余瑛 張群貴 崔華子 廖振蓉 王琪 彭濤

(贛州市腫瘤醫(yī)院，江西 贛州 341000)

宮頸癌病灶發(fā)生于子宮頸鱗柱上皮的交界處，該病是當(dāng)今女性最?；嫉膵D科腫瘤性疾病，也是臨床數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)總結(jié)出的危害女性生命安全的前列危險(xiǎn)因素〔1〕。臨床數(shù)據(jù)提示：宮頸癌在中國(guó)的發(fā)病率有逐漸升高的趨勢(shì)，且伴有大概率的不良預(yù)后事件發(fā)生〔2～4〕。癌細(xì)胞的共同特點(diǎn)在于增殖失控及侵襲遷移能力較機(jī)體正常細(xì)胞顯著增強(qiáng)，而細(xì)胞凋亡與其增殖的相互配合關(guān)系到機(jī)體微環(huán)境穩(wěn)態(tài)〔5〕，癌細(xì)胞周期不僅影響到癌細(xì)胞增殖，對(duì)癌細(xì)胞凋亡也有重要意義。人參為傳統(tǒng)名貴中草藥，古來(lái)有滋補(bǔ)元?dú)狻采褚嬷羌梆B(yǎng)生之功效〔6～8〕，研究證明人參皂苷Rg3是中藥人參中的主要活性成分，且其養(yǎng)生功效與抗腫瘤作用關(guān)系密切〔9～11〕。本研究從腫瘤細(xì)胞角度分析人參皂苷Rg3對(duì)宮頸癌細(xì)胞的殺傷抑制作用。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料 人宮頸癌Hela細(xì)胞株(武漢博士德生物工程有限公司)、胎牛血清(澳洲Gibco)、青霉素、鏈霉素(華北制藥股份有限公司)、人參皂苷Rg3(天津阿爾塔科技有限公司)、二甲基亞砜(美國(guó)OriGen)、Bio-red550酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀(上海達(dá)邁生物科技有限公司)、Transwell聚碳酸酯微孔膜、蘇木精染液(廈門研科生物科技有限公司)、電子顯微鏡(上海蒼茂實(shí)業(yè)有限公司)等。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及藥品配制 將宮頸癌Hela細(xì)胞培養(yǎng)于室溫條件下的基礎(chǔ)培養(yǎng)液(含10%胎牛血清、適量青霉素、鏈霉素)中，培養(yǎng)箱5%的CO2濃度及飽和濕度。人參皂苷Rg3首先進(jìn)行甘醇溶解，試驗(yàn)時(shí)通過(guò)基礎(chǔ)培養(yǎng)液稀釋至甘醇濃度低于0.01%。

1.3噻唑藍(lán)(MTT)檢測(cè)細(xì)胞增殖 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期宮頸癌Hela細(xì)胞加入96孔板，試驗(yàn)組分別加入稀釋后的人參皂苷Rg3，并使藥物終濃度至20、40、50、160、320、400 μg/ml，每組設(shè)置平行孔3個(gè)，對(duì)照組不加藥物培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后，各組加入MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h。結(jié)束培養(yǎng)后，移除上清液，每孔分別加入二甲基亞砜(DMSO)震蕩至沉淀溶解酶標(biāo)儀測(cè)490 nm處OD值，計(jì)算腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，取3次重復(fù)試驗(yàn)均值。以抑制率和人參皂苷Rg3濃度做曲線算IC50。生長(zhǎng)抑制率(%)=(對(duì)照組OD值-試驗(yàn)組OD值)/對(duì)照組OD值×100%。

1.4流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期變化 通過(guò)MTT法檢測(cè)出人參皂苷Rg3抑制Hela細(xì)胞生長(zhǎng)有效濃度，將對(duì)應(yīng)組Hela細(xì)胞用濃度為65%的乙醇進(jìn)行固定并保存。檢測(cè)前用磷酸鹽緩沖液(PBS)進(jìn)行洗滌，滴入PI染液避光保存30 min于流式細(xì)胞儀檢測(cè)癌細(xì)胞的周期變化。

1.5Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 培養(yǎng)48 h后，收集各組腫瘤細(xì)胞于無(wú)血清培養(yǎng)液多次洗滌計(jì)數(shù)，每孔110個(gè)細(xì)胞接種 Transwell聚碳酸酯微孔膜，下室以完全培養(yǎng)基為趨化因子，顯微鏡觀察進(jìn)入下室的癌細(xì)胞數(shù)，PBS 洗滌后甲醇溶液進(jìn)行固定再進(jìn)行蘇木素染色，顯微鏡下觀察，取隨機(jī)3個(gè)視野穿過(guò)細(xì)胞數(shù)的均值評(píng)估癌細(xì)胞遷移能力。

