王海英，劉航空

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 園藝學(xué)院，陜西楊凌 712100)

隨著分子生物學(xué)的研究推進(jìn)，高通量測(cè)序技術(shù)的不斷完善，大量的園藝作物相繼完成基因組測(cè)序，極大地推動(dòng)了遺傳基因組學(xué)、功能基因組學(xué)等方面的研究[1]?？蒲泄ぷ髡呖梢蚤_(kāi)展種質(zhì)親緣關(guān)系確立、遺傳多樣性評(píng)估、種子純度測(cè)定、分子標(biāo)記檢測(cè)、遺傳圖譜構(gòu)建等遺傳學(xué)試驗(yàn)，還可以進(jìn)行候選基因的克隆與功能驗(yàn)證、目標(biāo)基因等位變異的發(fā)掘、轉(zhuǎn)基因后代檢測(cè)等功能基因組試驗(yàn)[2-4]，而這些試驗(yàn)都離不開(kāi)基因組DNA的提取，根據(jù)DNA提取原理，基本步驟如下：植物組織破碎(可分為簡(jiǎn)易破碎和深度研磨)；化學(xué)試劑或物理加熱煮沸法裂解細(xì)胞膜釋放基因組DNA；化學(xué)試劑或離心去除與DNA結(jié)合的組蛋白等；預(yù)冷的異丙醇、醋酸鈉、醋酸鉀等試劑沉淀核酸、DNA樣品純化，最后分離獲得植物基因組DNA(圖1)[5-17]。不同的試驗(yàn)對(duì)DNA的濃度和質(zhì)量要求不同，故提取方法也不盡相同。

圖1 不同DNA提取方法流程示意圖Fig.1 Schematic diagram of different DNA extraction methods

本研究比較了當(dāng)前實(shí)驗(yàn)室廣泛采用的幾種植物基因組DNA提取方法，并通過(guò)不同試驗(yàn)檢測(cè)各方法獲得DNA的質(zhì)量和適用范圍，進(jìn)而提出一套基于不同試驗(yàn)?zāi)康牡腄NA提取方案，為后續(xù)研究提供技術(shù)支持和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

番茄材料為Micro-TOM(Solanumlycopersicumcv. Micro-Tom)幼苗(4周)、成株葉片(2個(gè)月)和果實(shí)，均由西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院實(shí)驗(yàn)教學(xué)管理中心提供。

1.2 主要儀器設(shè)備

冷凍干燥器(CoolSafeTM110-4 L，丹麥)、QIAGEN研磨儀(Tissuelyzer，德國(guó))、通風(fēng)櫥、臺(tái)式離心機(jī)(eppendorf 5810R，德國(guó))、紫外分光光度儀NanoDrop ND2000/2000C(Thermo ScientificTM，美國(guó))、PCR儀(S-1000 Bio-Rad，美國(guó))、384孔PCR儀(CHEMIDOE XRS+, Thermo ScientificTM，美國(guó))、電泳儀(北京六一DYY-6)、凝膠成像系統(tǒng)(Bio-rad Gel Doc)、酶標(biāo)儀FLUOstar Omega(BMG LABTECH，德國(guó))等。

1.3 試驗(yàn)方法

采用5種方法提取番茄基因組DNA，即堿裂解煮沸法[16]、SDS(十二烷基肌氨酸鈉)冰浴法[18]、改良的CTAB(十六烷基三乙基溴化銨)法[19]、高鹽低pH法[20]、PVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)法[21]。本研究參考以上DNA提取方法的同時(shí)并進(jìn)行了部分操作環(huán)節(jié)的改進(jìn)。

1.3.1 堿裂解煮沸法 該方法樣品無(wú)需研磨。取番茄嫩葉、成株葉片和去皮果實(shí)各50 mg，用剪刀對(duì)組織進(jìn)行簡(jiǎn)單破碎后分別放入2.0 mL離心管中，加入100 μL 0.4 mol/L NaOH溶液，沸水浴1 min。取20 μL上清液置于1.5 mL離心管中，加入80 μL TE緩沖液，混勻，備用。

