徐濤 王超

(1河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，河北 張家石 075000；2河北省人民醫(yī)院代謝病重點實驗室)

據(jù)現(xiàn)代研究表明，冠狀動脈粥樣硬化心臟病(CHD) 是由動脈內(nèi)膜脂類物質(zhì)的堆積引起的動脈粥樣病變〔1～3〕。近幾年來，CHD發(fā)病率逐年上升，發(fā)病年齡逐漸呈年輕化〔4〕。研究顯示，炎癥反應(yīng)通過破壞動脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性導(dǎo)致斑塊破裂，進而導(dǎo)致CHD〔5～7〕。MicroRNA在CHD發(fā)病機制中起關(guān)鍵作用。研究〔8～10〕顯示許多MicroRNA分子在調(diào)控糖脂代謝、促進血管炎癥反應(yīng)及平滑肌細(xì)胞增殖方面產(chǎn)生作用。MicroRNA-155作為一個典型多功能的MicroRNA，位于21號染色體上BIC基因的第三個外顯子，此基因可以調(diào)控免疫細(xì)胞和造血細(xì)胞的發(fā)育分化，從而在炎癥和抗體合成等免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用〔11〕。研究發(fā)現(xiàn)，MicroRNA-155能夠通過靶向調(diào)節(jié)細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子(SOCS)1表達，進而產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)作用，此作用在巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)中觀察得到〔12,13〕。本實驗通過研究MicroRNA-155靶向SOCS1基因?qū)HD內(nèi)皮細(xì)胞炎癥損傷的影響，探索CHD的治療方法。

1 材料和方法

1.1動物模型 選取純種SD雄性大鼠24只，鼠齡3～4個月，體重(240±60)g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證號:SCXKC(湘)200900004，動物合格證編號:HNASLKJ20100330。飼養(yǎng)在塑料籠內(nèi)，每籠6只。室內(nèi)溫度25℃，濕度65%，大鼠自行隨意攝取飼料和自來水。飼養(yǎng)1 w適應(yīng)環(huán)境，以降低應(yīng)激反應(yīng)。動物實驗嚴(yán)格遵循《赫爾辛基宣言》。

1.2主要試劑 培養(yǎng)基DMEM購自美國Gibco公司，TRIzol組織提取試劑盒、轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司，質(zhì)粒提取試劑盒購自美國Promega公司，二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度檢測試劑盒購自碧云天，MicroRNA-155 mimics、陰性對照(miR-NC)購自吉瑪公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒A5000購自Promega公司，兔抗SOCS1、GAPDH一抗購自美國Abcam公司，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗兔二抗購自碧云天公司，AerosetTM生物化學(xué)分析儀購自美國亞培公司，Bio-rad Gel Dol EZ成像儀購自美國Bio-rad公司。

1.3病理模型的構(gòu)建及分組 制備冠狀動脈粥樣硬化(AS)模型，分為正常組和AS組各12只。正常組喂養(yǎng)基礎(chǔ)飼料，AS組喂養(yǎng)高脂飼料，并添加維生素D3粉劑。實驗開始時，在大鼠右下肢肌肉注射維生素D3粉針劑，每隔30 d重復(fù)1次。

1.4血脂和血鈣的檢測 實驗3個月后，采集各組大鼠動脈血，檢測血脂和血鈣。檢測正常組和AS組血漿中三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和Ca2+的濃度。

1.5冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定 將動脈組織剪碎，先后加入Ⅱ型膠原酶和胰蛋白酶消化后，加入DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞生長至80%融合，加入胰酶消化細(xì)胞，調(diào)整到適宜的密度后傳代并培養(yǎng)。細(xì)胞使用PBS洗滌后，先后加入一抗和二抗，37℃孵育30 min，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。37℃培養(yǎng)24 h后，使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，

