張藝帆，王 慧，霍雯雯，李 陽(yáng)，劉 洋，曹福祥，李炎林，于曉英，許 璐

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128；2.湖南省中亞熱帶優(yōu)質(zhì)花木繁育與利用工程技術(shù)中心，長(zhǎng)沙 410128)

紅花檵木(Loropetalumchinensevar.rubrum)又稱紅檵木、紅桎木，為檵木變種。紅花檵木因其葉紅花艷，適應(yīng)性強(qiáng)，耐修剪，易造型，而廣受歡迎，在長(zhǎng)江流域及以南地區(qū)作為主要的色葉植物大量應(yīng)用于公園、道路、工廠、校園、社區(qū)等綠化中。近年來(lái)在生產(chǎn)苗圃和各類園林綠地應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)紅花檵木的葉片存在一種異常的“季節(jié)性花葉”現(xiàn)象，即在夏秋季節(jié)紅花檵木葉片呈現(xiàn)“花葉”狀，冬春季節(jié)“花葉”癥狀減弱或消失，而且這種現(xiàn)象越來(lái)越普遍。已有研究人員發(fā)現(xiàn)該種“花葉”癥狀，認(rèn)為是植物病毒導(dǎo)致，提出了防治對(duì)策，但并未通過(guò)試驗(yàn)明確病原種類和致病機(jī)制，該現(xiàn)象發(fā)生的原因、機(jī)制，以及對(duì)植株生長(zhǎng)發(fā)育的具體影響尚未明晰[1]。相關(guān)研究表明植物葉片的呈色與其色素的種類、含量、比例密切相關(guān)，而色素不僅影響植物呈色，還影響植物的光合生產(chǎn)力，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育和生態(tài)適應(yīng)性有重要影響，是評(píng)價(jià)植物生長(zhǎng)狀況的重要指標(biāo)[2]。毛行簡(jiǎn)等[3]在對(duì)花葉假連翹光合特性的研究中發(fā)現(xiàn)，其3種葉色表型葉片光合特性存在的顯著差異與葉綠體層間分布不均有直接關(guān)系，同時(shí)發(fā)現(xiàn)花葉假連翹花葉利用強(qiáng)光的能力較強(qiáng)，在強(qiáng)光環(huán)境下其性狀可保持穩(wěn)定。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)紅花檵木花葉研究極少，僅有對(duì)其花葉病毒病害癥狀的描述研究，國(guó)內(nèi)圍繞紅花檵木的研究主要集中在正常紅花檵木的栽培管理、生理特性、化學(xué)成分等方面[4]。為了解紅花檵木“季節(jié)性花葉”具體的表型、機(jī)制及對(duì)植株生長(zhǎng)的影響，本研究在實(shí)地勘測(cè)、調(diào)查、取樣的基礎(chǔ)上，結(jié)合表觀特征、發(fā)生規(guī)律、色素含量、光合特性等對(duì)這種“季節(jié)性花葉”進(jìn)行表型分類及其光合能力及適應(yīng)性的分析，以期為紅花檵木的科學(xué)應(yīng)用與養(yǎng)護(hù)及對(duì)葉片呈色機(jī)理更深入地研究與人為干預(yù)調(diào)控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

光合特性分析試驗(yàn)材料為湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林花卉教學(xué)基地紅花檵木(‘大葉紅’)13 a～15 a地栽成年植株(土壤、水肥管理及修剪等栽培養(yǎng)護(hù)措施一致)。

1.2 方 法

1.2.1 花葉調(diào)查 于2019年5月至2021年8月在長(zhǎng)沙市及周邊地區(qū)有紅花檵木應(yīng)用或生產(chǎn)的園林綠地和苗圃隨機(jī)抽取1 m×2 m的樣方(共計(jì)292個(gè))統(tǒng)計(jì)紅花檵木季節(jié)性花葉發(fā)生情況， 季節(jié)性花葉發(fā)生比率=出現(xiàn)花葉的總面積/調(diào)查樣方總面積×100%。

