金紅 齊泰煜 樊帥 李光英 錢家坤 謝雨虹 張琪 高美云 高敏香 張敏,4

(長春中醫(yī)藥大學(xué) 1中醫(yī)學(xué)院，吉林 長春 130017；2針灸推拿學(xué)院；3附屬醫(yī)院腦病中心神志門診；4附屬醫(yī)院針灸臨床中心)

抑郁癥以顯著而持久的心境低落為臨床特征，為疾病負(fù)擔(dān)最重的精神疾病〔1〕。目前西藥抗抑郁譜窄、易復(fù)發(fā)等缺陷〔2〕、抗抑郁藥物研發(fā)進(jìn)展緩慢。督脈和足太陽經(jīng)被選擇頻率最高〔3〕，但在辨證治療上經(jīng)絡(luò)辨證和臟腑辨證分庭抗禮。通督調(diào)臟針法源自《黃帝內(nèi)經(jīng)》中督主神志、五神臟理論和長白山通經(jīng)調(diào)臟手法流派的經(jīng)絡(luò)-臟腑相關(guān)理論，以百會(huì)、印堂、五臟俞為主穴，以臟腑-經(jīng)絡(luò)結(jié)合辨證為特點(diǎn)，前期研究發(fā)現(xiàn)其能改善抑郁、焦慮等核心及周邊癥狀，起效速度快于五羥色胺再攝取抑制劑(SSRIs)藥物〔4〕，并在實(shí)驗(yàn)中明確了百會(huì)、印堂的抗抑郁療效和作用機(jī)制〔5〕，但還需利用現(xiàn)代生物工程技術(shù)對通督調(diào)臟針法進(jìn)行深入研究。

定量蛋白質(zhì)組學(xué)為分子分析、生物標(biāo)志物識(shí)別、探索發(fā)病機(jī)制的重要方法，其整體性、系統(tǒng)性、綜合性與中醫(yī)臟腑-經(jīng)絡(luò)辨證相符，應(yīng)用4D Label free定量蛋白質(zhì)組學(xué)檢測技術(shù)發(fā)現(xiàn)針刺可通過保護(hù)海馬突觸和線粒體功能改善發(fā)揮抗抑郁作用〔6〕，相關(guān)差異蛋白可能為疾病診斷和治療的新靶點(diǎn)〔7〕。但目前尚無督脈聯(lián)合五臟俞抗抑郁的蛋白質(zhì)組學(xué)研究。慢性不可預(yù)見性應(yīng)激抑郁模型(CUMS)在行為學(xué)表現(xiàn)、生化及神經(jīng)病理改變上與臨床變化高度相似，為最有效和最常用的抑郁模型〔8〕。海馬為情緒產(chǎn)生和調(diào)節(jié)的重要腦區(qū)，其神經(jīng)元丟失、蛋白改變被認(rèn)為與抑郁癥關(guān)系密切〔9〕。本研究探討通督調(diào)臟針法對CUMS大鼠海馬組織蛋白表達(dá)的影響及可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 由長春中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，健康SPF級(jí)SD雄性大鼠(4周齡)27只，體重180～220 g，飼養(yǎng)溫度23～25℃，濕度50%～60%，自然節(jié)律光照，自由進(jìn)食進(jìn)水，適應(yīng)飼養(yǎng)1 w，飼養(yǎng)環(huán)境清潔。該實(shí)驗(yàn)已通過長春中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查(批準(zhǔn)編號(hào)：2020336)，全程遵守《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》中相關(guān)規(guī)定。將動(dòng)物隨機(jī)分為正常組、模型組、針刺組，每組9只，進(jìn)行行為學(xué)數(shù)據(jù)分析，各組隨機(jī)選取3只進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)檢測。

1.2主要試劑和儀器 蛋白酶抑制劑(德國Merck Millipore)、胰蛋白酶(美國Promega)、二硫蘇糖醇、碘乙酰胺、甲酸(美國Fluka)、尿素(美國Sigma-Aldrich)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。乙腈、Bruker timsTOF Pro質(zhì)譜儀(德國Bruker)、Orbitrap ExplorisTM480高分辨質(zhì)譜儀EASY-nLC 1 200超高效液相系統(tǒng)、Q Exactive系統(tǒng)(美國ThermoFisher Scientific)。

1.3針具和其他材料 一次性不銹鋼毫針(規(guī)格：0.25 mm×25 mm，貴州安迪藥械有限公司)、無菌棉簽、75%消毒酒精。其他器材：離心管、醫(yī)用橡皮管、自制游泳池(61 cm×35.5 cm×43 cm)、華佗牌電針儀(SDZ-II，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)等。