1.6細(xì)胞轉(zhuǎn)染 在大鼠冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞中，加入同型半胱氨酸，共培養(yǎng)24 h，制造CHD模型。設(shè)計促MicroRNA-155表達的靶序列，合成DNA Oligo，制成雙鏈DNA。與雙酶切后的pGCSIL-GFP報告基因載體連接并轉(zhuǎn)化，篩選陽性克隆細(xì)胞，提取質(zhì)粒進行酶切測序。合成MicroRNA-155 mimics、MicroRNA-155 inhibitor及siSOCS1，并用脂質(zhì)體包裝；將脂質(zhì)體加入細(xì)胞培養(yǎng)基中共培養(yǎng)24 h，構(gòu)成空白對照組、陰性對照組、MicroRNA-155過表達(MicroRNA-155 mimics)組、MicroRNA-155抑制(MicroRNA-155 inhibitor)組、SOCS1基因失活(MicroRNA-155 inhibitor+siSOCS1)組。

1.7雙熒光素酶實驗檢測MicroRNA-155與SOCS1的靶向關(guān)系 通過軟件http://www．microrna.org 預(yù)測MicroRNA-155與SOCS1的靶向關(guān)系。合成含MicroRNA-155結(jié)合位點的SOCS1 3′UTR啟動子區(qū)序列，構(gòu)建野生型質(zhì)粒SOCS1 3′UTR-WT和突變型質(zhì)粒SOCS1 3′UTR-MUT。使用Lipofectamine 2000試劑，將SOCS1-3′ UTR-WT和MicroRNA-155 mimic質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染于293T細(xì)胞；同時設(shè)野生型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染陰性對照組(SOCS1-3′UTR-WT+NC)、突變型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染陰性對照組(SOCS1-3′UTR MUT+NC)和突變型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MicroRNA-155 mimic質(zhì)粒組(SOCS1-3′UTR-MUT+MicroRNA-155 mimic)。用熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測熒光強度。

1.8定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測檢測MicroRNA-155、SOCS1 mRNA的表達水平 TRIzol試劑盒提取組織和細(xì)胞總RNA進行，酶標(biāo)儀檢測RNA濃度。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒A5000合成cDNA，按照SYBR方法進行qRT-PCR。MicroRNA-155上游引物：5′-GGAGGTTAATGCTAATTGTGAT-3′，下游：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；SOCS1上游引物：5′-CCGCTCCCACTCCGATTACC-3′，下游：5′-CCGAA GCCATCTTCACGCTGA-3′，U6上游引物：5′-CTCGC TTCGGCAGCA CA-3′，下游：5′-AACGCTTCACGAAT TTGCGT-3′。

1.9Western印跡檢測SOCS1蛋白表達 提取每組大鼠心肌組織和細(xì)胞蛋白，使用BCA試劑盒說明書檢測蛋白濃度后進行電泳。轉(zhuǎn)印到聚偏氟乙烯(PVDF)膜后加入5%牛血清白蛋白(BSA)室溫封閉1 h。加入兔抗鼠SOCS1一抗，孵育4℃過夜；再加羊抗兔二抗室溫孵育2h，ECL液暗室發(fā)光顯影。β-actin 作為內(nèi)參，成像系統(tǒng)采集圖像Image J軟件分析。

1.10細(xì)胞活性檢測 CMEC細(xì)胞懸液按接種于96孔板中，設(shè)6個平行孔/組。待細(xì)胞生長達80%融合后，按之前實驗分組處理細(xì)胞。加入四甲基偶氮唑藍(MTT)液20 μl，置于37℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)4 h，棄去MTT溶液，每孔加入二甲基亞砜150 μl，振蕩10 min后，于490 nm波長處檢測每孔細(xì)胞吸光度值。細(xì)胞存活率=(試驗組吸光度值-空白組吸光度值) /空白組吸光度值×100%。

1.11細(xì)胞凋亡率檢測 將細(xì)胞接種于24孔板中，37℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，使用PBS清洗細(xì)胞，并用多聚甲醛固定。加入Hochest33258工作液染色。在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)：細(xì)胞固縮、濃集且細(xì)胞核變亮為凋亡細(xì)胞。凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.12白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-10、IL-18和IL-1β水平 吸取細(xì)胞培養(yǎng)液，酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-6、IL-10、IL-18和IL-1β濃度。

1.13統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1兩組血清總膽固醇、血脂和血鈣水平 與正常組比較，AS組TC、TG、LDL-C和Ca2+水平均有顯著差異(P<0.05)，而HDL-C水平無顯著差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組血清TC、TG、LDL-C、HDL-C、Ca2+水平

