馬金秀，張錦鋒，王江來，李佳佳，李昭煜，劉 璐，田永強(qiáng)

(蘭州交通大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，蘭州 730070)

普城沙雷氏菌(Serratiaplymuthica)屬于腸桿菌科，G-，桿狀兼性厭氧菌。作為一種重要的生防菌劑，既通過產(chǎn)生胞外酶和代謝產(chǎn)物等抑制植物病原真菌，還能夠促進(jìn)植物生長[1]。沙雷氏菌能分泌多種抗生性代謝產(chǎn)物，如碳青霉烯、幾丁質(zhì)酶、異硫霉素、硝吡咯菌素、水解酶、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素、嗜鐵素等，從而抑制不同植物病原真菌的生長[2]。Saraswoti等[3]研究表明，普城沙雷氏菌通過分泌幾丁質(zhì)酶降解病原真菌細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)來抑制真菌。幾丁質(zhì)酶(Chitinase)是一種專一性催化幾丁質(zhì)中β-1，4糖苷鍵水解，能夠?qū)锥≠|(zhì)降解為幾丁寡糖或單糖的一類酶的總稱[4]。幾丁質(zhì)酶廣泛分布于自然界，存在于真菌、細(xì)菌及放線菌等微生物[5]?，F(xiàn)已陸續(xù)發(fā)現(xiàn)沙雷氏菌屬(Serratiasp.)、芽孢桿菌屬(Bacillussp.)、鏈霉菌屬(Streptomycessp.)、淡紫擬青霉(Paecilomyceslilacinus)均可分泌幾丁質(zhì)酶[6]。但目前因幾丁質(zhì)酶結(jié)構(gòu)的多樣性、調(diào)控機(jī)理的復(fù)雜性、以及菌株產(chǎn)酶能力低下、發(fā)酵工藝不成熟等原因，優(yōu)化菌株的最佳產(chǎn)酶條件是酶工藝生產(chǎn)中的首要 任務(wù)。

在發(fā)酵工藝生產(chǎn)優(yōu)化中，多采用Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)合Box-Behnken響應(yīng)面法(RSM)設(shè)計(jì)試驗(yàn)對菌株產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化，以期獲得高效高產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的發(fā)酵條件。袁淑博等[7]通過響應(yīng)面法優(yōu)化MEW06產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的培養(yǎng)基后酶活達(dá)197.32 U/mL，相比于初始培養(yǎng)基酶活提高 2.58倍。Pramesti等[8]采用響應(yīng)面法研究鏈霉菌PB2產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的最佳質(zhì)量濃度。Roohi等[9]采用RSM優(yōu)化高產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株CUVGA6的產(chǎn)酶條件，為工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用提供理論支持。Rachmawaty等[10]利用兩水平篩選因子首次對綠色木霉產(chǎn)幾丁質(zhì)酶條件進(jìn)行優(yōu)化，響應(yīng)面分析預(yù)測幾丁質(zhì)酶活為0.487 38 U/g，試驗(yàn)驗(yàn)證為 0.488 64 U/g，預(yù)測結(jié)果非常理想。大多數(shù)文獻(xiàn)是研究粘質(zhì)沙雷氏菌通過幾丁質(zhì)酶防治植物病原真菌[11]，關(guān)于普城沙雷氏菌通過幾丁質(zhì)酶防治植物病原菌及產(chǎn)酶條件的優(yōu)化方面未見文獻(xiàn)報(bào)道。

本研究基于對蘭州交通大學(xué)生物農(nóng)藥工程中心微生物實(shí)驗(yàn)室篩選的生防菌株普城沙雷氏菌MM在開展單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Plackett-Burman設(shè)計(jì)和RSM對幾丁質(zhì)酶的最佳培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，明確菌株MM對西瓜枯萎病的防治效果，為普城沙雷氏菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝提供理論依據(jù)，也為該菌株進(jìn)一步開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌種 蘭州交通大學(xué)生物農(nóng)藥工程中心分離篩選的普城沙雷氏菌菌株MM，ACCC編號為61749。

