何松林 肖宗位 丁偉浩 高珂 山地普 毛龍 王文憑

(1成都市第二人民醫(yī)院胸外科，四川 成都 610011；2四川大學(xué)華西醫(yī)院胸外科)

食管癌是臨床上最常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率和死亡率都位居前列，其中我國(guó)食管癌每年的新發(fā)病例占據(jù)世界新發(fā)病例的一半以上，死亡率則高居世界榜首〔1〕。多數(shù)食管癌患者在發(fā)現(xiàn)時(shí)就已進(jìn)展到晚期，總體5年生存率只有20%左右〔2〕，因此，深入闡明食管癌的發(fā)病機(jī)制對(duì)其早期診斷、靶向治療和預(yù)后評(píng)估具有重要意義。微小RNA(miRNA)是真核生物中廣泛存在的一種長(zhǎng)度18～23個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分子單鏈RNA，成熟的miRNA通過(guò)與其靶基因的3′非翻譯區(qū)以完全或不完全配對(duì)的方式，來(lái)降解其靶基因或抑制其轉(zhuǎn)錄后翻譯，在細(xì)胞的發(fā)育、增殖、分化及凋亡中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用〔3,4〕。miR-206位于人類(lèi)第6號(hào)染色體，研究顯示，miR-206可與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白(STAT)3、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(MET)、肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白復(fù)合物(ARPC)3、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)等多種細(xì)胞周期、分裂和凋亡調(diào)節(jié)相關(guān)基因結(jié)合，與肺癌、肝癌、乳腺癌、胃癌等多種腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)〔5,6〕。本研究旨在探究miR-206對(duì)食管癌細(xì)胞增殖和遷移的影響及其作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng) 人正常食管上皮細(xì)胞HEEC和人食管癌細(xì)胞株EC9706、TE-1、ECA109(美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù))采用RPMI1640完全培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco，含10%胎牛血清和100 U/ml青鏈霉素)培養(yǎng)于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。細(xì)胞培養(yǎng)至密度超過(guò)90%后用0.25%胰蛋白酶消化并傳代。

1.2RT-PCR檢測(cè)miR-206表達(dá) 收集對(duì)數(shù)期HEEC、EC9706、TE-1和ECA109細(xì)胞1×106個(gè)，采用RNA小量提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒〔天根生化科技(北京)有限公司〕提取細(xì)胞總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)miR-206和內(nèi)參U6的核苷酸序列設(shè)計(jì)RT-PCR引物： miR-206-正義鏈：5′-GCTTCCCGAGGCCACATGC-3′，miR-206反義鏈：5′-CACTTGCCGAAACCACAC-3′；U6正義鏈：5′-GCTCGCTTCGGCAGCACA-3′，U6-反義鏈：5′-TATGGAACGCTTCACGAA-3′。根據(jù)RT-PCR試劑盒(美國(guó)Thermo Fisher Scientific)說(shuō)明書(shū)配制反應(yīng)體系，在熒光定量PCR儀上設(shè)置反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后采用2-ΔΔCt法分析miR-206的mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.3miR-206過(guò)表達(dá)細(xì)胞系構(gòu)建 對(duì)數(shù)期293T細(xì)胞胰酶消化后接種到6孔板，培養(yǎng)細(xì)胞密度至70%，分別將plent-GFP-NC慢病毒載體和plent-GFP-miR-206慢病毒過(guò)表達(dá)載體(山東維真生物科技有限公司)與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)293T細(xì)胞，6 h后更換新鮮培養(yǎng)基。48 h和72 h后分別收集細(xì)胞培養(yǎng)上清并混合，0.22 μmol/L濾器過(guò)濾，測(cè)量病毒滴度。人食管癌細(xì)胞EC9706培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，胰酶消化后接種到6孔板，培養(yǎng)至細(xì)胞密度為70%。將收集的GFP-NC和GFP-miR-206慢病毒上清分別加入到EC9706細(xì)胞中。感染48 h后加入濃度為1 μg/ml的嘌呤霉素，持續(xù)篩選7 d直至熒光顯微鏡下所有細(xì)胞均表達(dá)綠色熒光。RT-PCR驗(yàn)證細(xì)胞miR-206表達(dá)水平以確認(rèn)過(guò)表達(dá)細(xì)胞系構(gòu)建成功，分別命名為GFP-NC組和GFP-miR-206組細(xì)胞。