1.3.2 SDS冰浴法 取番茄嫩葉、成株葉片和去皮果實(shí)材料各200 mg分別裝入2 mL離心管，放入兩個(gè)無(wú)水乙醇處理過(guò)的直徑4 mm鋼珠，然后將樣品冷凍干燥。利用組織研磨儀對(duì)干燥的番茄材料進(jìn)行研磨，頻率30次/s，時(shí)間1 min左右。研磨完畢后，按照如下步驟進(jìn)行：向離心管中加入800 μL、4 ℃預(yù)冷的SDS提取液(0.1 mol/L Tris-HCl、10 mmol/L EDTA、2% SDS，總pH 8.0)，勻質(zhì)化后，加入等體積(800 μL)酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1，pH=8)；充分顛倒混勻30 s后，冰上靜置20 min；4 ℃、12 000 r/min離心10 min；吸取650 μL上清液于另一個(gè)2 mL離心管中，加入等體積(650 μL)氯仿，輕柔上下顛倒，充分混勻； 4 ℃、12 000 r/min離心5 min；收集上清500 μL，轉(zhuǎn)入新的1.5 mL的離心管中，加入50 μL 3 mol/L NaAc(pH 5.2)去色，然后加入500 mL預(yù)冷的異丙醇；輕柔顛倒數(shù)次混勻， -20 ℃條件冷凍30 min以上；4 ℃、 12 000 r/min離心3 min；棄上清，加入500 μL 75%酒精洗滌沉淀，4 ℃、12 000 r/min離心3 min；棄上清，加入500 μL無(wú)水乙醇洗滌沉淀，4 ℃、12 000 r/min離心3 min；離心后立即倒掉液體，自然風(fēng)干后加入100～200 μL TE緩沖液或雙蒸水(含有10 mg/mL的RNA酶)溶解DNA，置于37 ℃恒溫箱約15 h，使RNA消解；置于-20 ℃保存，備用。

1.3.3 改良的CTAB溫浴法 該方法樣品研磨方式同“1.3.2”，研磨完成后步驟如下：向離心管中加入800 μL 65 ℃預(yù)熱的2% CTAB抽提緩沖液(0.1 mol/L Tris-HCl，1.4 mol/L NaCl，20 mmol/L EDTA，2% CTAB，2% β-巰基乙醇，總pH 8.0)，并勻質(zhì)化；充分顛倒混勻后，置于65 ℃水浴或恒溫箱中40～50 min，期間取出2～3次上下顛倒混勻；冷卻2 min后加入等體積(800 μL)酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24 ∶1，pH=8)，充分振蕩2～3 min使其混勻；4 ℃、12 000 r/min離心10 min；緩慢吸取600 μL上清液于1.5 mL離心管中，加入60 μL 3 mol/L NaAc(pH 5.2)去色，然后加入600 μL預(yù)冷異丙醇；緩慢搖動(dòng)離心管30 s，使有機(jī)層與水層充分混合至絮狀物出現(xiàn)，-20 ℃靜置不少于30 min；4 ℃、12 000 r/min離心5 min；離心后立即倒掉液體，切勿將白色DNA沉淀倒出，再加入500 μL 75%乙醇洗滌沉淀，4 ℃、12 000 r/min離心3 min；棄上清，自然風(fēng)干后加入100～200 μL TE緩沖液或雙蒸水(含有10 mg/mL的RNA酶)溶解DNA，置于 37 ℃恒溫箱約15 h，使RNA消解；置于-20 ℃保存，備用。

1.3.4 高鹽低pH法 該方法樣品研磨方式同“1.3.2”，研磨完成后步驟如下：向離心管中加入800 μL 65 ℃預(yù)熱的高鹽低pH提取液(0.1 mol/L NaAC、50 mmol/L EDTA、0.5 mol/L NaCl、2.5% PVP、3% SDS、1% β-巰基乙醇，總pH 5.5)，勻質(zhì)化后65 ℃溫育30 min，期間取出 1～2次上下顛倒混勻；室溫、12 000 r/min離心10 min；吸取上清液600 μL加入2/3倍體積的 2.5 mol/L KAC(pH 4.8)，冰上靜置30 min；室溫、12 000 r/min離心10 min；吸取500 μL上清液，加入等體積-20 ℃預(yù)冷的異丙醇, 輕柔混勻后-20 ℃條件靜置30 min； 4 ℃、12 000 r/min離心5 min；立即倒掉液體，用500 μL 75%乙醇洗滌DNA沉淀1～2次，然后4 ℃、12 000 r/min離心3 min；立即倒掉液體，自然風(fēng)干后加入 100～200 μL TE緩沖液或雙蒸水(含有10 mg/mL的RNA酶)溶解DNA，置于37 ℃恒溫箱約 15 h，使RNA消解；置于-20 ℃保存，備用。

