熊愛華 齊春麗 王欣 呂俊華

(暨南大學(xué) 1藥學(xué)院藥理教研室，廣東 廣州 510632；2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理中心； 3廣東駿豐頻譜股份有限公司)

非酒精性脂肪肝(NAFLD)是以肝細(xì)胞內(nèi)脂肪過度沉積為主要特征的臨床病理綜合征〔1〕。胰島素抵抗和遺傳易感性與其發(fā)生密切相關(guān)，屬于獲得性代謝應(yīng)激性肝損傷疾病。NAFLD的發(fā)展過程可由單純性脂肪變性、肝炎、肝纖維化發(fā)展為肝硬化(ALC)及肝癌(HCC)〔2，3〕。NAFLD全球發(fā)病率約為25%，其中約有1/3發(fā)展為肝炎，約20%進(jìn)展為肝纖維化、肝硬化等終末期肝病。因此，單純改善肝脂肪病變是達(dá)不到理想的防治作用，尋找既能改善肝細(xì)胞炎癥、脂肪變，又能延緩炎癥進(jìn)展及纖維化的干預(yù)手段，才能達(dá)到理想的臨床預(yù)后效果〔4，5〕。紅外線又稱紅外輻射，屬于波長在0.75～1 000.00 μm范圍的一段電磁波，具有改善血液循環(huán)、消炎和鎮(zhèn)痛作用〔6〕。超低頻電磁場處理水(簡稱頻譜水)是將普通飲用水經(jīng)超低頻電磁場處理后，使其物理化學(xué)特性發(fā)生改變的一種特殊處理水〔7〕。頻譜水具有抗氧化、調(diào)節(jié)免疫功能、抗炎及改善胰島素抵抗作用〔8～11〕。本研究探討遠(yuǎn)紅外線照射和頻譜水對(duì)NAFLD動(dòng)物模型的防治保健作用及其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 JF-802頻譜治療儀(廣東駿豐頻譜股份有限公司，紅外頻譜的波長范圍為3～25 μm)；JF-118頻譜水治療儀(廣東駿豐頻譜股份有限公司)；GH3000隔水培養(yǎng)箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；MF41制冰機(jī)(意大利Scotsman公司)；Synergy HT多功能酶標(biāo)儀(美國BioTek公司)；QL-901勻漿機(jī)(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；熒光顯微鏡(日本奧林巴斯公司)，石蠟包埋機(jī)(中國湖北歐美萊醫(yī)療科技有限責(zé)任公司)，手動(dòng)旋轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)(德國Slfe公司)；5424R小型高速冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；MULTIFUGE X1R大型冷凍離心機(jī)(美國Thermo Fisher Scientific公司)；BECMAN全自動(dòng)生化分析儀(美國BECMAN公司)；電子天平(沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司)；電熱恒溫水浴鍋(上海醫(yī)療器械五廠)；Motic Images Plus2.0。

戊巴比妥鈉(廣州市醫(yī)藥公司化學(xué)試劑玻璃儀器批發(fā)部，批號(hào)：200010223)；三酰甘油(TG，批號(hào)：3GJTJVF8NS)、總膽固醇(TC，批號(hào)：BK15CQH411)、腫瘤壞死因子(TNF-α，批號(hào)：WUPHCZZM6H)、白細(xì)胞介素(IL-10，批號(hào)：EMRSSBWWGZ)、IL-18(批號(hào)：5IAFZHU14R)；超氧化物歧化酶(SOD，批號(hào)：VAB5ATD9TW)、丙二醛(MDA，批號(hào)：RPL3UN-9368)、晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs，批號(hào)：IPLNZNM5SM)、瘦素(LEP，批號(hào)：5Y7U5T2IIQ)，以上試劑盒均由武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司提供；低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C，批號(hào)：I23036907)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C，批號(hào)：G05036979)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT，批號(hào)：H30036981)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST，批號(hào)：I10036980)等試劑盒由武漢華美生物工程有限公司提供；游離脂肪酸(FFA，批號(hào)：20190621)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px，批號(hào)：20190619)、考馬斯亮藍(lán)G-250蛋白含量測(cè)定(批號(hào)：20190621)等試劑盒由南京建成生物科技有限公司提供。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與飼料 SPF級(jí)SD大鼠48 只，雌雄各半，體重為(200±20)g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(粵)2017-0174。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于暨南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理中心，實(shí)驗(yàn)室恒溫22℃、相對(duì)濕度為50%～70%，明暗周期均為12 h。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)倫理委員會(huì)審查并批準(zhǔn)，批準(zhǔn)編號(hào)：IACUC-20190104-06。