1.1.2 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基。LB培養(yǎng)基：酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉10 g/L，瓊脂 15～20 g/L，pH 7.0；PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L，pH 7.0；MS培養(yǎng)基(購自杭州百思生物)：硝酸鉀1 900 mg/L，硝酸銨 1 650 mg/L，磷酸二氫鉀170 mg/L，硫酸鎂370 mg/L，氯化鈣440 mg/L，碘化鉀0.83 mg/L，硼酸6.2 mg/L，硫酸錳22.3 mg/L，硫酸鋅8.6 mg/L，鉬酸鈉0.25 mg/L，硫酸銅0.025 mg/L，氯化鈷0.025 mg/L，乙二胺四乙酸二鈉37.3 mg/L，硫酸亞鐵27.8 mg/L，肌醇1 000 mg/L，甘氨酸2 mg/L，鹽酸硫胺素0.1 mg/L，鹽酸吡哆醇0.5 mg/L，煙酸0.5 mg/L，蔗糖10 g/L，瓊脂7 g/L，取MS培養(yǎng)基4.74 g，加入1 L蒸餾水，攪拌加熱至完全溶解，pH 5.8。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基。酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉 10 g/L，pH 7.0。

培養(yǎng)基滅菌條件均為高壓滅菌，121 ℃，30 min。

1.2 方 法

1.2.1 種子培養(yǎng) 將菌株MM轉(zhuǎn)接至LB斜面培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)16 h，活化后再挑取一環(huán)斜面培養(yǎng)基上的菌株接種于100 mL LB液體培養(yǎng)基，30 ℃、180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)過夜，制成種子液。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng) 將菌株MM種子液以3% 的接種量接種至裝有100 mL 基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中，30 ℃、180 r/min 培養(yǎng)72 h。

1.2.3 酶活力測定 幾丁質(zhì)酶活性測定[12-14]：采用3,5-二硝基水楊酸(DNS)法測定。根據(jù)N-乙酰氨基葡萄糖(NAG)標(biāo)準(zhǔn)曲線[15]定量幾丁質(zhì)酶活(圖1)。幾丁質(zhì)酶活的定義：一個(gè)單位的幾丁質(zhì)酶活(U)定義為37 ℃下每1 min產(chǎn)生1 μmol NAG所需要幾丁質(zhì)酶的酶量[16]。

圖1 幾丁質(zhì)酶標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of chitinase

1.2.4 菌體生物量測定 利用混菌法測定菌體生物量(活菌數(shù))。取菌懸液適當(dāng)稀釋后將菌液與溫度冷卻至50 ℃左右的培養(yǎng)基混勻倒平板，24 h后平板計(jì)數(shù)。

1.2.5 抑菌活性測定 以西瓜枯萎病菌為靶標(biāo)菌，活化培養(yǎng)后，用打孔器打取直徑為8 mm的菌碟，置于PDA瓊脂培養(yǎng)基中央，再用無菌牙簽將培養(yǎng)24 h的普城沙雷氏菌MM用十字交叉法點(diǎn)接于該菌碟四周等距離25 mm 處，以不接種菌株MM的平皿為對照，每個(gè)試驗(yàn)3個(gè)重復(fù)，27 ℃培養(yǎng)5 d后測量菌落直徑，并通過以下公式計(jì)算抑菌率。

抑菌率=(對照組菌落直徑-處理組菌落直徑)/ 對照組菌落直徑×100%

1.2.6 菌株MM對西瓜種子的影響 將待測西瓜種子用無菌水沖洗3次，每次5 min，再分別在70%乙醇溶液和2%次氯酸鈉溶液中清洗3 min與10 min，再用無菌水沖洗3次后，置于無菌紗布中風(fēng)干。將濾液分別稀釋至10、50、100、150、200倍的梯度加入MS培養(yǎng)基中，以不加菌株MM濾液的 MS培養(yǎng)基為對照，將已消毒的種子置于MS培養(yǎng)基中，每瓶5粒，各3個(gè)重復(fù)， 25 ℃，空氣相對濕度要求80%左右，光照與黑暗交替培養(yǎng)7 d后，測定種子生長情況。