1.3.5 PVP-40法 該方法樣品研磨方式同 “1.3.2”。研磨完成后步驟如下：向離心管中加入800 μL無(wú)毒的PVP-40提取液(0.1 mol/L Tris-HCl，1.0 mol/L KCl，20 mmol/L EDTA，2% PVP-40，總pH 9.5)，勻質(zhì)化后置于65 ℃恒溫箱內(nèi)溫育30 min，期間取出1～2次上下顛倒混勻；室溫、12 000 r/min離心1 min，向管中加入1/3體積(267 μL)的5 mol/L KAC溶液(pH 5.8)，室溫靜置20 min；室溫、12 000 r/min離心15 min；吸取600 μL上清液，轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，加入等體積-20 ℃預(yù)冷的異丙醇, 輕柔混勻，靜置20 min；室溫、12 000 r/min離心10 min；棄上清液，保留底部沉淀，并加入500 μL 75%乙醇洗滌沉淀1～2次，然后12 000 r/min離心3 min；棄上清液，沉淀自然風(fēng)干后加入 100～200 μL TE緩沖液或雙蒸水(含有10 mg/mL的RNA酶)使DNA溶解，置于37 ℃恒溫箱約15 h，使RNA消解； 置于-20 ℃保存，備用。

1.4 DNA純度與濃度檢測(cè)

(1)配制0.8%的瓊脂糖凝膠，取5種方法提取的DNA樣品各10 μL點(diǎn)樣，100～120 V恒壓下電泳30～40 min，SYBRGreen染色，并在凝膠成像系統(tǒng)(Bio-rad Gel Doc)觀察電泳條帶。

(2)以TE緩沖液為對(duì)照，利用紫外分光光度儀NanoDrop ND2000/2000C測(cè)定5種方法提取的DNA樣品濃度，利用230 nm、260 nm和280 nm處的吸收值比例(OD260 nm/OD230 nm和OD260 nm/OD280 nm)衡量DNA的質(zhì)量。

1.5 引物設(shè)計(jì)與合成

為探索5種方法所提取的基因組DNA的適用范圍，分別利用3種PCR擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行比較，分別為與番茄果實(shí)大小連鎖的SNP標(biāo)記solcap_snp_sl_100656[3]、番茄常用的內(nèi)參基因肌動(dòng)蛋白(actin)以及R2R3MYB類轉(zhuǎn)錄因子設(shè)計(jì)PCR引物[22]。其中solcap_snp_sl_100656的PCR產(chǎn)物大小為65 bp，內(nèi)參基因actin的PCR產(chǎn)物大小為126 bp，R2R3MYB類轉(zhuǎn)錄因子PCR產(chǎn)物大小為1 359 bp。除了SNP標(biāo)記設(shè)計(jì)為AQP引物(等位基因特異的定量PCR 基因分型系統(tǒng))，其他兩個(gè)均為普通的PCR引物。對(duì)于設(shè)計(jì)好的AQP引物序列，需要在兩條正向的引物5′端分別加上FAM或者HEX熒光的接頭序列，其中FAM接頭序列為5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3′，HEX接頭序列為5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3′，用于AQP標(biāo)記系統(tǒng)的檢測(cè)[23]。以上引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。合成后的AQP引物經(jīng)溶解后需配置成引物mix(兩條正向引物為12 mmol/L，反向引物為30 mmol/L)，其他引物正常溶解。引物序列及其他具體信息見(jiàn)表1。