1.6Boyden 檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 將液態(tài)基質(zhì)膠與無(wú)血清培養(yǎng)基混合后加入Transwell聚碳酸酯微孔膜，37℃放置5 h成為固態(tài)。各組細(xì)胞通過(guò)無(wú)血清培養(yǎng)液洗滌后以每孔110個(gè)細(xì)胞接種于固態(tài)基質(zhì)膠上，余下步驟同1.5。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行直線回歸及Pearson分析、q檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1人參皂苷對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖的影響 試驗(yàn)組宮頸癌細(xì)胞增殖抑制率較對(duì)照組均顯著上升(P<0.05)；試驗(yàn)組宮頸癌細(xì)胞的增殖抑制率隨人參皂苷Rg3濃度增大而升高，藥物濃度與癌細(xì)胞增殖抑制率正向相關(guān)性(R>0，P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制情況

2.2人參皂苷對(duì)宮頸癌細(xì)胞周期的影響 160 μg/ml人參皂苷Rg3組和對(duì)照組G0-G1期宮頸癌細(xì)胞比例無(wú)明顯差異(P>0.05)；160 μg/ml人參皂苷Rg3組S期宮頸癌細(xì)胞比例較對(duì)照組顯著上升(P<0.05)；160 μg/ml人參皂苷Rg3組G2/M期宮頸癌細(xì)胞比較對(duì)照組顯著下降(P<0.05)。兩組癌細(xì)胞凋亡率差異顯著(P<0.05)。見(jiàn)表2，圖1。

表2 人參皂苷Rg3對(duì)宮頸癌細(xì)胞周期的影響

圖1 兩組宮頸癌細(xì)胞周期和凋亡

2.3人參皂苷對(duì)宮頸癌細(xì)胞遷移能力的影響 對(duì)照組癌細(xì)胞過(guò)膜個(gè)數(shù)〔(115.33±21.56)個(gè)〕較160 μg/ml人參皂苷Rg3組〔(35.23±7.34)個(gè)〕顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 兩組宮頸癌細(xì)胞遷移能力(蘇木素染色，×200)

2.4人參皂苷對(duì)宮頸癌細(xì)胞侵襲能力的影響 對(duì)照組宮頸癌細(xì)胞穿膜個(gè)數(shù)〔(90.37±12.59)個(gè)〕顯著高于160 μg/ml人參皂苷Rg3組〔(29.37±6.45)個(gè)；P<0.05〕。見(jiàn)圖3。

圖3 兩組宮頸癌細(xì)胞侵襲能力(蘇木素染色，×200)

3 討 論

我國(guó)宮頸癌高發(fā)年齡為50歲左右〔12〕。就當(dāng)前情況而言，臨床多采用手術(shù)及放化療的治療手段來(lái)應(yīng)對(duì)該類疾病，由于腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程迅速，一旦宮頸癌進(jìn)入晚期確診，這對(duì)臨床治療方案的制定和實(shí)施都是一個(gè)挑戰(zhàn)〔13〕。因?yàn)槟[瘤疾病的晚期化療方案需要加大放射的劑量，這一舉措在有效殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，對(duì)機(jī)體正常細(xì)胞也會(huì)帶來(lái)巨大損害，使患者預(yù)后情況不佳〔14～16〕。天然中藥材富含的各種有效成分被投入臨床的研究和用藥，其優(yōu)勢(shì)于治療宮頸癌中日益突出〔17～19〕。人參皂苷作為中藥人參的有效成分有緩解機(jī)體疲勞、抑制腫瘤疾病及增強(qiáng)人體免疫力的功效，研究表明，人參皂苷Rg3是中藥人參中抗腫瘤作用效果較佳的單體成分〔20，21〕。

本試驗(yàn)提示人參皂苷Rg3是通過(guò)阻礙宮頸癌細(xì)胞的DNA合成使癌細(xì)胞滯留在分裂期之前，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡。人參皂苷Rg3能夠通過(guò)阻礙癌細(xì)胞侵襲其他正常體細(xì)胞控制宮頸癌疾病。

綜上，人參皂苷Rg3能夠通過(guò)抑制人宮頸癌細(xì)胞的增殖，影響腫瘤細(xì)胞周期促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制人宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲等惡性生物學(xué)功能來(lái)阻止宮頸癌發(fā)展。