吳萌萌，張棟良，孫彩虹，李 罡，董 釗，王 新

(西安市動物疫病預(yù)防控制中心，陜西 西安 710061)

1 病原

ASFV為非洲豬瘟病毒科(Asfarviridae)非洲豬瘟病毒屬(Asfarvirus)的線性雙鏈DNA蟲媒病毒。病毒粒子結(jié)構(gòu)呈20面體，直徑在170～190 nm之間，自外向內(nèi)由外膜 (External envelope)、衣殼 (Capsid)、內(nèi)膜 (Inner envelope)、核心殼(Core shell)和病毒擬核基因組(Nucleoid)五部分組成。病毒基因組長度在170～193 kb，由一個中心保守區(qū)和兩個可變端組成，目前研究發(fā)現(xiàn)其開放閱讀框(Open reading frames，ORFs)有151～167 個。基于衣殼蛋白P72編碼基因B646L的部分序列分析，非洲豬瘟病毒已鑒定出24種基因型。

ASFV抵抗力強(qiáng)，在污染物或肉制品中可長時間保持感染性。在低溫條件下保持穩(wěn)定，經(jīng)過反復(fù)凍融或超聲仍具有感染性，但對高溫抵抗力不強(qiáng)，在60 ℃條件下，30 min可徹底滅活病毒。在蛋白含量充足或合適條件下，ASFV可在pH4～13的環(huán)境中保持活性，例如感染豬肉腐化和腌制熟化并不能有效滅活病毒。常規(guī)消毒劑如氫氧化鈉、次氯酸鹽、醛類制劑等均可滅活A(yù)SFV。

2 流行病學(xué)

世界衛(wèi)生組織(OIE)將非洲豬瘟列為法定報告的動物疫病。1921年肯尼亞首次報道非洲豬瘟疫情, 1957年葡萄牙發(fā)生非洲豬瘟疫情，ASFV開始在歐洲傳播，并于20世紀(jì)90年代中期被根除(撒丁島除外)。2007年ASFV再次進(jìn)入歐洲格魯吉亞，此后，向北和向西蔓延，影響高加索地區(qū)(2007年)、俄羅斯聯(lián)邦(2007年)、烏克蘭(2012年)和白俄羅斯波羅的海國家(2014)、波蘭(2014)、摩爾多瓦(2016)、捷克共和國和羅馬尼亞(2017)。中國于2018年8月份報告首例非洲豬瘟疫情，并將其列為一類動物疫病。據(jù)報道，目前捷克共和國已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了非洲豬瘟疫情的控制和根除，同樣在比利時，非洲豬瘟的感染似乎也已得到控制，根除工作即將完成。

由于缺乏有效的疫苗和控制措施，ASFV的感染與傳播對全球的養(yǎng)殖行業(yè)構(gòu)成巨大威脅，造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。ASFV 潛伏期一般為5～19 d，最長可達(dá)21 d。主要宿主有脊椎動物(家豬、野豬及非洲疣豬)和部分鈍緣蜱。這些蜱種既可以作為ASFV的儲存宿主,又可以作為病毒傳播媒介。與經(jīng)典豬瘟對于仔豬更易感不同，所有年齡段的豬均易感染非洲豬瘟。在林棲循環(huán)、蜱豬循環(huán)、家豬循環(huán)和野豬-棲息地循環(huán)4個非洲豬瘟的流行方式中，對社會經(jīng)濟(jì)影響最大的始終是家豬循環(huán)，感染豬及其血液、組織臟器、豬肉及豬肉制品以及分泌物(唾液、鼻腔分泌物、眼淚、尿液、糞便、精液)等豬源產(chǎn)品是非洲豬瘟傳播的主要傳染源，此外，全球范圍內(nèi)多起疫情調(diào)查顯示通過感染的豬肉及其制品和內(nèi)臟產(chǎn)生的餐廚剩余物能造成ASFV 遠(yuǎn)距離的傳播。除了野豬自身的傳播，其他動物例如鳥類、流浪犬和野生動物的捕食以及人類的游玩等可能會接觸到野豬的活動機(jī)械性攜帶擴(kuò)散病毒，從而造成疫情的發(fā)生和流行。

ASFV 傳播途徑分為直接傳播和間接接觸傳播兩種。感染豬和易感豬之間的口鼻接觸是 最常見、最有效的直接傳播途徑，其次還可以通過易感豬接觸感染豬排出的體液、分泌物、排泄物等進(jìn)而發(fā)生傳播。間接接觸傳播是病毒發(fā)生遠(yuǎn)距離、跳躍式傳播，最主要途徑則是易感豬接觸病毒污染的豬肉、飼料、糞便、泔水、衣服、鞋靴、車輛、墊料、各種器具等進(jìn)而發(fā)生感染和傳播。