表1 用于PCR的引物Table 1 Primers for PCR

1.6 AQP-SNP、普通PCR以及基因克隆擴(kuò)增與檢測(cè)

AQP的384板PCR反應(yīng)體系總體積為 5 μL，其中HiGeno 2× Probe Mix B體積為 2.5 μL，引物mix為0.06 μL，DNA模板為2 μL(50～100 ng)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)在 384孔PCR儀上進(jìn)行，設(shè)置為差減反應(yīng)程序(Touchdown)： 94 ℃變性15 min；94 ℃變性20 s，65 ℃退火 60 s，每循環(huán)一次降0.8 ℃，10個(gè)循環(huán)；94 ℃變性 20 s，57 ℃退火60 s，32個(gè)循環(huán)[23]。PCR反應(yīng)完畢后放在酶標(biāo)儀FLUOstar Omega中讀取終端熒光數(shù)據(jù)，然后將數(shù)據(jù)導(dǎo)入KlusterCaller軟件進(jìn)行基因分型分析。

內(nèi)參基因普通PCR體系為15 μL，R2R3MYB基因擴(kuò)增體系為25 μL，其中DNA模板為2 μL(50～100 ng)，2× PCR反應(yīng)mix 分別為7.5 μL和12.5 μL，ddH2O分別為5.5 μL和10.5 μL。擴(kuò)增反應(yīng)在96孔PCR儀中進(jìn)行，基本程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性30 s， 55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s(其中基因擴(kuò)增延伸時(shí)間為1 min)，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，12 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物分別用6%聚丙烯酰胺凝膠(變性)和1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，其中聚丙烯酰胺凝膠條件為200 V恒壓、1.5 h，然后硝酸銀銀染顯色；瓊脂糖凝膠電泳條件為80～100 V恒壓、30 min，SYBRGreen染色，然后凝膠成像系統(tǒng)(Bio-rad Gel Doc)觀察電泳條帶。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外分光光度儀比較DNA的純度和濃度

對(duì)于純DNA溶液，其OD260 nm/OD280 nm比值應(yīng)為1.80左右，如果OD260 nm/OD280 nm大于 1.90，說(shuō)明有RNA污染；如果小于 1.60，說(shuō)明有蛋白質(zhì)或酚類等雜質(zhì)。而OD260 nm/OD230 nm一般大于2.0，如果低于2.0，說(shuō)明DNA溶液中有殘存的鹽和小分子雜質(zhì)，如多糖、氨基酸、酚等。從表2可以看出，5種DNA提取方法中，堿裂解蒸煮法提取的DNA濃度最低，質(zhì)量最差；其他4種方法提取的DNA濃度差異不大，為180～220 ng/μL，SDS冰浴法和CTAB法提取的DNA質(zhì)量最好，純度最高；高鹽低pH法和PVP-40法提取的DNA有小分子雜質(zhì)，質(zhì)量一般。比較樣品材料，幼苗葉片提取的DNA質(zhì)量最好，成株葉和果實(shí)之間差異不大。

表2 不同方法提取的番茄基因組DNA的純度和濃度Table 2 Comparison of purity and concentration of different DNA extraction methods

2.2 瓊脂糖電泳比較DNA的純度

由圖2可以看出，5種方法從番茄的幼苗、成株葉片和去皮果實(shí)中提取的DNA電泳條帶分布較集中。其中堿裂解法提取的DNA樣品電泳條帶出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，說(shuō)明樣品中存在RNA、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，且DNA條帶亮度比其他4種方法提取的DNA條帶暗；其他4種方法沒(méi)有明顯拖尾現(xiàn)象，條帶亮度沒(méi)有明顯差異，說(shuō)明提取的基因組DNA質(zhì)量比較理想。

1～3號(hào)為PVP-40法；4～6號(hào)為高鹽低pH法；7～9號(hào)為CTAB法；10～12號(hào)為SDS冰浴法；13～15號(hào)為堿裂解法；每種方法的點(diǎn)樣順序從左至右依次為幼苗、成株葉和果實(shí)；M為Marker

2.3 番茄基因組DNA不同PCR檢測(cè)結(jié)果

圖3顯示，對(duì)于AQP標(biāo)記體系，5種方法提取的各組織DNA樣品均能成功擴(kuò)增出SNP標(biāo)記solcap_snp_sl_100656的產(chǎn)物，且呈現(xiàn)紅色熒光，說(shuō)明符合AQP檢測(cè)體系的要求；對(duì)5種方法提取不同番茄組織獲得的所有樣品進(jìn)行內(nèi)參基因actin的部分小片段的擴(kuò)增，并采用6%聚丙烯酰胺(變性)凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，所有電泳孔道均擴(kuò)增出目標(biāo)條帶，完全符合小片段PCR擴(kuò)增的要求(圖4)；利用R2R3MYB類轉(zhuǎn)錄因子的引物對(duì)所有方法提取的DNA進(jìn)行基因擴(kuò)增，并利用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，結(jié)果表明，除了堿裂解方法，其他4種方法提取的DNA樣品均能擴(kuò)增出目的片段(1 359 bp)，得到穩(wěn)定的譜帶(圖5)，符合基因擴(kuò)增的要求。