1.2.7 菌株MM對西瓜枯萎病的盆栽防治效果及葉綠素含量 采用灌根法將長勢均勻的西瓜幼苗移栽至盆中，試驗(yàn)設(shè)計(jì)4個(gè)處理，每個(gè)處理5盆，分別以接種無菌發(fā)酵培養(yǎng)基為對照組CK；接種西瓜枯萎病菌孢子懸液(107mL-1)的記為FON；先接種西瓜枯萎病菌孢子懸液，24 h后再接種菌株MM發(fā)酵濾液的記為FON+MM；只接種菌株MM發(fā)酵濾液的記為MM；以7 d為周期，每株每次接種20 mL，42 d后統(tǒng)計(jì)各處理植株生長情況，調(diào)查枯萎病的病株率及病級，計(jì)算菌株MM的防治效果并測定各處理葉綠素含量。西瓜幼苗期枯萎病分級標(biāo)準(zhǔn)[17]：0級為莖內(nèi)維管束正常，外部無癥狀；1級為莖內(nèi)維管束25%以下變色；3級為莖內(nèi)維管束25%～50%變色；5級為莖內(nèi)維管束51%～75%變色；7級為莖內(nèi)維管束75%以上變色，部分葉片萎蔫；9級為整株枯死。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 不同碳、氮源、無機(jī)鹽對MM產(chǎn)幾丁質(zhì)酶活及活菌數(shù)的評價(jià) 將MM菌株接種至基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，以培養(yǎng)基初始pH 7.0、接種量3%、培養(yǎng)溫度30 ℃、轉(zhuǎn)速180 r/min及培養(yǎng)時(shí)間72 h為初始條件。以幾丁質(zhì)酶活及菌株MM活菌數(shù)為指標(biāo)，對菌株MM培養(yǎng)基碳源(5 g/L)、氮源(10 g/L)、無機(jī)鹽(10 g/L)進(jìn)行優(yōu)化，每次將優(yōu)化后的結(jié)果用于下一因素的優(yōu)化中。碳源：乳糖、麥芽糖、蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉；氮源：硝酸銨、碳酸銨、硫酸銨、尿素、牛肉膏、蛋白胨；無機(jī)鹽：氯化鈣、硫酸錳、七水合硫酸鎂、磷酸二氫鉀、氯化鈉。

1.3.2 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選重要影響因素 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取7種成分(麥芽糖、葡萄糖、牛肉膏、酵母粉、蛋白胨、氯化鈉、硫酸錳)作為7個(gè)因子，即X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7，選用試驗(yàn)次數(shù)為N=12的試驗(yàn)方法進(jìn)行PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對每個(gè)因子分別選取高水平(+1)和低水平(-1)，且高水平是低水平的1.5倍。試驗(yàn)因子和水平見表1，以幾丁質(zhì)酶活作為響應(yīng)值R1。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)因子及水平Table 1 Plackett-Burman test factors and levels

1.3.3 最陡爬坡路徑試驗(yàn) 利用Minitab 19統(tǒng)計(jì)分析軟件對Plackett-Burman設(shè)計(jì)分析，根據(jù)PB試驗(yàn)結(jié)果選取3個(gè)影響最大因子進(jìn)行最陡爬坡路徑試驗(yàn)，如表2所示。

表2 3個(gè)影響最大因子最陡爬坡路徑試驗(yàn)條件Table 2 Test conditions for steepest climbing path of three most influential factors