表型分類：將花葉與正常葉相比，綜合葉片的大小和顏色進(jìn)行表型分類。

1.2.2 葉片橫切解剖結(jié)構(gòu)觀察 于2021年7月下旬至8月上旬，選取植物材料葉片5～6片，塑封袋裝好帶回實(shí)驗(yàn)室，在干凈的載玻片在中間滴加蒸餾水，利用切好的土豆為手持物，將葉片夾在其土豆中間用刀片切取薄片蓋上蓋玻片后在光學(xué)顯微鏡下觀察，并保存拍照。

1.2.3 光合色素的提取及其含量的測(cè)定 于2021年7月下旬至8月上旬，按照于相麗等[5]采用的方法，每種花葉表型類型選取3片同一水平的成年葉片為樣品，將采集的各類型的樣葉用去離子水流水沖洗后拭干其表面，去葉梗及主葉脈，剪碎，用電子天平秤取0.2 g樣品置于10 mL離心管中，加入95%的乙醇作為提取液，定容至10 mL，封口并避光浸泡提取24 h后，再充分混勻溶液，待碎葉片下沉后立即移取上清液置于光徑為1.0 cm的比色皿中，以紫外分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度，記錄提取液在663、645和470 nm處的吸光度，用于計(jì)算葉綠素a(Chl a)、葉綠素b(Chl b)、類胡蘿卜素(Car)及總?cè)~綠素[Chl(a+b)]含量，計(jì)算公式如下：

Chl a=12.7×A663-2.69×A645×V/1 000W

Chl b=22.9×A645-4.68×A663×V/1 000W

Chl(a+b) =(20.0×A645+8.02×A663)×V/1 000W

Car=(1 000×A470-3.27×Chl a-104×Chl b)/229×V/1 000W

式中：A663、A645與A470分別表示波長(zhǎng)在663、645和470 nm處的吸光度；Chl a、Chl b、Chl(a+b)分別表示葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素的含量(mg·g-1)，Car表示類胡蘿卜素的含量(mg·g-1)；V為提取溶液的體積，W為葉片樣品的質(zhì)量。

1.2.4 花色素苷含量的測(cè)定 花色素苷的提取方法參照黃欣等[6]，于2021年7月下旬至8月上旬，稱取紅花檵木葉片1.0 g，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，剪碎后分別置于40 mL離心管中；加入10 mL的1%鹽酸乙醇提取液，32 ℃恒溫箱中提取 4 h，離心(12 000 r·min-1離心10 min)取上清液，待測(cè)，用日立U-2900型分光光度計(jì)測(cè)定525 nm處吸光度值，用相應(yīng)的提取液作對(duì)照，花色素苷相對(duì)含量計(jì)算，以每克鮮質(zhì)量在10 mL提取液中 0.1 OD525為1個(gè)色素單位，則：A=吸光度×10(色素單位)。

1.2.5 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定 葉綠素?zé)晒獾臏y(cè)定使用FluorPen FP 110 手持式葉綠素?zé)晒鈨x，于2021年7月下旬至8月上旬，各類型的樣葉各選取3片同一水平的葉片，葉片表面擦凈后用葉片夾將其夾住，暗適應(yīng)15 min后，測(cè)定初始熒光(F0)、最大熒光(Fm)、PSⅡ有效光化學(xué)量子效率(Fv/Fm)、PSⅡ潛在光化學(xué)活性(Fv/F0)等葉綠素?zé)晒鈪?shù)，然后用葉片夾夾住20 min后測(cè)光化學(xué)淬滅系數(shù)(qP)[7-8]。