普通飼料由暨南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理中心提供，高脂高膽固醇飼料由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。高脂高膽固醇飼料：蔗糖20%、豬油15%、膽固醇1.2%、膽酸鈉0.2%、酪氨酸10%、磷酸氫鈣0.6%、石粉0.4%、預(yù)混料0.4%、基礎(chǔ)飼料52%。質(zhì)量比：蛋白質(zhì)19%，脂肪18%，碳水化合物50%。熱量比：蛋白質(zhì)17%，脂肪37%，碳水化合物46%?？偰芰?.4 kCal/g。

1.3頻譜水的制備 將普通飲用水放入JF-118B頻譜水治療儀中進(jìn)行處理，每次3 min，重復(fù)6 次而制成頻譜水，現(xiàn)用現(xiàn)制。

1.4動(dòng)物分組及給藥方法 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，隨機(jī)分為4組，即：正常組、模型組、紅外頻譜組、頻譜水組，每組12 只。正常組食用普通飼料，其余各組參考文獻(xiàn)〔12〕自由食用高脂飼料。正常組和模型組大鼠自由飲用普通水；頻譜水組每天自由飲用頻譜水，不飲普通水；紅外頻譜組每天上午、下午給予紅外頻譜照射(3檔)45 min，自由飲用普通水。動(dòng)物連續(xù)處理12 w后，隨機(jī)取2 只模型組大鼠和2 只正常組大鼠，腹腔注射3%戊巴比妥鈉30 mg/kg麻醉，剖開腹腔，分離出肝臟，肉眼觀察并進(jìn)行肝組織病理學(xué)檢查，肝細(xì)胞出現(xiàn)脂肪病變，則提示造模成功。

1.5血清、肝臟標(biāo)本的采集 大鼠處置前12 h禁食，不禁水，次晨再次給予相應(yīng)的受試物40 min后，稱取大鼠體重，腹腔注射3%戊巴比妥鈉30 mg/kg麻醉，將其仰臥固定于手術(shù)臺(tái)，腹主動(dòng)脈取血，4～8℃冷藏靜置2～3 h后，以離心力3 000 r/min離心15 min后分離血清，分裝，-20℃保存待測(cè)。而后切取全部肝臟和脾臟，用冰凍生理鹽水洗去血污，濾紙吸干，稱重并記錄。肉眼觀察肝臟，若有異常，切取異常部位，若無，切取2 塊基本相同部位的肝組織待做病理及生化測(cè)定。肝臟系數(shù)〔13〕(%)=肝重/大鼠體重×100%；脾臟系數(shù)(%)=脾重/大鼠體重×100%。

1.6血清生化測(cè)定 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定TG、TC、LDL-C、HDL-C、ALT、AST、LEP、TNF-α、IL-10、IL-18的水平；比色法測(cè)定FFA的含量。

1.7肝組織生化測(cè)定 取出肝組織，用冰凍生理鹽水洗去血污，濾紙吸干后，準(zhǔn)確稱取0.5 g肝組織，用冰生理鹽水制成10%勻漿，以7 000 r/min冷凍離心，分離上清液，-20℃保存上清液待測(cè)，WST-1法測(cè)定SOD、TBA法測(cè)定MDA、酶促反應(yīng)法測(cè)定GSH-Px、ELISA測(cè)定AGEs。