1.4雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 將野生型趨化因子受體(CXCR)4(CXCR4-WT)和缺失miR-206結(jié)合區(qū)域的突變體CXCR4(CXCR4-Mut)基因采用分子克隆方法分別構(gòu)建到熒光素酶報(bào)告載體(山東維真生物科技有限公司)上。對(duì)數(shù)期的GFP-NC和GFP-miR-206細(xì)胞胰酶消化后接種到6孔板，培養(yǎng)至細(xì)胞密度70%時(shí)，分別轉(zhuǎn)染CXCR4-WT和CXCR4-Mut熒光素酶報(bào)告載體。轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)檢測(cè)各組細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性。

1.5CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè) 將野生型CXCR4采用分子克隆方法構(gòu)建到pcDNA3真核表達(dá)載體，將pcDNA3-CXCR4過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染GFP-miR-206細(xì)胞系，即為GFP-miR-206/CXCR4-OE組。轉(zhuǎn)染24 h后，胰酶消化GFP-NC、GFP-miR-206 和GFP-miR-206/CXCR4-OE組細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞密度至2×105個(gè)/ml。分別取100 μl GFP-NC、GFP-miR-206 和GFP-miR-206/CXCR4-OE組細(xì)胞懸液接種到96孔板，并于接種后第24、48和72小時(shí)向各組細(xì)胞加入10 μl CCK-8溶液(碧云天生物技術(shù)公司)，繼續(xù)孵育4 h。酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處吸光度值。

1.6Transwell細(xì)胞遷移檢測(cè) 對(duì)數(shù)期GFP-NC、GFP-miR-206 和GFP-miR-206/CXCR4-OE組細(xì)胞胰酶消化，并重懸細(xì)胞密度至5×105個(gè)/ml，分別取100 μl細(xì)胞懸液接種到預(yù)鋪基質(zhì)膠的transwell上室(美國(guó)Corning公司)，下室加入500 μl完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，每次5 min。甲醇固定20 min后，棉簽輕輕擦拭上室未遷移的細(xì)胞，1%結(jié)晶紫染色5 min，PBS洗滌3次。室溫干燥后顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野觀察細(xì)胞遷移情況。

1.7Western印跡 收集GFP-NC、GFP-miR-206 和GFP-miR-206/CXCR4-OE組對(duì)數(shù)期細(xì)胞各1×106個(gè)，PBS洗1次，加入200 μl 細(xì)胞裂解液，4℃冰上裂解30 min。14 000 r/min離心15 min，取上清加入5×十二烷基硫酸鈉(SDS)蛋白上樣緩沖液，沸水浴煮沸10 min。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，轉(zhuǎn)膜，5%牛血清白蛋白(BSA)室溫封閉1 h。加入封閉液稀釋的CXCR4抗體(1∶1 000，英國(guó)Abcam)、EGFR抗體(1∶2 000，英國(guó)Abcam)和VEGF(1∶2 000，英國(guó)Abcam)，4℃孵育過(guò)夜。磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)洗3次。加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(1∶5 000，碧云天生物技術(shù)公司)，室溫孵育2 h，PBST洗3次，蛋白凝膠成像儀顯影。采用Quantity One凝膠分析軟件分析蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1miR-206表達(dá)水平比較 HEEC、EC9706、TE-1和ECA109細(xì)胞中miR-206的mRNA相對(duì)表達(dá)水平分別為1.72±0.13、0.36±0.04、0.51±0.06和0.40±0.04，與HEEC細(xì)胞比較，EC9706、TE-1和ECA109細(xì)胞中miR-206的mRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。

2.2miR-206和CXCR4靶向關(guān)系驗(yàn)證 生物信息學(xué)分析顯示miR-206可與CXCR4的3′-UTR區(qū)靶向結(jié)合，提示CXCR4可能是miR-206的下游靶向基因。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果表明，與GFP-NC細(xì)胞(1.85±0.15)比較，轉(zhuǎn)染CXCR4-WT的GFP-miR-206細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性(0.31±0.04)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；轉(zhuǎn)染CXCR4-Mut的GFP-NC細(xì)胞(1.77±0.14)和GFP-miR-206細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性(1.72±0.16)則無(wú)顯著差異(P>0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1 生物信息學(xué)分析miR-206和CXCR4的靶向關(guān)系

2.3miR-206表達(dá)對(duì)食管癌細(xì)胞增殖的影響 與GFP-NC組比較，GFP-miR-206組24 h、48 h和72 h的增殖活力顯著下降(P<0.05)；與GFP-miR-206組比較，GFP-miR-206/CXCR4-OE組24 h、48 h和72 h的增殖活力明顯回升(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 miR-206表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖活力的影響

2.4miR-206表達(dá)對(duì)食管癌癌細(xì)胞遷移的影響 與GFP-NC組〔(94.04±7.75)個(gè)〕比較，GFP-miR-206組遷移細(xì)胞數(shù)〔(35.11±93.28)個(gè)〕顯著下降(P<0.05)；與GFP-miR-206組比較，GFP-miR-206/CXCR4-OE組的遷移細(xì)胞數(shù)〔(74.88±6.84)個(gè)〕明顯回升(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