1.2.6 光響應(yīng)曲線的測(cè)定 采用LI-6400XT便攜式光合儀進(jìn)行光響應(yīng)曲線測(cè)定，測(cè)定時(shí)間為2021年7月下旬至8月上旬，根據(jù)劉潔等[9]測(cè)定方法，在8:00-11:30 時(shí)，樣葉各選取 3 片同一水平的葉片，測(cè)定時(shí)大氣溫度為 20 ℃～25 ℃，以大氣作為CO2源，制作空氣緩沖瓶以保持CO2濃度的相對(duì)穩(wěn)定，流速為500 μmol·s-1，在0～ 1 800 μmol·m-2·s-1的光照強(qiáng)度范圍內(nèi)設(shè)定15個(gè)梯度，分別為2 000、 1 800、1 600、1 400、 1 200、1 000、800、600、400、200、100、80、50、20、 0 μmol·m-2·s-1，每片葉讀取5～10個(gè)瞬時(shí)凈光合速率(Pn)，參照葉子飄[10]的方法來(lái)擬合其光響應(yīng)曲線，計(jì)算表觀量子效率(AQE)、最大凈光合速率(Pnmax)、光飽和點(diǎn)(Lsp)、光補(bǔ)償點(diǎn)(Lcp)以及暗呼吸速率(Rd)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理、Origin 2018作圖、SPSS 19軟件進(jìn)行顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅花檵木季節(jié)性花葉表型分析

2019年5月至2021年8月在長(zhǎng)沙市及周邊地區(qū)的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，在園林綠地和苗圃中主栽的紅花檵木‘大葉紅’‘大葉玫紅’‘密枝玫紅’‘長(zhǎng)葉玫紅’等品種都有“季節(jié)性花葉”現(xiàn)象，且品種間表型差異不明顯。一般自春季5月初開始首先在植株新枝上呈現(xiàn)花葉，然后逐步擴(kuò)展到老葉、老枝， 7-10月花葉現(xiàn)象最突出，花葉的顏色最鮮艷，冬春季節(jié)“花葉”癥狀減弱或消失。這種“花葉”的主要表型特征是葉色為深淺不同綠黃、紅黃相間花葉或完全黃化、白化，或葉色為葉片中有深淺不同紅色斑點(diǎn)或斑塊；葉片正反兩面無(wú)明顯病癥，無(wú)蟲體及昆蟲排泄物和危害痕跡。

綜合所有調(diào)查的292個(gè)樣方中花葉表型，根據(jù)葉片顏色和大小將紅花檵木這種異常花葉類型分為以下5類典型表型(圖1)：

葉片變小的花葉(A)：葉片縮小到正常葉片大小的1/6以上，最小的葉片大小不足0.04 cm2，葉色為深淺不同綠黃、紅黃相間花葉或完全苗化、黃/白化表型，不同植株間的代表性表型見圖1-A1～A3。

綠黃相間花葉(B)：葉片大小沒有明顯改變，葉色為深淺不同綠黃相間花葉，不同植株間的代表性表型見圖1-B1～B3；紅黃相間花葉(C)：葉片大小沒有明顯改變，葉色為深淺不同紅黃相間花葉，不同植株間的代表性表型見圖1-C1～C3；黃化或白化葉(D)：葉片大小沒有明顯改變，葉片葉肉部分完全黃化或白化，不同植株間的代表性表型見圖1-D1～D3；紅色斑點(diǎn)(塊)花葉(E)：葉片大小沒有明顯改變，葉片中有深淺不同紅色斑塊或斑點(diǎn)，不同植株間的代表性表型見圖1-E1～E3。

A1～A3.葉片變小的花葉；B1～B3. 綠黃相間花葉；C1～C3.紅黃相間花葉；D1～D3.黃化或白化葉；E1～E3.紅色斑點(diǎn)(塊)花葉；CK.正常葉

2.2 紅花檵木季節(jié)性花葉現(xiàn)象發(fā)生比率分析

對(duì)調(diào)查區(qū)域292個(gè)樣方的紅花檵木5類季節(jié)性花葉表型類型發(fā)生概率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如圖2所示。從圖2中得知表型為紅黃相間花葉類型(C)的發(fā)生比率明顯高于其他4種表型類型，高達(dá)42.52%；其次是綠黃相間花葉(B)為 22.12%，紅色斑點(diǎn)花葉(E)和葉片變小的花葉(A)的發(fā)生比率分別為14.02%和13.86%；完全黃化或白化的表現(xiàn)(D)發(fā)生比率最低，僅7.48%。