1.8肝組織病理 切取有病變的肝組織，若沒有病變，切取基本相同部位的肝組織，用10%甲醛固定72 h后脫水、包埋、切片、制片，進(jìn)行蘇木素-伊紅染色后，光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織病理學(xué)改變。每張肝組織切片光鏡下觀察5 個(gè)視野，進(jìn)行肝臟脂肪變程度和肝臟病理變化程度〔12,13〕評(píng)分，肝臟病理變化程度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)：整齊0分、稍紊亂1分、紊亂2分；水腫無0分、輕度1分、嚴(yán)重2分；細(xì)胞核大而圓0分、大小不一1分、核偏移2分、核消失3分。肝素排列放射狀0分、稍紊亂1分、紊亂2分；無肝內(nèi)脂肪細(xì)胞0分、少見1分、彌漫性2分、融合3分；炎性細(xì)胞無0分、散在1分、較多2分、大量3分。肝細(xì)胞脂肪變程度評(píng)分：0分(<5%)，1分(5%～33%)，2分(34%～66%)，3分(>66%)。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)、單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)、Games-Howell檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組體重比較 模型組第4、8、12周，體重明顯高于正常組(P<0.05)；紅外頻譜組和頻譜水組與模型組比較體重?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表1。

2.2各組肝臟系數(shù)和脾臟系數(shù)比較 模型組肝臟系數(shù)明顯高于正常組(P<0.01)，而脾臟系數(shù)與正常組比較無明顯差異(P>0.05)；紅外頻譜組和頻譜水組肝臟系數(shù)與模型組比較無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組體重、肝臟系數(shù)、脾臟系數(shù)比較

2.3各組血脂和瘦素比較 模型組血清TG、TC、LDL-C和FFA水平明顯高于正常組(P<0.05)，LEP水平高于正常組但未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，HDL-C水平顯著低于正常組(P<0.05)；紅外頻譜組與模型組比較，TG、TC、FFA、LEP水平明顯降低(P<0.05，P<0.01)，LDL-C水平略有降低，HDL-C水平略有升高，但未見明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；頻譜水組與模型組比較，TG、TC、LDL-C、FFA水平明顯降低(P<0.05，P<0.01)，HDL-C水平明顯升高(P<0.05)，LEP水平無明顯變化(P>0.05)。見表2。

表2 各組血脂、FFA、LEP水平比較

2.4各組肝功能比較 模型組AST和ALT水平明顯高于正常組(P<0.05)；紅外頻譜組、頻譜水組AST和 ALT水平均明顯低于模型組(P<0.05，P<0.01)。 見表3。

表3 各組肝功能比較

2.5各組血清炎性因子比較 模型組血清炎性因子中促炎因子TNF-α、IL-18明顯高于正常組(P<0.01，P<0.05)，抗炎因子IL-10水平明顯低于正常組(P<0.05)；紅外頻譜組和頻譜水組與模型組比較，TNF-α水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，IL-18水平明顯降低(P<0.01)，IL-10水平明顯升高(P<0.05，P<0.01)。見表4。

2.6各組肝組織抗氧化作用比較 模型組SOD和GSH-Px活力明顯低于正常組(P<0.05，P<0.01)，而MDA 和AGEs含量明顯高于正常組(P<0.05)；紅外頻譜組和頻譜水組SOD和GSH-Px活力明顯高于模型組(P<0.01，P<0.05)，MDA和AGEs含量均明顯低于模型組(P<0.01)。見表4。

表4 各組肝組織抗氧化作用及血清炎性因子水平比較

2.7紅外頻譜照射和頻譜水對(duì)模型大鼠肝組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

2.7.1光鏡下肝組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化 正常組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)整齊，細(xì)胞核大而圓。肝索呈放射狀排列，肝細(xì)胞內(nèi)未見脂肪細(xì)胞和炎性細(xì)胞。模型組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，細(xì)胞核大小不一，位置偏移或消失，肝索排列紊亂，肝細(xì)胞內(nèi)見大量脂肪細(xì)胞，常見脂肪細(xì)胞融合或呈氣球狀，伴有大量的炎性細(xì)胞。紅外頻譜組和頻譜水組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)比較整齊，偶見紊亂，大部分細(xì)胞核大而圓，偶有細(xì)胞核大小不一，位置偏移或消失。肝索呈放射狀排列，偶見紊亂。肝細(xì)胞內(nèi)可見少量脂肪細(xì)胞，偶有脂肪細(xì)胞融合及少量散在的炎性細(xì)胞，其病理變化程度較模型組有所減輕。見圖1。