3 臨床癥狀和病理變化

3.1 臨床癥狀

根據(jù)臨床癥狀和病程長短分為最急性型、急性型、亞急性型和慢性型。最急性型表現(xiàn)為無明顯臨床癥狀突然死亡。急性型表現(xiàn)為高熱，體溫可升至42．0 ℃；精神沉郁；呼吸困難；厭食；嘔吐；腹瀉，糞便帶血；便秘；耳、四肢、腹背部皮膚有紅色至紫色出血塊；流產(chǎn)；眼、鼻有黏性或膿性分泌物；可視粘膜潮紅發(fā)紺，死亡率可達(dá)100%。亞急性型與急性型相比，臨床癥狀較輕，病死率也大幅下降。慢性型臨床上以皮膚變紅、發(fā)熱、食欲不振、中度到重度的關(guān)節(jié)腫脹、不愿站立等較為緩和的癥狀為主要特征。隱性帶毒型的豬只不表現(xiàn)出臨床癥狀,外觀無變化。

3.2 剖檢變化

最急性型病例可能無明顯剖檢變化。內(nèi)臟器官出血為急性型與亞急性型的主要剖檢特征，其中脾臟顏色呈現(xiàn)暗紅色或黑色，并出現(xiàn)明顯腫大和出血現(xiàn)象，整體變脆易碎；淋巴結(jié)出現(xiàn)腫大和出血現(xiàn)象；心臟、腎臟和肺臟等器官表面呈現(xiàn)多個出血點(diǎn)；整個胸腔、腹腔和心包等位置存在大量澄清、黃色或血色的液體。慢性型主要引起纖維素性胸膜肺炎、肺干酪樣壞死、纖維素性心包炎。

4 實(shí)驗(yàn)室診斷

目前，OIE推薦的ASFV檢測方法主要有病毒分離、熒光抗體檢測抗原(FAT)以及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。

定量PCR (qPCR)和常規(guī)PCR都是快速、靈敏的檢測ASFV的方法。熒光定量PCR 方法操作簡單，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，是非洲豬瘟病原檢測的主要手段，以其敏感、特異、快速、穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)在實(shí)踐中廣泛應(yīng)用。Grau等開發(fā)了多重實(shí)時PCR (mRT-qPCR)，用于同時檢測ASFV、經(jīng)典豬瘟病毒和口蹄疫病毒。Fernández-Pinero J 等建立了UPL-PCR方法，對ASFV的早期檢測具有更高的診斷敏感性。液滴數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)(ddPCR)方法是新一代PCR技術(shù)，在ASFV的檢測中能夠在不使用標(biāo)準(zhǔn)樣品的情況下對核酸定量，提高檢測靈敏度。

吳海濤等利用原核系統(tǒng)表達(dá)ASFV的P72 蛋白作為抗原，制備膠體金標(biāo)記的ASFV 單克隆抗體，建立了非洲豬瘟病毒的膠體金免疫層析方法。王丹等建立了實(shí)時環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(LAMP)和可視化LAMP檢測非洲豬瘟病毒(ASFV)的方法。另外有研究報道通過結(jié)合ASFV lamp檢測技術(shù)和HSV顏色模型轉(zhuǎn)換可以加快ASFV感染的篩選過程。

聚類規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列/CRISPR-associated (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR /Cas)具有準(zhǔn)確識別特定序列的能力，在ASFV的診斷中也得到應(yīng)用。Bai J等報道了一種基于CRISPR/Cas12a的非洲豬瘟現(xiàn)場快速核酸檢測方法。Lu S等報道了一種基于cas12和金納米橫向流動相結(jié)合的便攜式紙診斷法，能夠快速、準(zhǔn)確檢測ASFV，具有較高的特異性和敏感性。Wang X 等建立了結(jié)合CRISPR/Cas12a技術(shù)與免疫層析帶便攜檢測ASFV的方法。

最近研究發(fā)現(xiàn)了基于重組酶的擴(kuò)增檢測技術(shù)(RPA/RAA)也可用于ASFV的檢測。此外，Wozniakowski等最近開發(fā)了一種聚合酶交聯(lián)螺旋反應(yīng)(PCLSR)用于ASFV的檢測，且不與其他豬病原體發(fā)生交叉反應(yīng)。

5 與感染宿主細(xì)胞的相互作用

ASFV感染巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞以及樹突細(xì)胞。ASFV主要通過網(wǎng)格蛋白依賴的內(nèi)吞或者巨胞飲內(nèi)化進(jìn)入其自然感染細(xì)胞，進(jìn)而影響宿主的多項細(xì)胞生物學(xué)行為。ASFV蛋白A238L、A224L、j4R、UBCv等干擾NF-Κb、c-Jun的活性，進(jìn)而影響中宿主細(xì)胞TNF-α、iNOS和COX-2 等基因的轉(zhuǎn)錄過程 。ASFV及其蛋白DP71L、A224L等能夠影響磷酸化以及去磷酸化過程進(jìn)而參與宿主細(xì)胞蛋白合成過程。ASFV可能激發(fā)細(xì)胞早期的凋亡，對病毒感染不利，但其A179L、A224L、DP71R、EP153R等蛋白能夠抑制感染早期的細(xì)胞凋亡。ASFV的感染激發(fā)caspase-12活化為特征的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum)應(yīng)激和未折疊蛋白應(yīng)答(UPR)，影響蛋白合成、蛋白表達(dá)、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等活動，并能夠保留有利于病毒感染復(fù)制的因素，逃避抑制病毒復(fù)制的因素。