圖2 紅花檵木季節(jié)性花葉不同表型發(fā)生比率Fig.2 Occurrence ratio of seasonal mosaic leaf phenotypes of Loropetalum chinense var. rubrum

2.3 葉片橫切解剖結(jié)構(gòu)的觀察分析

5類表型的異?；ㄈ~與正常葉片的解剖結(jié)構(gòu)見圖3。根據(jù)柵欄組織花青素的分布，葉片變小的花葉(A)與正常葉(CK)的柵欄組織中以花青素占主要地位，葉綠素含量較少；紅黃花葉(C)的花青素含量較少且僅分布于柵欄組織中；紅斑葉(E)葉綠素明顯較多，花青素含量少并呈散點(diǎn)分布；綠黃花葉(B)橫切中葉片富含葉綠素，而未見花青素分布；黃化葉(D)葉綠素含量也較少，葉片失綠，橫切面主要呈黃白色。

圖3 顯微鏡下不同異?；ㄈ~各橫切面解剖結(jié)構(gòu)(40×)Fig.3 Cross-sectional structures of different abnormal mosaic leaves under microscope(40×)

2.4 5類表型異?；ㄈ~各色素含量的比較

由表1可知，總?cè)~綠素含量以E類(1.77 mg·g-1)最多，顯著高于其他類，D類的總?cè)~綠素含量最少，僅0.15 mg·g-1；CK類花色素苷含量顯著高于其他類，高達(dá)3.40 mg·g-1，最少的仍為D類，僅有0.47 mg·g-1；D和B類的類胡蘿卜素含量明顯較高，分別為2.05 mg·g-1和1.89 mg·g-1，最少的是A類，僅為0.14 mg·g-1。通過(guò)統(tǒng)計(jì)各類3種色素含量的占比可知(圖4)，A類的花色素苷含量占比高達(dá)85%，明顯多于其他兩種色素含量，其中類胡蘿卜素含量極少(4%)；B類中類胡蘿卜素和總?cè)~綠素含量均較多，占比分別為51%和33%；C類為花色素苷含量最多，約為一半(53%)，其次為類胡蘿卜素含量較多(36%)；D類中類胡蘿卜素含量明顯較多，占比高達(dá)77%，而總?cè)~綠素含量極少(5%)；E類的總?cè)~綠素含量占比最大，高達(dá)62%；作為CK類的正常葉以花色素苷含量最多(64%)，其次為總?cè)~綠素含量(26%)。

表1 不同異常葉色表型葉片的各色素含量Table 1 Pigment content of different abnormal leaf color phenotypes mg·g-1

2.5 5類表型異?；ㄈ~葉綠素?zé)晒鈪?shù)的比較

正常葉CK與5種不同表型花葉的葉綠素?zé)晒馓匦詤?shù)見表2，F(xiàn)m是PSⅡ反應(yīng)中心處于完全關(guān)閉時(shí)的熒光產(chǎn)量，F(xiàn)m值與葉片吸收和傳遞光能的能力呈正相關(guān)，初始熒光(F0)可評(píng)價(jià)逆境對(duì)植物葉片PSⅡ永久性損傷的程度，并與植物葉片的葉綠素濃度有關(guān)[11]。從表2可知，A類的最大熒光Fm值最高(9 579.67)，而最低的D類僅為3 787.00，顯著低于A類，其余類的Fm值為CK>B>E>C；6類樣品中初始熒光值F0最高的是E類(3 835.00)，顯著高于其他組，而D類F0值為最低(1 869.00)，其他類F0值為CK> A>B>C；PSⅡ 的潛在光化學(xué)活性Fv/F0值最高的是A類 3.63，其次為CK的3.34及E類的 2.86，3類均顯著高于其他類；而Fv/Fm值的規(guī)律同F(xiàn)v/F0值基本一致。光化學(xué)淬滅系數(shù)qP為CK>E>C>B>A>D，且D類顯著低于其 他類。