1.3.4 響應(yīng)面Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化 通過Plackett-Burman設(shè)計(jì)獲得的3個(gè)重要影響因子并從最陡爬坡路徑試驗(yàn)的結(jié)果選取3個(gè)水平，設(shè)計(jì)3因子3水平的Box-Behnken試驗(yàn)，各因子及水平如表3所示。

表3 Box-Behnken試驗(yàn)條件Table 3 Box-Behnken test conditions

1.3.5 數(shù)據(jù)處理 每個(gè)處理設(shè)計(jì)3組重復(fù)試驗(yàn)，取3個(gè)重復(fù)試驗(yàn)均值。利用origin 8.5和SPSS 26.0對單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；以Minitab 19進(jìn)行Plackett-Burman試驗(yàn)和RSM數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳源、氮源、無機(jī)鹽對菌株MM產(chǎn)幾丁質(zhì)酶及活菌數(shù)的影響

碳源、氮源和無機(jī)鹽對菌株MM產(chǎn)幾丁質(zhì)酶酶活性和活菌數(shù)的影響結(jié)果如圖2所示。以葡萄糖為碳源(圖2-Ⅰ)時(shí)對酶活性和活菌數(shù)的影響最顯著，分別為0.417 U/mL、2.2×1012CFU/mL，其次為麥芽糖、可溶性淀粉、乳糖、蔗糖及酵母粉(LB)；在碳源的優(yōu)化基礎(chǔ)上，6種氮源(圖2-Ⅱ)對酶活性和活菌數(shù)影響依次為牛肉 膏>蛋白胨>硝酸銨>尿素>硫酸銨>碳酸銨，牛肉膏為氮源時(shí)影響最顯著，酶活性和活菌數(shù)分別為0.421 U/mL， 9.7×1012CFU/mL；在氮源的優(yōu)化基礎(chǔ)上，以氯化鈉為無機(jī)鹽(圖2-Ⅲ)時(shí)影響最顯著，酶活性和活菌數(shù)分別為0.425 U/mL，6.36×1013CFU/mL。因此，選擇最優(yōu)碳氮源、無機(jī)鹽分別為葡萄糖、牛肉膏和氯化鈉。

Ⅰ.碳源；Ⅱ.氮源；Ⅲ.無機(jī)鹽；A.乳糖；B.麥芽糖；C.蔗糖；D.葡萄糖；E.可溶性淀粉；F.LB；G.硝酸銨；H.碳酸銨；I.硫酸銨；J.尿素；K.牛肉膏；L.蛋白胨；M.氯化鈣；N.硫酸錳；O.七水合硫酸鎂；P.磷酸二氫鉀；Q.氯化鈉。不同字母表示各處理在P<0.05水平差異顯著。下同

2.2 Plackett-Bueman試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以培養(yǎng)基的7種成分(麥芽糖、葡萄糖、牛肉膏、酵母粉、蛋白胨、氯化鈉、硫酸錳)進(jìn)行7因子兩水平的Plackett-Bueman試驗(yàn)，篩選對菌株MM培養(yǎng)條件影響最顯著的3個(gè)因素。Plackett-Bueman試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果如表4所示，酶活性最高響應(yīng)值達(dá)0.399。采用Minitab 19進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見表5，t檢驗(yàn)顯示對響應(yīng)結(jié)果產(chǎn)生正效應(yīng)的因子為X6和X7，說明X6和X7在高水平時(shí)有利于菌株MM產(chǎn)酶，其質(zhì)量濃度分別選擇15 g/L和7.5 g/L；產(chǎn)生負(fù)效應(yīng)的因素為X1、X2、X3、X4和X5，說明這5個(gè)因素在低水平時(shí)更有利于菌株MM的產(chǎn)酶，其質(zhì)量濃度分別選擇10 g/L、15 g/L、3 g/L、5 g/L和10 g/L。這7個(gè)因子對響應(yīng)值影響的顯著順序?yàn)閄2>X3>X4>X1>X6>X7>X5。根據(jù)P值可得，X1、X2、X3、X4具有高度顯著效應(yīng)(P<0.05)。因此后續(xù)選取X2、X3、X4作為響應(yīng)面試驗(yàn)的研究對象。