黑色點(diǎn)為水對(duì)照，藍(lán)色點(diǎn)為熒光對(duì)照，紅色點(diǎn)表示用不同提取方法提取的樣品

1～3號(hào)為堿裂解法；4～6號(hào)為SDS冰浴法；7～9號(hào)為CTAB法；10～12號(hào)為高鹽低pH法；13～15號(hào)為PVP-40法；每種方法的點(diǎn)樣順序從左至右依次為幼苗、成株葉和果實(shí)；M為Marker

3 討 論

本研究比較了5種DNA提取方法：堿裂解法、SDS冰浴法、改良的CTAB法、高鹽低pH法和PVP-40法獲得番茄不同組織的基因組DNA質(zhì)量和適用范圍。比較可知，不論采用哪種提取方法，利用番茄幼苗組織獲得的DNA質(zhì)量均好于成株葉片和果實(shí)。由于植物成熟組織中DNA的提取有一定的難度，番茄成熟果實(shí)中次級(jí)代謝產(chǎn)物較多，在研磨后果實(shí)內(nèi)的酚類物質(zhì)很容易受到氧化而變褐色，進(jìn)而影響DNA的提取。因此，在條件允許下，應(yīng)優(yōu)先選取幼嫩葉片提取基因組DNA。

1-4號(hào)為堿裂解法；5-8號(hào)為SDS冰浴法；9-12號(hào)為CTAB法；13-16號(hào)為高鹽低pH法；17-20號(hào)為PVP-40法；每種方法的點(diǎn)樣順序從左至右依次為幼苗、幼苗、成株葉和果實(shí)；M為Marker

通過(guò)不同試驗(yàn)檢測(cè)5種提取方法獲得DNA的適用范圍，得出以下結(jié)論：堿裂解蒸煮法成本最低，試劑易得，無(wú)需深度研磨，操作簡(jiǎn)便，提取的番茄DNA濃度最低，質(zhì)量最差，但能滿足一般的分子標(biāo)記檢測(cè)試驗(yàn)，如AQP熒光標(biāo)記和SSR小片段的擴(kuò)增檢測(cè)及大規(guī)模群體PCR檢測(cè)的需要。SDS冰浴法和改良的CTAB法成本較高，試劑配制及操作步驟復(fù)雜，試驗(yàn)周期較長(zhǎng)，但提取的DNA質(zhì)量最好，更適合要求較高的分子生物學(xué)試驗(yàn)，缺點(diǎn)是兩種方法均使用了毒性試劑，如酚、氯仿、異戊醇等，污染環(huán)境且對(duì)人體有害，如在教學(xué)試驗(yàn)中采用兩種提取方法，容易引起學(xué)生的排斥心理，不利用提高學(xué)生教學(xué)實(shí)踐的積極性。高鹽低pH法和PVP-40法成本低，試劑配制要求低，操作步驟簡(jiǎn)便，提取時(shí)間短，獲得的DNA質(zhì)量雖不及SDS和CTAB法，但也能滿足大部分生物學(xué)試驗(yàn)，具有一定的通用性，尤其在遺傳定位、種質(zhì)多樣性評(píng)估、種子純度檢測(cè)、轉(zhuǎn)基因植物檢測(cè)等試驗(yàn)中需要大規(guī)模DNA提取時(shí)，SDS和CTAB法可有效節(jié)約時(shí)間成本，且所用的試劑無(wú)毒，非常適合于初學(xué)者和學(xué)生教學(xué)試驗(yàn)。建議在以后的教學(xué)和科學(xué)研究試驗(yàn)中，在滿足試驗(yàn)對(duì)DNA質(zhì)量要求前提下優(yōu)先考慮高鹽低pH法和PVP-40法提取基因組DNA。