1.4大鼠CUMS模型制備 造模方法參照Willner等〔10〕方法建立CUMS抑郁模型，造模各組孤養(yǎng)并每日隨機(jī)給予以下刺激的一種：斷食24 h、斷水24 h、晝夜顛倒24 h、夾尾3 min、束縛3 h、10℃冷水游泳5 min、潮濕墊料24 h，共21 d。

1.5各組干預(yù)方法 將SD大鼠隨機(jī)分成空白組、模型組、針刺組，每組9只。空白組正常群養(yǎng)，每日給予等量純凈水；模型組慢性不可預(yù)見性應(yīng)激結(jié)合孤養(yǎng)，每日給予等量純凈水。針刺組慢性不可預(yù)見性應(yīng)激結(jié)合孤養(yǎng)，于造模24 h后開始“通督調(diào)臟”針法治療，穴位參照全國針灸學(xué)會(huì)實(shí)驗(yàn)針灸研究會(huì)制定的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物針灸穴位圖譜，選取相當(dāng)于人體解剖部位的百會(huì)、印堂、心俞、肝俞、脾俞、肺俞、腎俞。大鼠固定于鼠臺(tái)上，取穴消毒后毫針平刺百會(huì)、印堂7.5 ～12.5 mm，施平補(bǔ)平瀉法，選用華佗牌SDZ-Ⅱ型電子針治療儀，連接百會(huì)、印堂，疏密波，頻率2 Hz/15 Hz，強(qiáng)度為 0.1～1.0 mA，電流強(qiáng)度以針身微微顫動(dòng)為度；針刺雙側(cè)心俞、肝俞、脾俞、肺俞、腎俞，斜刺7.5～12.5 mm，留針30 min，中間提插捻轉(zhuǎn)1次，1次/d，7 d為1個(gè)療程，共3個(gè)療程。

1.6行為學(xué)干預(yù)

1.6.1強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn) 游泳池為長方形水池，長61 cm，高35.5 cm，寬43 cm，水深25 cm，水溫控制在(25±1)℃。測試時(shí)捏住大鼠尾巴距根部2/3 處將大鼠緩慢放入游泳池內(nèi)，測定大鼠5 min內(nèi)四爪均不動(dòng)行為的累計(jì)時(shí)間，每只大鼠測定1次，在實(shí)驗(yàn)第1天、第21天進(jìn)行測試。

1.6.2糖水消耗實(shí)驗(yàn) 大鼠斷水24 h，測1 h內(nèi)蔗糖水?dāng)z入量(即測試前后瓶中水量之差)。給予1%蔗糖水，糖水與瓶的重量共計(jì)250 g，計(jì)算大鼠1 h飲用前后的總重量之差。分別在實(shí)驗(yàn)的第1天和第21天測定。

1.7蛋白質(zhì)組學(xué)檢測

1.7.1海馬組織蛋白提取 21 d后，大鼠斷頸處死，冰臺(tái)上迅速分離出海馬組織，記錄編號(hào)后液氮速凍，-80℃冰箱保存。各組選取3個(gè)有明顯表型變化大鼠的海馬樣本，至液氮預(yù)冷的研缽中，加液氮充分研磨至粉末。各組樣品分別加入粉末4倍體積裂解緩沖液(8 mol/L尿素，1%蛋白酶抑制劑)，超聲裂解。4℃，12 000 r/min離心10 min，去除細(xì)胞碎片，上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管，利用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測定。

1.7.2胰酶酶解 各樣品蛋白取等量進(jìn)行酶解，用裂解液將體積調(diào)整至一致。緩慢加入終濃度20%三氯乙酸(TCA)，渦旋混勻，4℃沉淀2 h。4 500 r/min，離心5 min，棄上清，用預(yù)冷的丙酮洗滌沉淀2～3次。晾干沉淀后加入終濃度200 mmol/L的四乙基溴化銨(TEAB)，超聲打散沉淀，以1∶50的比例加入胰蛋白酶，酶解過夜。加入二硫蘇糖醇(DTT)使其終濃度為5 mmol/L，56℃還原30 min。之后加入碘乙酰胺(IAA)使其終濃度為11 mmol/L，室溫避光孵育15 min。