表4 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值Table 4 Plackett-Burman experimental design and response values

表5 Plackett-Burman試驗(yàn)各因素的影響效果Table 5 Effects of various factors in Plackett-Burman test

2.3 最陡爬坡路徑試驗(yàn)

利用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選出影響產(chǎn)酶的3個(gè)主要因素:X2、X3、X4，運(yùn)用最陡爬坡路徑法逼近最大響應(yīng)值區(qū)域(表6)，菌株MM酶活性隨著X2、X3、X4的添加量減少而增大。結(jié)果顯示，第3組試驗(yàn)響應(yīng)值最大，即X2為13 g/L，X3為2 g/L，X4為3 g/L時(shí)酶活最高，因此，選擇第3組試驗(yàn)條件為響應(yīng)面Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)。由預(yù)測模型得X2、X3和X4的變化梯度是逐步遞減的，即X2在13 g/L，X3在2 g/L，X4在3 g/L的基礎(chǔ)上繼續(xù)遞減，其余因子的質(zhì)量濃度水平均按上述濃度尋找最大響應(yīng)區(qū)域。

表6 3個(gè)影響最大因子最陡爬坡路徑試驗(yàn)條件Table 6 Test conditions for steepest climbing path of three most influential factors

2.4 響應(yīng)面Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)Plackett-Burman設(shè)計(jì)獲得的3個(gè)重要影響因子即X2、X3和X4，最陡爬坡路徑試驗(yàn)得到的質(zhì)量濃度即X2為13 g/L，X3為2 g/L，X4為3 g/L。以酶活為響應(yīng)值R3，設(shè)計(jì)3因子3水平的Box-Behnken試驗(yàn)，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)結(jié)果如表7所示。

2.4.1 二次回歸模型與方差分析 利用Minitab 19進(jìn)行方差分析(表8)，該模型失擬項(xiàng)P= 0.379>0.05，說明回歸效果顯著，失擬不顯著，模型穩(wěn)定，能很好的進(jìn)行預(yù)測。決定系數(shù)R2= 0.993 7，說明該模型達(dá)到了較好的擬合度。經(jīng)Minitab 19分析回歸擬合得到該模型的回歸方程：R3=-6.688 + 0.882 7X2+ 0.564X3+ 0.620 9X4- 0.033 19X2X2-0.183 3X3X3- 0.073 11X4X4-0.009 00X2X3-0.017 69X2X4+0.027 74X3X4。

2.4.2 響應(yīng)面分析 根據(jù)擬合回歸方程，為更直觀地反映3個(gè)影響因素X2、X3和X4之間交互作用對菌株MM產(chǎn)酶活性的影響，通過二階優(yōu)化，繪出X2、X3和X4之間的響應(yīng)面分析圖(圖3、4、5)，每個(gè)響應(yīng)面可反映出兩個(gè)主要因素之間的相互作用，隨著另外兩個(gè)因素的逐漸變化，響應(yīng)值呈先增大后減小的趨勢，而曲面的頂點(diǎn)即為響應(yīng)值的最大值點(diǎn)。根據(jù)二階回歸方程計(jì)算可得X2、X3和X4的最佳質(zhì)量濃度組合X2為 12.748 g/L，X3為2.086 g/L，X4為3.091 g/L，MM酶活理論值達(dá)0.492 U/mL。為驗(yàn)證理論值的正確性，采用此優(yōu)化組合測得MM酶活性為 0.485 U/mL，與理論值相對誤差為1.27%。優(yōu)化后培養(yǎng)條件下，幾丁質(zhì)酶活比優(yōu)化前提高1.14倍左右，表明Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化MM產(chǎn)酶培養(yǎng)條件是可行的。