2.2兩組心肌組織中MicroRNA-155和SOCS1 mRNA表達水平 與正常組比較，AS組心肌組織中MicroRNA-155 mRNA水平顯著上升，而SOCS1 mRNA表達水平則顯著下調(diào)(P<0.05)。見表2。

表2 兩組MicroRNA-155與SOCS1 mRNA表達水平

2.3兩組心肌組織中SOCS1蛋白表達水平 Western印跡法檢測結(jié)果顯示，與正常組(1.02±0.08)比較，AS組SOCS1蛋白表達(0.32±0.02)顯著下降(P<0.05)。見圖1。

圖1 兩組SOCS1蛋白表達水平

2.4雙熒光素酶實驗檢測結(jié)果 生物信息網(wǎng)站http://www.microrna.org預(yù)測MicroRNA-155與SOCS1有靶向關(guān)系。見圖2。293T細(xì)胞內(nèi)共轉(zhuǎn)染SOCS1-3′UTR-WT質(zhì)粒和MicroRNA-155 mimics質(zhì)粒。結(jié)果顯示，野生型中，與SOCS1-3′UTR-WT + NC組(1.12±0.13)比較，SOCS1-3′UTR-WT + MicroRNA-155 mimics組熒光素酶活性(0.72±0.08)顯著降低(P<0.05)。在突變型中，與SOCS1-3′UTR-MUT+NC組(1.13±0.15)比較，SOCS1-3′UTR-MUT+MicroRNA-155 mimics組熒光素酶活性(1.18±0.22)無顯著差異(P>0.05)。

圖2 MicroRNA-155靶向調(diào)控SOCS1表達

2.5冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)觀察及鑒定原代 冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)1 d細(xì)胞形態(tài)呈鵝卵石狀；培養(yǎng)5～7 d時，形態(tài)呈多角形或梭形。見圖3。

圖3 冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)(×400)

2.6各組細(xì)胞中MicroRNA-155和SOCS1 mRNA表達水平 qPCR結(jié)果顯示:與空白對照組比較，MicroRNA-155 mimics組中MicroRNA-155表達水平顯著上升，SOCS1 mRNA表達水平顯著下降(P<0.05)；而MicroRNA-155 inhibitor組中MicroRNA-155表達水平顯著下降，SOCS1 mRNA表達水平顯著上升(P<0.05)。空白對照組、陰性對照組和MicroRNA-155 inhibitor+siSOCS1組各指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 MicroRNA-155和SOCS1 mRNA表達水平

2.7各組細(xì)胞中SOCS1蛋白表達水平 Western印跡結(jié)果顯示，與空白對照組(1.01±0.05)比較，MicroRNA-155 mimics組中SOCS1的蛋白表達水平(1.76±0.32)顯著上升；而MicroRNA-155 inhibitor組中SOCS1的蛋白表達水平(0.41±0.04)顯著下降(P<0.05)。空白對照組、陰性對照組(1.06±0.03)和MicroRNA-155 inhibitor + siSOCS1組SOCS1蛋白水平(0.62±0.05)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖4。

1：空白對照組；2：陰性對照組；3：MicroRNA-155 mimics組；4：MicroRNA-155 inhibitor組；5:MicroRNA-155 inhibitor+siSOCS1組；圖5同

2.8各組細(xì)胞活性 MTT法檢測結(jié)果顯示，與空白對照組(0.62±0.04)比較，MicroRNA-155 mimics組細(xì)胞活性(0.38±0.02)顯著下降(P<0.05)；MicroRNA-155 inhibitor組細(xì)胞活性(1.02±0.03)顯著上升(P<0.05)?？瞻讓φ战M、陰性對照組(0.65±0.06)和MicroRNA-155 inhibitor+siSOCS1組細(xì)胞活性(0.72±0.05)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.9細(xì)胞凋亡率檢測 細(xì)胞進行冠心病應(yīng)激后，使用Hochest33258染色，出現(xiàn)細(xì)胞核殘缺、核固縮、染色質(zhì)濃集等凋亡特征。與空白對照組(15.32%±3.28%)比較，MicroRNA-155 mimics組細(xì)胞凋亡率(31.65%±4.12%)顯著升高(P<0.05)；而MicroRNA-155 inhibitor組細(xì)胞凋亡率(8.19%±4.37%)顯著降低(P<0.05)。MicroRNA-155 inhibitor+siSOCS1組的凋亡率(13.29%±2.34%)與空白對照組和陰性對照組(16.61%±3.87%)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖5。