1.7.3液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)分析 肽段用液相色譜流動(dòng)相A相溶解后使用EASY-nLC 1 200超高效液相系統(tǒng)進(jìn)行分離。肽段經(jīng)由超高效液相系統(tǒng)分離后被注入Capillary離子源中進(jìn)行電離然后進(jìn)Orbitrap ExplorisTM480質(zhì)譜進(jìn)行分析。離子源電壓設(shè)置為1.6 kV，肽段母離子及其二級(jí)碎片都使用高分辨的TOF進(jìn)行檢測和分析。二級(jí)質(zhì)譜掃描范圍設(shè)置為100～1 700。數(shù)據(jù)采集模式使用平行累積串行碎裂(PASEF)模式。一張一級(jí)質(zhì)譜采集后進(jìn)行10次PASEF模式采集母離子電荷數(shù)在0～5范圍內(nèi)的二級(jí)譜圖，串聯(lián)質(zhì)譜掃描的動(dòng)態(tài)排除時(shí)間設(shè)置為20 s避免母離子的重復(fù)掃描。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

1.8.1行為學(xué) 采用SSPS26.0軟件，組間比較符合方差齊性檢驗(yàn)采用單因素方差分析，方差不齊采用H檢驗(yàn)；組內(nèi)比較差值符合正態(tài)性分布采用配對樣本t檢驗(yàn)，偏態(tài)分布采用符號(hào)秩和檢驗(yàn)。

1.8.2蛋白鑒定和定量 通過質(zhì)譜分析得到樣本的肽段質(zhì)量和信號(hào)強(qiáng)度(一級(jí)譜)、肽段碎裂后碎片離子的質(zhì)量和信號(hào)強(qiáng)度(二級(jí)譜)，使用Proteome Discoverer(v2.4.1.15)數(shù)據(jù)庫將蛋白序列構(gòu)建的理論二級(jí)譜圖數(shù)與質(zhì)譜分析得到的二級(jí)譜圖數(shù)比對，共鑒定到5 913個(gè)蛋白質(zhì)，根據(jù)蛋白特異性肽段和蛋白質(zhì)數(shù)總體情況及肽段在不同樣本中的信號(hào)強(qiáng)度值等信息計(jì)算蛋白相對定量值，使用Pearson相關(guān)性統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行評估蛋白定量的重復(fù)性。

1.8.3差異蛋白篩選和生物信息學(xué)分析 將每個(gè)蛋白在兩個(gè)比較樣品中的相對定量值進(jìn)行t檢驗(yàn)，差異蛋白表達(dá)量變化超過1.5倍和小于1/1.5作為顯著上調(diào)和下調(diào)的變化閾值。篩選出的差異蛋白采用基因本論(GO)、KEGG通路和亞細(xì)胞定位等方法進(jìn)行功能注釋和富集、聚類分析，3組差異蛋白富集分析使用Fisher精確檢驗(yàn)，以觀察差異表達(dá)蛋白在不同功能類型中的富集趨勢和功能的相關(guān)性；根據(jù)數(shù)據(jù)庫編號(hào)或蛋白序列，通過STRING(v.11.0)蛋白網(wǎng)絡(luò)互作數(shù)據(jù)庫觀察差異蛋白互作關(guān)系。

2 結(jié) 果

2.1行為學(xué)結(jié)果 各組體重均有上升，7 d時(shí)模型組體重明顯低于空白組(P<0.000 1)，模型組與針刺組相比體重變化不明顯；與模型組相比，針刺組在治療14 d時(shí)體重顯著上升(P<0.001)，并在21 d時(shí)具有極顯著差異(P<0.000 1)，但與空白組相比仍具有極顯著差異(P<0.000 1)。強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中，21 d時(shí)，與空白組相比，模型組不動(dòng)時(shí)間明顯增加(P<0.000 1)；針刺組不動(dòng)時(shí)間明顯低于模型組(P<0.000 1)，但與空白組相比仍具有顯著差異(P<0.01)。糖水消耗實(shí)驗(yàn)中，21 d時(shí)，空白組、針刺組糖水消耗量明顯增加，模型組變化不明顯；模型組糖水消耗量顯著低于空白組(P<0.000 1)，針刺組糖水消耗量顯著多于模型組(P<0.000 1)，但與空白組相比仍具有顯著差異(P<0.01)，見表1。

表1 各組體重變化、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)及糖水消耗實(shí)驗(yàn)的比較

2.2生物學(xué)重復(fù)檢驗(yàn) 隨機(jī)從空白組、模型組、針刺組中各選取3個(gè)樣本，共9個(gè)樣本進(jìn)行3組3次生物學(xué)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，3組Pearson系數(shù)經(jīng)3次重復(fù)后數(shù)值均>0.950。見圖1。

