杜美玲 王曉元 李會賢 李方江 張愛愛

(河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，河北 張家口 075400)

糖尿病是一種以長期高血糖為特征的代謝性疾病，隨著人們生活水平和飲食習(xí)慣的改變，其發(fā)病率呈不斷上升趨勢，已成為21世紀(jì)全球最嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一〔1,2〕。人體異常的葡萄糖水平可導(dǎo)致多種嚴(yán)重并發(fā)癥，其中糖尿病心肌病是糖尿病的心血管并發(fā)癥，也是糖尿病致死致殘的主要原因〔3〕。研究表明〔4,5〕，高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡是糖尿病心肌病發(fā)生和發(fā)展的重要因素。

環(huán)狀RNA(circRNA)是一類具有閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的非編碼RNA〔6〕。近年來多項(xiàng)研究表明〔7～9〕，circRNA在糖尿病及其并發(fā)癥中發(fā)揮重要調(diào)控作用。如房遠(yuǎn)等報道〔10〕，circ_0031739在糖尿病患者血清和高糖處理的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中均出現(xiàn)高表達(dá)，提示circ_0031739可能參與了糖尿病的病理機(jī)制。但目前circRNA在高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡中的作用及機(jī)制鮮有報道。本研究探討circ_0031739在高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷中的作用及其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1主要材料和儀器 DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)；青鏈霉素混合液(北京索萊寶科技有限公司)；葡萄糖(北京索萊寶科技有限公司)；Trizol試劑(美國Invitrogen公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(中國Takara公司)；CCK8試劑(美國Sigma公司)；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/磺化丙啶(Annexin V-FITC/PI)雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司)；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；ABI 7500型定量PCR儀(美國ABI公司)；HBS-1101酶標(biāo)分析儀(南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；FACSCanto Ⅱ型流式細(xì)胞儀(美國BD公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 人心肌細(xì)胞系A(chǔ)C16購自美國 Millipore公司。細(xì)胞接種于含有1%青霉素和鏈霉素、12%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，放入37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 對數(shù)生長其的AC16細(xì)胞分為以下組別，即為對照組：用含有5.5 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)；高糖+si-NC組、高糖+si-circ#1組、高糖+si-circ#2組、高糖+miR-NC組、高糖+miR-98-5p組、高糖+si-circ#1+anti-miR-NC組、高糖+si-circ#1+anti-miR-98-5p組：使用Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑分別將小干擾RNA(siRNA)陰性對照、circ-0031739 siRNA#1、circ-0031739 siRNA#2、miRNAmimics、miR-98-5pmimics及circ-0031739 siRNA#1+miRNAinhibitor、circ-0031739 siRNA#1+miR-98-5p inhibitor轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后，用含30 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。

1.3.2實(shí)時熒光定量PCR(qRT-PCR)實(shí)驗(yàn) 收集各組生長至對數(shù)期的細(xì)胞，采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測RNA濃度和質(zhì)量，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR，程序：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)。qRT-PCR用circ_0031739、miR-98-5p、U6、GAPDH引物由廣州銳博生物科技有限公司合成。結(jié)果采用2-△△Ct法計(jì)算circ_0031739、miR-98-5p的相對表達(dá)水平。

1.3.3CCK8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖活性 收集各組生長至對數(shù)期的細(xì)胞，消化后制成濃度為1×105/ml的單細(xì)胞懸液，以每孔200 μl接種于96孔板中，每組細(xì)胞設(shè)置5個重復(fù)孔，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，吸除孔內(nèi)培養(yǎng)液，分別加入含5.5 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)液或含30 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。然后向每孔加入10 μl CCK8溶液，孵育4 h。使用酶標(biāo)儀檢測每孔在450 nm處的吸光度(OD)值。

1.3.4流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 收集處理后的各組細(xì)胞，消化并制成濃度為1×105ml的單細(xì)胞懸液，離心，PBS沖洗細(xì)胞。參照Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書，加入1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，然后分別加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，混勻，避光反應(yīng)20 min。1 h內(nèi)使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.3.5雙熒光素酶實(shí)驗(yàn) 通過circBank網(wǎng)站預(yù)測到circ_0031739與miR-98-5p具有結(jié)合位點(diǎn)。將含有miR-98-5p結(jié)合位點(diǎn)的circ_0031739片段及突變片段克隆到熒光素酶報告載體，分別命名為circ_0031739-WT、circ_0031739-MUT，然后分別與miR-NC、miR-98-5p共轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后，使用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測細(xì)胞中熒光素酶活性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行LSD-t檢驗(yàn)、方差分析。

2 結(jié) 果

2.1circ_0031739在高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中高表達(dá) 與對照組比較，高糖組心肌細(xì)胞中circ_0031739相對表達(dá)量明顯升高(1.00±0.06 vs 3.22±0.42，P<0.05)。