圖2 miR-206表達(dá)對(duì)細(xì)胞遷移的影響(結(jié)晶紫染色，×400)

2.5miR-206對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)、VEGF表達(dá)的影響 CXCR4在GFP-NC、GFP-miR-206和GFP-miR-206/CXCR4-OE組細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)水平分別為1.36±0.10、0.45±0.06和1.52±0.14；EGFR的相對(duì)表達(dá)水平分別為1.52±0.12、0.47±0.05和1.08±0.09；VEGF的相對(duì)表達(dá)水平分別為1.47±0.12、0.30±0.04和1.11±0.11。與GFP-NC組細(xì)胞比較，GFP-miR-206組細(xì)胞EGFR和VEGF的蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與GFP-miR-206組細(xì)胞比較，GFP-miR-206/CXCR4-OE組細(xì)胞EGFR和VEGF的蛋白表達(dá)顯著上升(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

1～3:GFP-NC組，GFP-miR-206組，GFP-miR-206/CXCR4-OE組

3 討 論

miR-206廣泛存在于機(jī)體多種組織、器官和細(xì)胞中，在正常生理狀態(tài)下呈高表達(dá)，而在大部分腫瘤組織中呈低表達(dá)，并與腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及血管生成的發(fā)生密切相關(guān)〔7〕。但miR-206在食管癌細(xì)胞中的表達(dá)和作用機(jī)制尚不清楚。本研究結(jié)果表明miR-206的異常表達(dá)在食管癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。

CXCR4作為一種高度保守的七次跨膜G蛋白耦聯(lián)受體(GPCRs)，可通過(guò)與其配體基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(SDF-1/CXCL12a)等的結(jié)合，激活下游絲氨酸/蘇氨酸激酶(AKT)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)1/2、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)等多條信號(hào)通路，在細(xì)胞骨架重排、肌動(dòng)蛋白調(diào)動(dòng)、細(xì)胞間信息傳遞、炎癥細(xì)胞遷移、黏附及腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的生理病理功能〔8，9〕。研究顯示，CXCR4在乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、黑色素瘤等數(shù)十種癌癥中高表達(dá)，在腫瘤的生長(zhǎng)、器官特異性轉(zhuǎn)移及腫瘤免疫抑制中發(fā)揮關(guān)鍵作用〔10，11〕。此外，CXCR4在食管癌組織中高表達(dá)，并與腫瘤組織浸潤(rùn)程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)〔12〕。生物信息學(xué)和雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示CXCR4是miR-206的下游靶向基因，表明miR-206可能通過(guò)調(diào)控CXCR4表達(dá)進(jìn)而改變食管癌細(xì)胞生物行為學(xué)。

細(xì)胞增殖和細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明，與對(duì)照食管癌細(xì)胞比較，miR-206過(guò)表達(dá)后，細(xì)胞的增殖和遷移能力下降，而在miR-206過(guò)表達(dá)細(xì)胞中重新過(guò)表達(dá)CXCR4后，細(xì)胞的增殖和遷移能力又出現(xiàn)明顯的回升，表明miR-206可通過(guò)反向下調(diào)CXCR4的表達(dá)促進(jìn)食管癌細(xì)胞的增殖和遷移。

研究表明VEGF是一種在惡性腫瘤中高表達(dá)的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，在腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移、黏附及血管形成等發(fā)明起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，而VEGF的上述調(diào)節(jié)功能與CXCR4的表達(dá)密切相關(guān)〔13〕。Liang等〔14〕的研究證明SDF-1/CXCR4通過(guò)促進(jìn)Akt的磷酸化，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞中VEGF的表達(dá)。EGFR作為細(xì)胞膜表面的表皮生長(zhǎng)因子受體，可與表皮生長(zhǎng)因子(EGF)結(jié)合激活下游一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，調(diào)控細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)和凋亡，并與腫瘤的形成和發(fā)展密切相關(guān)〔15〕。研究顯示，Porcile等〔16〕的研究顯示CXCR4可通過(guò)刺激EGFR的磷酸化，激活ERK1/2和Akt等細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，進(jìn)而參與卵巢癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果表明miR-206可通過(guò)CXCR4調(diào)控EGFR和VEGF的表達(dá)，并在食管癌細(xì)胞的增殖和遷移中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，miR-206可通過(guò)靶向CXCR4抑下調(diào)EGFR和VEGF的表達(dá)和活化，抑制食管癌細(xì)胞的增殖和遷移，有望為食管癌的臨床診療和預(yù)后評(píng)估開(kāi)辟新的思路。