圖5 Hochest33258染色檢測各組細(xì)胞凋亡(×400)

2.10各組細(xì)胞炎癥因子表達水平 與空白對照組和陰性對照組比較，MicroRNA-155mimics組IL-1β、IL-6和IL-18含量顯著上升，而IL-10含量顯著下降(P<0.05)；而MicroRNA-155 inhibitor組中IL-1β、IL-6和IL-18含量顯著下降，IL-10含量顯著上升(P<0.05)?？瞻讓φ战M、陰性對照組和MicroRNA-155 inhibitor+siSOCS1組IL-1β、IL-6、IL-10和IL-18含量無顯著差異(P>0.05)。見表4。

表4 各組細(xì)胞炎癥因子表達水平

3 討 論

現(xiàn)代社會，人們的生活水平逐漸升高，醫(yī)療衛(wèi)生條件也持續(xù)改善，使得人口老齡化加劇，進而導(dǎo)致老年性疾病的發(fā)病率逐年上升，其中最嚴(yán)重的便是AS〔14〕。AS是許多重要血管事件的病理基礎(chǔ)，其造成的心血管疾病在全球發(fā)病率和死亡率中居于首位〔15〕。因而對AS的發(fā)病機制及病理基礎(chǔ)進行深入研究具有重大意義。現(xiàn)代研究表明，免疫炎癥反應(yīng)在AS的發(fā)生及發(fā)展過程中有重要作用。

MicroRNAs是近年來新發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性非編碼RNA分子，普遍存在于真核生物中，通過抑制其標(biāo)靶分子的表達，進而發(fā)揮在腫瘤發(fā)生、免疫炎癥等生命過程中重要的調(diào)節(jié)作用〔16，17〕。MicroRNA-155是與炎癥關(guān)系最為密切的MicroRNAs之一，許多研究發(fā)現(xiàn) MicroRNA-155 在AS病人中呈高表達〔18〕。并且，MicroRNA-155能通過調(diào)控不同的靶標(biāo)分子來調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)攝取，進而在AS中發(fā)揮重要的作用〔19〕。SOCS細(xì)胞產(chǎn)生，包括SOCS1～7，是一種反饋性的負(fù)性調(diào)節(jié)因子。通過阻斷細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)，進而參與人體多種炎性疾病的發(fā)生發(fā)展〔20〕。包括SOCS1在AS的炎癥機制中發(fā)揮著重要作用，研究表明SOCS1可負(fù)性調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞中干擾素(IFN)和Toll樣受體介導(dǎo)反應(yīng)〔21〕：SOCS1缺陷小鼠成纖維細(xì)胞、DC細(xì)胞、巨噬細(xì)胞對脂多糖(LPS)和Toll樣受體配體均高度敏感，促進動脈粥樣硬化斑塊形成〔22〕的炎性細(xì)胞因子，如IL-6、IL-12、腫瘤壞死因子(TNF)-α和IFN-γ的分泌量均增高。

現(xiàn)代研究證明，IL-1β通過結(jié)合IL-1受體1，是重要的炎癥信號之一〔23，24〕。本實驗結(jié)果顯示，MicroRNA-155過表達可抑制冠心病大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞活力，并使細(xì)胞凋亡率上升。因此，MicroRNA-155可靶向抑制SOCS1增加冠心病大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡率。MicroRNA-155通過抑制SOCS1表達，從而促進炎癥因子的表達，使細(xì)胞產(chǎn)生炎癥損傷。

綜上，MicroRNA-155通過靶向抑制SOCS1基因，促進冠心病大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，提高促炎因子IL-1β、IL-6 和IL-18表達，從而大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥損傷。