圖3 X2和X3交互作用對酶活性影響的響應(yīng)面Fig.3 Response surface of interaction of X2 and X3 on enzyme activity

圖4 X2和X4交互作用對酶活性影響的響應(yīng)面Fig.4 Response surface of interaction of X2 and X4 on enzyme activity

圖5 X3和X4交互作用對酶活性影響的響應(yīng)面Fig.5 Response surface of interaction of X3 and X4 on enzyme activity

表7 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果Table 7 Box-Behnken test design results

表8 方差分析模型Table 8 Analysis of variance model

2.4.3 試驗(yàn)驗(yàn)證 根據(jù)優(yōu)化前后，進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證，優(yōu)化之前菌落直徑為34.2 mm，優(yōu)化后菌落直徑為31.3 mm，抑菌率提高6.42%。此外，優(yōu)化后還觀察到菌落色素分泌減少，邊緣菌絲生長明顯較為稀疏(圖6)。

A.優(yōu)化前；B.優(yōu)化后

2.4.4 菌株MM對西瓜種子萌發(fā)的影響 菌株MM發(fā)酵濾液稀釋倍數(shù)為100、150、200倍時(shí)，對西瓜種子的萌發(fā)有顯著的促進(jìn)作用，發(fā)芽率分別為95.90%、98.53%、96.13%。在150倍時(shí)發(fā)芽率、株高、根長、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量較對照差異最顯著，且分別較對照增加11.33%、63.38%、 35.55%、87.80%、125.00%，表明菌株MM發(fā)酵濾液稀釋150倍時(shí)對西瓜種子的萌發(fā)促進(jìn)作用最強(qiáng)(表9)。

表9 菌株MM對西瓜種子萌發(fā)的影響Table 9 Effect of strain MM on watermelon seeds germination

2.4.5 菌株MM對西瓜枯萎病的盆栽防治效果 西瓜植株經(jīng)FON、FON+MM、MM處理后，與CK相比，西瓜植株的生長情況發(fā)生了較大變化。如表10和圖7所示，經(jīng)MM處理后較CK差異最顯著，株高、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量分別增加78.82%、126.90%、82.00%，植株長勢最好，表明菌株MM能很大程度促進(jìn)植株生長；經(jīng)FON處理后，植株病情指數(shù)達(dá)93.00，植株的生長顯著地受到抑制；經(jīng)FON+MM處理后較FON處理的植株株高、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量分別增加56.06%、 40.16%、47.62%，病情指數(shù)為23.67，防效達(dá) 74.55%，表明菌株MM對西瓜枯萎病有較好的防治作用。

表10 西瓜植株生物量及菌株MM對枯萎病的防效Table 10 Watermelon plants biomass and control effect

A.CK；B.FON；C.FON+MM；D.MM

2.4.6 菌株MM對西瓜植株葉綠素含量的影響 與對照CK相比，F(xiàn)ON處理的西瓜植株葉綠素a、葉綠素b和葉綠素總含量均降低，F(xiàn)ON處理后再經(jīng)MM處理能增強(qiáng)葉綠素a、葉綠素b和葉綠素總含量，MM處理后，西瓜植株葉綠素a、葉綠素b和葉綠素總含量分別達(dá)到23.543、19.255和 42.807 mg/g，分別較對照組提高1.15、1.73和1.36倍。表明菌株MM能夠較好地抑制FON對西瓜植株葉綠素的影響(圖8)。

圖8 菌株MM處理后西瓜植株葉綠素含量Fig.8 Chlorophyll content of watermelon plant under strain MM treatment

