控辣椒花的發(fā)育過程。Paul等[8]發(fā)現(xiàn)，即使在其他誘導環(huán)境下，AtTPS1的缺失也會導致擬南芥開花延遲，這表明AtTPS1在花期的及時啟動中是必需的。此外，Satoh-Nagasawa等[36]提到海藻糖可能在一個特定的發(fā)育途徑中起信號作用，因為他們證明了一種功能性的TPP酶可以作用于RA1轉(zhuǎn)錄因子的上游，調(diào)控花序分枝。這些結(jié)果表明，TPS和TPP基因可能在調(diào)控植物從營養(yǎng)生長向生殖生長的轉(zhuǎn)變中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，CaTPS8的表達受到低溫脅迫的誘導，在處理前期顯著上調(diào)，這與甜瓜CmTPS7的表達一致[37]。辣椒CaTPS8最初的表達上調(diào)可能是促進T6P含量的增加，從而誘導脅迫信號轉(zhuǎn)導相關(guān)基因的表達。但在葡萄中，具有TPS活性的VvTPS1對低溫并不敏感[38]，這可能與物種間的差異性有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)，CaTPS8基因可以響應(yīng)IAA、ABA、SA、GA3和MeJA 5種激素的脅迫，其表達均受到不同程度的抑制，證實CaTPS8基因參與激素脅迫的應(yīng)答調(diào)控。同樣，非生物脅迫、激素和蔗糖處理導致黃瓜CsTPS6的表達大幅下降[39]，而玉米ZmTPS基因在鹽和低溫脅迫下誘導表達[40]。此外，OsTPP2基因的表達受到低溫、鹽脅迫、干旱脅迫以及ABA等多種脅迫因子的調(diào)節(jié)[41]。馬鈴薯StTPS基因的表達模式也受不同脅迫和激素的調(diào)控[42]。而擬南芥中AtTPS1基因的過表達導致轉(zhuǎn)基因植物對外源ABA不敏感，表明AtTPS1基因表達與ABA代謝之間存在相互作用[43]。同樣，在擬南芥種子萌發(fā)和氣孔關(guān)閉過程中，TPS5 作為ABA信號轉(zhuǎn)導的負調(diào)控因子，參與改變海藻糖含量和硝酸還原酶(Nitrate reductase，NR)活性[44]。