Pearson系數(shù)越接近-1為負(fù)相關(guān)，越接近1為正相關(guān)，越接近0為正相關(guān)

2.3差異蛋白鑒定 共鑒定到39個(gè)差異蛋白(閾值為1.5倍)，上調(diào)蛋白19個(gè)，下調(diào)蛋白20個(gè)；其中模型組相比空白組有10個(gè)上調(diào)蛋白(Mrps24、Rdh13、Bbs2、Tex2、Dmxl1、Snap29、Rlbp1、Afg1l、Cpped1、Cbx3)，12個(gè)下調(diào)蛋白(Cds1、Ighm、Arhgef6、Vtn、Slc12a9、Slco1c1、Cyp51a1、Plekhd1、Cib1、Pdf、Zfp512、C1qc)；針刺組相比模型組有9個(gè)上調(diào)蛋白(Clcc1、Sdf2、rCG_52671、Pdf、Tmem254、Gpr37、Scd2、Ttyh2、Ddx46)，8個(gè)下調(diào)蛋白(Coq8a、Ik、Specc1l、Phf5a、Ptn、Prpf40a、Bloc1s1、Cdk5rap3)，見圖2、表2。

圖2 差異蛋白火山圖

表2 差異蛋白變化

2.4GO富集分析 針刺組/模型組的差異蛋白主要參與補(bǔ)體激活、調(diào)控炎癥反應(yīng)等生物學(xué)過程，并在補(bǔ)體激活、體液免疫應(yīng)答反應(yīng)、細(xì)胞投射組裝上具有極顯著的富集趨勢(P<0.01)；與針刺組/模型組的差異蛋白主要參與細(xì)胞周期相關(guān)調(diào)控、RNA代謝等生物學(xué)過程，并在細(xì)胞周期過程的調(diào)控中表現(xiàn)出極顯著的富集趨勢(P<0.01)，見圖3。

圖3 差異蛋白生物學(xué)過程GO富集

2.5聚類分析 根據(jù)富集分析得到的富集檢驗(yàn)P值使用分層聚類法將不同組相關(guān)功能聯(lián)合繪制為熱圖，與空白組相比較，模型組蛋白在生物學(xué)過程上主要參與蛋白質(zhì)活化調(diào)節(jié)、補(bǔ)體激活、炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)等；與模型組相比較，針刺組蛋白主要參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、RNA代謝過程、細(xì)胞形態(tài)調(diào)節(jié)等。KEGG聚類分析結(jié)果顯示模型組參與補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)激活過程，針刺組參與基因剪接過程，見圖4。

2.6PRM對目標(biāo)蛋白定量分析 基于GO注釋及KEGG富集分析結(jié)果，選擇了D-多巴色素互變異構(gòu)酶(Ddt)、Snap29、C1qc、Vtn、Cpped1、Phf5a、Prpf40a、Cdk5rap3、Bbs2、Afg11、Sdf2、Specc1l、Cnrip1等一系列與神經(jīng)遞質(zhì)合成及補(bǔ)體激活等密切相關(guān)的蛋白質(zhì)進(jìn)行PRM蛋白定量分析。結(jié)果顯示：與4D Label-free 結(jié)果一致的是，大鼠海馬中的Ddt蛋白在模型組下調(diào)，而在針刺組上調(diào)，Cnrip1蛋白在模型組上調(diào)，而在針刺組下調(diào)。此外，通過PRM未能識(shí)別到Snap29、C1qc、Vtn、Cpped1、Phf5a、Prpf40a、Cdk5rap3、Bbs2、Afg11、Sdf2、Specc1l等蛋白的表達(dá)。