圖1 各組肝組織形態(tài)結(jié)構(gòu)(HE染色)

2.7.2肝細(xì)胞病理變化評(píng)分 模型組肝臟病理變化和肝細(xì)胞脂肪變化評(píng)分均明顯大于正常組(P<0.01)；紅外頻譜組和頻譜水組肝臟病理評(píng)分和肝細(xì)胞脂肪變化程度評(píng)分均明顯低于模型組(P<0.01，P<0.05)。見表5。

表5 各組肝細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)比較分)

3 討 論

NAFLD病變的主體是肝小葉，病理上表現(xiàn)為大泡性脂肪變性，伴有小葉性炎癥及肝纖維化形成，多伴有體重增加，血脂異常，血清轉(zhuǎn)氨酶及TNF-α等促炎因子水平的升高〔14～16〕。本實(shí)驗(yàn)高脂飼料飼養(yǎng)12 w后，已經(jīng)形成了大鼠脂肪肝病變及肝臟炎性病理變化。

頻譜水是經(jīng)超低頻電磁場處理后的水，其主要特點(diǎn)是介電常數(shù)提高，水中水分子極化率高，水合后將使蛋白質(zhì)和其他生物大分子的自由能降低，對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、蛋白質(zhì)的折疊和構(gòu)象變化及酶的催化活性均起著重要作用〔7〕；頻譜水穿透細(xì)胞膜的能力明顯增加〔17〕，并具有抗氧化、調(diào)節(jié)免疫功能、抗炎及改善胰島素抵抗作用〔8～11〕。紅外頻譜對(duì)人體皮膚及皮下組織有一定的穿透能力，紅外頻譜能量被組織吸收后主要引起分子動(dòng)能增加，產(chǎn)生熱效應(yīng)，使血管擴(kuò)張，血流加速，可以改善血液循環(huán)，消除炎性介質(zhì)，促進(jìn)滲出物吸收，達(dá)到消腫止痛的輔助治療效果〔6〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，大鼠給予紅外頻譜照射或飲用頻譜水處理12 w后，可明顯改善大鼠血脂水平，并改善異常的肝臟功能。同時(shí)，肝臟病理學(xué)檢查可見，紅外頻譜照射和頻譜水處理可改善模型大鼠肝臟脂肪浸潤和炎性病理損傷的程度，明顯降低肝臟病理和肝細(xì)胞脂肪變化的程度。

NAFLD的病因較多，發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，“多重打擊”學(xué)說可以解釋部分NAFLD的發(fā)病機(jī)制：第一次打擊主要是肥胖、2型糖尿病、高脂血癥等伴隨的胰島素抵抗，引起肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過量沉積；第二次打擊是脂質(zhì)過量沉積的肝細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致線粒體功能障礙、炎癥因子產(chǎn)生，肝星狀細(xì)胞的激活，從而產(chǎn)生肝細(xì)胞的炎癥、壞死〔18〕。氧化應(yīng)激與脂質(zhì)過氧化損傷在NAFLD的發(fā)生與發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，糖基化終產(chǎn)物及其受體可激活氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)〔19〕；IL-18與胰島素抵抗的產(chǎn)生關(guān)系密切，同時(shí)又是介導(dǎo)肝臟損傷的重要誘導(dǎo)因子；IL-10是一種具有免疫調(diào)節(jié)作用的抗炎因子，在肝臟脂肪變性、胰島素抵抗、炎癥反應(yīng)和肝纖維化等病理過程中發(fā)揮保護(hù)作用〔20，21〕。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，紅外頻譜照射和飲用頻譜水處理對(duì)NAFLD大鼠具有保肝作用，可能與其提高大鼠機(jī)體抗氧化能力，減少促炎因子生成和增加抗炎因子的生成有關(guān)。

綜上所述，紅外頻譜照射和飲用頻譜水處理，均可預(yù)防性降低NAFLD大鼠血脂水平，改善其肝臟功能，提高肝臟組織抗氧化能力，調(diào)節(jié)肝臟炎性因子水平，改善肝臟脂肪病變及炎性病變程度，對(duì)高脂飲食誘致的大鼠脂肪肝具有較好的保護(hù)作用。