表2 5類表型異常葉與正常葉的葉綠素?zé)晒馓匦员容^Table 2 Comparison of chlorophyll fluorescence characteristics between five abnormal leaves and normal leaves

2.6 5類表型異?；ㄈ~葉片的光合參數(shù)比較

植物的光合能力取決于本身的遺傳特性，不同種類間光合能力均存在較大差異[12]。不同花葉葉片光合參數(shù)的比較如圖5和表3所示，在 0～2 000(μmol·m-2·s-1)的光照強(qiáng)度范圍內(nèi)，隨著光合有效輻射(PAR)的增加，正常葉色樣品和不同類型的異常葉色樣品的凈光合速率(Pn)均呈線性增加，當(dāng)PAR達(dá)到一定值時(shí)，Pn達(dá)到最大值，即達(dá)到光飽和點(diǎn)，所有樣品材料的Pn均先增加達(dá)到最大值后趨向穩(wěn)定。6類樣品的表觀量子效率(AQE)為D>C>B>A>CK>E，其中D類顯著高于其余5類；光飽和點(diǎn)為CK>E>B> C>A>D，且各類間對(duì)比差異較大；最大凈光合速率為CK>B>C>E>A>D，且CK為12.78 μmol·m-2·s-1，顯著高于其他類；光補(bǔ)償點(diǎn)由高至低依次為C>A>D>E>B>CK，最高的C類(49.52 μmol·m-2·s-1)顯著高于CK類 (6.28 μmol·m-2·s-1)；暗呼吸速率為A>C>D>B>E>CK，且各類間的差異顯著。

圖5 5類異常葉與正常葉的光響應(yīng)曲線比較Fig.5 Comparison of light response curves between five abnormal leaves and normal leaves

表3 6種類型葉片的光合-光響應(yīng)曲線特征參數(shù)

3 結(jié)論與討論

本研究對(duì)分布于長(zhǎng)沙7個(gè)行政區(qū)的居住小區(qū)、市政道路和學(xué)校校園綠地3類樣區(qū)中的紅花檵木異常葉色發(fā)生情況進(jìn)行調(diào)查，將紅花檵木異常葉色按葉片顏色和大小為依據(jù)分類，共分為葉片變小的花葉(A)、綠黃相間花葉(B)、紅黃相間花葉(C)、黃化或白化葉(D)、紅色斑點(diǎn)(塊)花葉(E)共5類典型表型。其中C類型發(fā)生比率最高，D類型發(fā)生比率最低，C類型發(fā)生比率最高的原因可能是因?yàn)榧t花檵木異常葉色主要發(fā)生于枝條頂端修剪后的新葉，正常新葉展葉后應(yīng)為紫紅色所致；而B類花葉的產(chǎn)生可能是由于紅花檵木具有高溫返青的特點(diǎn)，葉片返青后發(fā)生黃化而出現(xiàn)綠黃異常花葉；至于這些季節(jié)性的異常花葉具體誘因是生物因子還是非生物因子還有待進(jìn)一步的深入研究。