3 討 論

抑郁癥發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，額葉、丘腦邊緣系統(tǒng)等形成的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)發(fā)生神經(jīng)和細(xì)胞活動(dòng)改變與抑郁癥密切相關(guān)，其中海馬區(qū)域神經(jīng)元的萎縮和凋亡在抑郁癥發(fā)病中起重要作用，故常通過海馬組織理化變化作為觀察和評價(jià)抗抑郁療效的有效指標(biāo)。本研究表明，針刺可糾正相關(guān)蛋白的異常表達(dá)來發(fā)揮抗抑郁作用；生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)共有18個(gè)差異蛋白參與了30種生物學(xué)過程，涉及神經(jīng)遞質(zhì)代謝、神經(jīng)元自噬、補(bǔ)體激活、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期調(diào)控、線粒體代謝等。本研究表明通督調(diào)臟針法在改善絕望情緒和快感缺失癥狀上有明顯療效。研究者的前期研究已發(fā)現(xiàn)電針百會(huì)、印堂可通過拮抗CUMS大鼠海馬各亞區(qū)蛋白激酶(PK)A、環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件蛋白(CREB)信號(hào)降低改善行為學(xué)癥狀〔11〕，且能修復(fù)五羥色胺(5-HT)系統(tǒng)缺陷進(jìn)而增加腦和突觸間隙內(nèi)的5-HT含量，達(dá)到與5-HT再攝取抑制劑(SSRIs)類藥物相同的藥理作用〔14〕，已有研究表明針刺五臟俞后的抗抑郁療效與SSRIs藥物相當(dāng)，副作用低且穩(wěn)定〔12〕，提示通督調(diào)臟針法具有明確的療效和科學(xué)依據(jù)。

在PRM驗(yàn)證中得到的Ddt是一種蛋白質(zhì)編碼基因，是具有趨化因子樣特征的細(xì)胞因子。Ddt是巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(MIF)蛋白超家族的成員，其基因在序列、酶活性和基因結(jié)構(gòu)方面與MIF相關(guān)，且兩者具有相似的互變異構(gòu)酶活性及生物相似性〔13〕。MIF與多種疾病相關(guān)，在阿爾茨海默病等精神疾病中起重要作用，同時(shí)MIF的保護(hù)作用和病理作用又與抑郁癥有關(guān)，研究表明MIF可能通過神經(jīng)內(nèi)分泌以及免疫炎癥參與抑郁癥的發(fā)生、發(fā)展過程〔14〕。只有Ddt基因是唯一與MIF具有同源性的基因，且與MIF共同定位于22號(hào)染色體，在22號(hào)染色體上緊密相連〔15〕，筆者推測，Ddt可能和MIF有著一樣的作用路線，即在神經(jīng)內(nèi)分泌機(jī)制調(diào)節(jié)方面，由分泌促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)的垂體細(xì)胞分泌和產(chǎn)生醛固酮、糖皮質(zhì)激素(GC)的腎上腺皮質(zhì)的上皮細(xì)胞表達(dá)，當(dāng)機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸激活，外周血中ACTH、GC水平升高，從而對宿主發(fā)揮保護(hù)作用，此時(shí)HPA軸的激活導(dǎo)致Ddt大量產(chǎn)生，并釋放到血液循環(huán)中。本次研究中，通督調(diào)臟針刺后，CUMS大鼠的Ddt過表達(dá)，會(huì)正向影響黑色素合成，可能與MIF產(chǎn)生相同的作用，從而干擾多巴胺和5-HT等神經(jīng)遞質(zhì)代謝，影響抑郁發(fā)生、發(fā)展。神經(jīng)元自噬的過度激活或抑制可影響神經(jīng)突觸的傳遞過程而介導(dǎo)抑郁癥的發(fā)生。CUMS模型可引起海馬神經(jīng)元發(fā)生自噬，Snap29通過形成SNARE復(fù)合體參與細(xì)胞自噬，其過表達(dá)可抑制突觸傳遞過程〔16〕，這一發(fā)現(xiàn)與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符，據(jù)此可推測通督調(diào)臟針法可通過降低Snap29的表達(dá)解除受抑制的突觸傳遞過程而發(fā)揮抗抑郁作用。補(bǔ)體經(jīng)典激活途徑與抑郁癥存在明顯富集關(guān)系，通過 GO分析發(fā)現(xiàn)這些差異蛋白主要參與了補(bǔ)體激活、體液免疫反應(yīng)、蛋白質(zhì)活化級(jí)聯(lián)、蛋白質(zhì)成熟及炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)。有研究表明， C1q和C3定位于未成熟的突觸，C3與小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的補(bǔ)體蛋白C3a受體(C3aR)結(jié)合，在無功能的網(wǎng)狀突觸的發(fā)育修剪方面起了重要作用〔17〕。而抑郁模型小鼠杏仁核內(nèi)發(fā)生神經(jīng)炎癥，膠質(zhì)細(xì)胞激活，表達(dá)補(bǔ)體C1q、C3，進(jìn)一步激活小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞修剪突觸，導(dǎo)致突觸含量降低，促使小鼠產(chǎn)生抑郁樣行為〔18〕。本研究表明，針刺可通過調(diào)節(jié)補(bǔ)體激活途徑的蛋白表達(dá)抑制神經(jīng)炎癥，發(fā)揮抗抑郁作用。

磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號(hào)通路是近年來研究抗抑郁作用機(jī)制的重要通路之一〔19〕，PI3K通過磷酸化下游核心蛋白Akt進(jìn)而啟動(dòng)下游分子的表達(dá)，抑制細(xì)胞自噬和細(xì)胞凋亡。CUMS大鼠體內(nèi)PI3K/Akt通路活性被抑制，而Cpped1通過去磷酸化Akt抑制其活性，加重細(xì)胞凋亡〔20〕，本實(shí)驗(yàn)表明，針刺能夠通過降低Cpped1表達(dá)解除對Akt的抑制，減少CUMS大鼠的細(xì)胞凋亡。此外，本研究發(fā)現(xiàn)Prpf40a、Cdk5rap3廣泛參與細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞周期相變等多個(gè)生物學(xué)過程，Prpf40a在針刺后的表達(dá)量發(fā)生顯著下調(diào)，已有研究表明Prpf突變可導(dǎo)致細(xì)胞周期中前mRNA的積累和G1/S轉(zhuǎn)換受損〔21〕，Prpf40a和Prpf屬于同源家族，故推測CUMS大鼠受損細(xì)胞周期在針刺后得到修復(fù)。細(xì)胞周期素蛋白依賴性激酶(Cdk)5活性與應(yīng)激相關(guān)疾病存在關(guān)聯(lián)〔22〕，并作為細(xì)胞周期抑制劑抑制異常細(xì)胞進(jìn)入，但需要相關(guān)調(diào)節(jié)亞基激活其活性，Cdk5rap3為Cdk5調(diào)節(jié)亞基相關(guān)蛋白，本研究中針刺后的Cdk5rap3由上調(diào)轉(zhuǎn)為下調(diào)， Cdk5rap3過表達(dá)意味著抑郁癥發(fā)生中存在大量的異常細(xì)胞周期，而其表達(dá)下調(diào)可作為觀察抗抑郁作用發(fā)揮的有效表征。

線粒體能量代謝失?？蓪?dǎo)致活性氧(ROS)增加，加劇氧化應(yīng)激反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。同時(shí)線粒體為神經(jīng)突觸可塑性的重要細(xì)胞器，電針后突觸和線粒體蛋白發(fā)生顯著變化，提示電針通過保護(hù)海馬突觸和線粒體功能改善大鼠的抗抑郁性能。本研究中，Bbs2、Afg1l、Specc1l和Sdf2的亞細(xì)胞定位于線粒體，Bbs2、Afg1l、Specc1l針刺后表達(dá)量顯著降低，Sdf2針刺后表達(dá)呈上升趨勢，盡管目前尚無以上蛋白與抑郁癥線粒體代謝失常的明確證據(jù)，突觸與線粒體在電針干預(yù)中的靶向關(guān)系亦尚不明確，但這些蛋白可能是通過參與氧化磷酸化過程，降低ROS數(shù)量，修復(fù)發(fā)生斷裂的氧化電子呼吸鏈，進(jìn)而調(diào)控突觸可塑性。綜上，通督調(diào)臟針法可能通過干擾神經(jīng)遞質(zhì)代謝、調(diào)節(jié)突觸傳遞過程、抑制神經(jīng)炎癥，從而保護(hù)海馬神經(jīng)元免受損傷，進(jìn)而發(fā)揮抗抑郁作用。

本實(shí)驗(yàn)還有許多不足之處，如對Ddt蛋白的文獻(xiàn)報(bào)道較少，需進(jìn)行針對性研究才可進(jìn)一步挖掘其抗抑郁途徑；再者Bbs2、Afg1l、Specc1l等蛋白在抑郁癥的發(fā)生、發(fā)展過程中的作用，也尚未完全清楚，對這些關(guān)鍵蛋白的深入研究和基因敲除將是我們下一步的研究方向。同時(shí)，聯(lián)合組學(xué)技術(shù)和靜息態(tài)功能磁共振成像(fMRI)技術(shù)開展經(jīng)穴特異性研究，觀察臟腑辨證和經(jīng)絡(luò)辨證結(jié)合下穴位個(gè)體之間、穴位與經(jīng)絡(luò)之間的蛋白表達(dá)差異，構(gòu)建臟腑-經(jīng)絡(luò)-經(jīng)穴-分子的針刺抗抑郁本體理論體系，將是循證醫(yī)學(xué)體系下針刺現(xiàn)代化研究的新走向。