3 討 論

20世紀(jì)80年代，已經(jīng)有沙雷氏菌(Serratiaspp.)防治植物病害研究的報(bào)道。沙雷氏菌抗植物真菌作用機(jī)理在于分泌抗菌次生代謝物質(zhì)硝吡咯菌素[18]、幾丁質(zhì)酶[19]、揮發(fā)性化合物[20]等。許多研究通過優(yōu)化生防菌株的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件提高次生代謝物產(chǎn)量，從而有效提高菌株的生防效果[21]。Patidar等[22]認(rèn)為，通過提高幾丁質(zhì)酶活可提高白僵菌的抗真菌殺蟲活性?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果，本研究開展菌株MM的產(chǎn)幾丁質(zhì)酶條件優(yōu)化及菌株MM對西瓜枯萎病的防治效果評價(jià)。

培養(yǎng)條件優(yōu)化在工業(yè)生產(chǎn)中是重要的基礎(chǔ)條件，培養(yǎng)基組分又是影響微生物發(fā)酵的重要因素之一[23]。袁淑博等[7]在對沙雷氏菌MEW06產(chǎn)酶條件優(yōu)化中，篩選出的最佳碳源和氮源分別為可溶性淀粉和蛋白胨，使幾丁質(zhì)酶活較優(yōu)化前提高2.58倍。沙雷氏菌培養(yǎng)條件要求較低，培養(yǎng)基組分簡單，對碳、氮源、無機(jī)鹽等利用比較廣泛，單糖、雙糖、多糖、醇類均可利用，但利用效果有所不同[24]。本研究通過響應(yīng)面法優(yōu)化篩選出葡萄糖12.748 g/L、牛肉膏2.086 g/L可作為普城沙雷氏菌MM產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的最優(yōu)碳氮源。這與于平等[25]的報(bào)道相一致。

幾丁質(zhì)酶因具有廣譜抗細(xì)菌和真菌特性，主要應(yīng)用于醫(yī)療、制藥和食品防腐領(lǐng)域，近年來在廢水處理和生物肥料行業(yè)也廣泛應(yīng)用[26]。Patidar等[22]優(yōu)化了白僵菌RD-101產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的發(fā)酵條件，為工業(yè)化生產(chǎn)幾丁質(zhì)酶提供潛在候選菌株。RSM在生物學(xué)中的應(yīng)用相當(dāng)廣泛，主要用于研究反應(yīng)混合物中各成分所占比例與其生物學(xué)活性之間的關(guān)系[27]。王曉輝等[28]為提高假交替單胞菌產(chǎn)幾丁質(zhì)酶活，采用RSM優(yōu)化產(chǎn)幾丁質(zhì)酶培養(yǎng)基，酶活提高23.77%。趙祥杰等[29]利用單因素和RSM對單胞菌G-254產(chǎn)幾丁質(zhì)酶發(fā)酵條件優(yōu)化后，酶活達(dá)6.86 U/mL，提高了抗菌活性。本研究對菌株MM優(yōu)化后產(chǎn)幾丁質(zhì)酶活達(dá)0.485 U/mL，幾丁質(zhì)酶活性提高1.14倍，抑菌率提高6.42%。大量研究證實(shí)生防菌具有防病和促進(jìn)作物生長雙重功能，普城沙雷氏菌也具有防病和促生長作用。申順善等[30]研究表明，普城沙雷氏菌A21-4使葉綠素含量和根活力分別提高86.1%、481.8%，在辣椒成株期顯著提高了株高、莖粗等生育指標(biāo)。楊淑君等[31]研究表明，普城沙雷氏菌Z10對馬鈴薯晚疫病和當(dāng)歸麻口病有很好的防治效果，使作物分別增產(chǎn)16.63%、14.35%。本研究表明，菌株MM能促進(jìn)種子萌發(fā)，提高植株株高、鮮質(zhì)量和干質(zhì)量，并且對西瓜枯萎病有較理想的防治效果，防效高達(dá)74.55%。因此，有必要對普城沙雷氏菌MM的其他生物防治機(jī)理開展深入探究，為普城沙雷氏菌MM在農(nóng)作物生物防治上的更廣泛應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。