ASFV能夠抑制宿主細(xì)胞的抗原遞呈功能，逃逸后續(xù)的免疫應(yīng)答。其衣殼蛋白p72(B646L)、p54(E183L)和p30(CP204L)、膜蛋白p12(O61R)、CD2v(EP402R)等保護(hù)性抗原參與ASFV結(jié)合和內(nèi)化入侵宿主細(xì)胞、病毒膜運(yùn)輸和遷移等過程。A238L、A224L、DP71L、A179L、EP153R、I329L、CD2v等影響細(xì)胞凋亡、宿主基因表達(dá)和抑制淋巴細(xì)胞增殖等進(jìn)而參與病毒的免疫逃逸過程。

研究發(fā)現(xiàn)多個ASFV的多基因家族(multiple gene family,MGF)基因片段如MGF360、MGF505/530相似基因、(MGF360 15R)、MGF506 6/7R和其免疫逃逸基因DP96R(UK)等均能通過降低宿主細(xì)胞內(nèi)干擾素(type I interferon, IFN) 的水平進(jìn)而影響宿主細(xì)胞的抗病毒感染等過程。

6 防控

當(dāng)前，非洲豬瘟在世界上多個國家和地區(qū)發(fā)生和傳播，嚴(yán)重影響?zhàn)B殖業(yè)和社會經(jīng)濟(jì)的持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展。目前研究顯示ASFV的基因組和蛋白的復(fù)雜性較強(qiáng)，疫苗開發(fā)難度較大，還未研發(fā)出安全有效的疫苗和治療藥物，非洲豬瘟的防控主要依賴于快速的現(xiàn)場識別、感染的動物的無害化處理以及實(shí)施嚴(yán)格的生物安全措施。

傳統(tǒng)的滅活疫苗和乙亞胺(BEI)滅活的非洲豬瘟疫苗都不能產(chǎn)生保護(hù)作用。各類減毒活疫苗、亞單位疫苗、DNA載體疫苗、病毒載體疫苗都取得了不同程度的研究成果。特別是p72的原子結(jié)構(gòu)，可以指導(dǎo)抗原表位聚焦免疫原的合理設(shè)計，從而影響ASFV感染疫苗干預(yù)新策略的開發(fā)。Dunn L等發(fā)現(xiàn)利用sncRNA系統(tǒng)的ASFV感染中宿主sncRNA豐度發(fā)生了相對溫和的變化，這一發(fā)現(xiàn)可用于研究更有效的ASFV疫苗 。

除了疫苗之外，目前報道抗ASFV的藥物分為兩類:一類為直接作用于病毒的抑制劑(直接作用抗病毒藥物)，另一類為針對參與ASFV復(fù)制的細(xì)胞因子的抑制劑(宿主靶向抗病毒藥物) 。自1963年第一個抗病毒藥物多氧尿苷類藥物獲得批準(zhǔn)以來，在抗病毒藥物的發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域取得了很大的成就。目前發(fā)現(xiàn)能夠通過抑制病毒復(fù)制的藥物有：核苷類似物、干擾素IFN-gamma、IFN-alpha、利福平、氟喹諾酮類藥物等抗生素、植物源化合物: 染料木黃酮和芫花素、芹黃素、小干擾RNA、針對病毒磷酸蛋白p30基因(CP204 L)的71-78密碼子的CRISPR/Cas9系統(tǒng)等有特定靶點(diǎn)藥物以及沒食子酸月桂酯多酚類植物抗毒素、白藜蘆醇和氧化白藜蘆醇、海洋微藻提取物等無特定靶點(diǎn)的藥物。此外，ASFV蛋白酶有望成為黃酮類化合物抑制ASFV致病性的靶點(diǎn)。利用特異性小干擾RNA(specific small interfering RNAs)感染基因表達(dá)和復(fù)制，將CRISPR-Cas9介導(dǎo)的ASFV p30基因靶向有效抑制ASFV的復(fù)制，也可能是預(yù)防及控制病毒感染的新方向。

生物安全成為非洲豬瘟疫情防控的重要有效手段。一是要建立安全的種群管理制度，養(yǎng)殖場要堅持自繁自養(yǎng)原則，嚴(yán)禁從疫區(qū)引種。二是要做好消毒滅源工作，對養(yǎng)殖場的內(nèi)部以及外部的環(huán)境、外來的車輛、人員進(jìn)行嚴(yán)格的消毒，并做好豬舍及周圍的防蟲滅鼠滅蚊蠅工作，可選用常規(guī)消毒劑如氫氧化鈉、次氯酸鹽、醛類制劑等消毒劑。三是非洲豬瘟病毒通過飼料途徑傳播風(fēng)險較低,但不排除飼料產(chǎn)品受到病毒污染導(dǎo)致帶毒傳播可能性。在生豬的喂養(yǎng)上要全面禁止未經(jīng)處理的餐廚剩余物進(jìn)入到生豬的飼料中。