總?cè)~綠素、類胡蘿卜素及花色素苷含量之間的比例不僅與葉色相關(guān)[13]，也與光合能力有關(guān)，另外，葉綠素?zé)晒鈪?shù)也能夠反映植株葉片的光合效率和潛在能力[14]。有研究表明[15-16]，植物體中葉綠素含量越高，越有利于陰生植物在弱光條件下有效地吸收光能；類胡蘿卜素既可作為光合色素，又是植物的內(nèi)源抗氧化劑，在提升葉片利用藍(lán)紫光能力的同時(shí)增強(qiáng)葉片的光合效能[17]；花色素苷能夠防御光破壞，具有維持和完善植物的光合功能的能力[18]。本研究對(duì)5類異?；ㄈ~光合特性及色素含量的測(cè)定中發(fā)現(xiàn)，CK葉花色素苷占比最多，總?cè)~綠素次之，類胡蘿卜素最少，葉片呈現(xiàn)均勻的紫紅色，葉片吸收及傳遞光能的能力較強(qiáng)，光合作用效率較高，最大凈光合速率、表觀量子效率及光飽和點(diǎn)較高，光補(bǔ)償點(diǎn)較低，暗呼吸速率最低，有機(jī)物積累能力較強(qiáng)，反映其對(duì)光的適應(yīng)性較強(qiáng)[19]。與CK相比，E類葉葉綠素含量較高，A類葉花色素苷含量較高，各光合參數(shù)僅次于CK，葉綠素?zé)晒鈪?shù)與正常葉較為接近，光合能力及對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力較好。此外，根據(jù)前人研究結(jié)論可知，PSⅡ原初光能轉(zhuǎn)換效率值(Fv/Fm)可代表植物的潛在最大光合能力，PSⅡ 有效光化學(xué)量子效率(Fv/F0)指標(biāo)能體現(xiàn)光系統(tǒng)PSⅡ的潛在光化學(xué)活性，且該值越高說(shuō)明植物的光合性能越強(qiáng)，以上兩個(gè)指標(biāo)作為植物發(fā)生光抑制的敏感指標(biāo)，用于評(píng)估植物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性，來(lái)判斷植物生長(zhǎng)是否受到抑制[8, 20-21]，F(xiàn)v/Fm應(yīng)在 0.75～0.85[22]，實(shí)測(cè)表觀量子效率(AQE)應(yīng)在 0.03～0.05[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，僅CK與E的AQE，CK與A的Fv/Fm介于或接近上述范圍，表明A、E類花葉抵御光系統(tǒng)破壞的能力相對(duì)較好，而B、C、D 3種類型均與此范圍相差較遠(yuǎn)，表明受外界影響較大[24]，總體光合能力B優(yōu)于C、D；且E類qP值較高，表明其有較高的光能利用效率，對(duì)自身光合機(jī)構(gòu)保護(hù)能力也較強(qiáng)[25]，這可能是由于E類葉葉綠素含量顯著高于包括對(duì)照的其他組，因此并未由于出現(xiàn)紅色斑塊而降低光合能力；本研究還發(fā)現(xiàn)，CK的總?cè)~綠素含量次于E類的紅斑葉，而CK的Pnmax是顯著高于其他類型花葉。高陽(yáng)等[26]研究中同樣發(fā)現(xiàn)，蔭蔽環(huán)境中的大豆葉片葉綠素含量最多的種類其Pnmax卻不是最大的，葉綠素含量并不一定與Pnmax成正比，還需參考其生長(zhǎng)環(huán)境，根據(jù)前期的實(shí)際調(diào)查發(fā)現(xiàn)，本研究的E類葉在蔭蔽環(huán)境中生長(zhǎng)較多，因此有可能是E類葉適應(yīng)蔭蔽環(huán)境的一種體現(xiàn)。A類花葉光合面積減少，花色素苷含量同樣占比較多，因此抵御外界對(duì)光合系統(tǒng)的破壞能力較強(qiáng)。D類葉各種色素含量、光合作用效率、有機(jī)物積累能力基本均最低，表明其適應(yīng)能力最差，受到環(huán)境的影響最大。

綜上所述，與正常葉相比，紅花檵木葉片呈現(xiàn)季節(jié)性花葉的表型不同，其光合生理均有不同的響應(yīng)表現(xiàn)，A、E類的花葉的出現(xiàn)對(duì)植株來(lái)說(shuō)受到的消極影響較??；此外，B、C、D 3類花葉的各項(xiàng)指標(biāo)與CK相比均較差，綜合各種指標(biāo)來(lái)說(shuō)，B優(yōu)于C，D最差。可見，這3類花葉對(duì)植株來(lái)說(shuō)受到的消極影響較大。本研究為今后進(jìn)一步探究紅花檵木花葉形成的具體原因及形成機(jī)理奠定基礎(chǔ)。