2.2抑制circ_0031739對高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞增殖和凋亡的影響 與對照組和si-NC組比較，高糖+si-circ#1組和高糖+si-circ#2組心肌細(xì)胞中circ_0031739的相對表達(dá)量明顯減少(1.00±0.05、1.00±0.03 vs 0.31±0.05，1.00±0.05、1.00±0.03 vs 0.49±0.08，P<0.05)，高糖+si-circ#1的抑制效率最佳，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組比較，24、48、72 h時高糖組心肌細(xì)胞的增殖活性明顯降低(P<0.05)；與高糖+si-NC組比較，48、72 h時高糖+si-circ#1組心肌細(xì)胞的增殖活性明顯升高(P<0.05)。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示，與對照組比較，高糖組心肌細(xì)胞的凋亡率明顯升高(P<0.05)；與高糖+si-NC組比較，高糖+si-circ#1組心肌細(xì)胞的凋亡率明顯降低(P<0.05)。見圖1和表1。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果

表1 抑制circ_0031739對高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

2.3circ_0031739靶向結(jié)合miR-98-5p 通過circBank網(wǎng)站預(yù)測到circ_0031739與miR-98-5p具有靶向結(jié)合位點(diǎn)，見圖2。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果，circ_0031739 WT和miR-98-5p共轉(zhuǎn)染的心肌細(xì)胞中熒光素酶活性明顯降低(P<0.05)，見表2。qRT-PCR結(jié)果顯示，與對照組和si-NC組比較，si-circ#1組心肌細(xì)胞中miR-98-5p相對表達(dá)水平明顯升高(1.00±0.09、1.00±0.12 vs 3.41±0.34，P<0.05)。

圖2 circ_0031739與miR-98-5p的靶向結(jié)合位點(diǎn)

表2 雙熒光素酶活性檢測結(jié)果

2.4過表達(dá)miR-98-5p對高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞增殖和凋亡的影響 qRT-PCR結(jié)果顯示，與對照組比較，高糖組心肌細(xì)胞中miR-98-5p相對表達(dá)量明顯降低(1.00±0.06 vs 0.49±0.07，P<0.05)。miR-98-5p過表達(dá)效率檢測結(jié)果，與空白組和miR-NC組比較，miR-98-5p組心肌細(xì)胞中miR-98-5p相對表達(dá)量明顯升高(1.00±0.10、1.00±0.13 vs 5.63±0.69，P<0.05)。CCK8和流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞增殖活力和凋亡率，與對照組比較，48、72 h時高糖組心肌細(xì)胞增殖活性明顯降低，細(xì)胞凋亡率明顯升高(均P<0.05)；與高糖+miR-NC組比較，48、72 h時高糖+miR-98-5p組心肌細(xì)胞增殖活性明顯增強(qiáng)，凋亡率明顯降低(均P<0.05)。見圖3和表3。

表3 過表達(dá)miR-98-5p對高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

圖3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果

2.5抑制miR-98-5p逆轉(zhuǎn)抑制circ_0031739對高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞增殖和凋亡的保護(hù)作用 與空白組和anti-NC組比較，anti-miR-98-5p組心肌細(xì)胞中miR-98-5p相對表達(dá)量明顯降低(1.00±0.06、1.00±0.04 vs 0.39±0.07，P<0.05)。CCK8實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞增殖活性和凋亡率，與高糖+si-NC組比較，24、48、72 h時高糖+si-circ#1組心肌細(xì)胞增殖活性明顯升高，細(xì)胞凋亡率明顯降低(均P<0.05)；與高糖+ si-circ#1+anti-miR-NC組比較，高糖+ si-circ#1+anti-miR-98-5p組細(xì)胞24、48、72 h時增殖活性明顯降低，細(xì)胞凋亡率明顯升高(均P<0.05)。見圖4和表4。

圖4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果

表4 抑制miR-98-5p逆轉(zhuǎn)circ_0031739的作用

3 討 論

糖尿病心肌病主要病理特征是心肌細(xì)胞凋亡、心肌纖維化、代謝紊亂及微血管病變等〔11〕。心肌細(xì)胞凋亡與心血管疾病的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)，牟嬌等〔12〕通過腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)構(gòu)建糖尿病大鼠模型，發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠構(gòu)建成功第4周，大鼠心肌細(xì)胞凋亡明顯增加，且隨著糖尿病形成時間的延長，心肌細(xì)胞凋亡逐漸加重，說明心肌細(xì)胞凋亡參與糖尿病心肌病的發(fā)展過程。Zhang等〔13〕研究發(fā)現(xiàn)高糖可以激活心肌細(xì)胞內(nèi)源性和外源性凋亡通路，誘導(dǎo)乳鼠心肌細(xì)胞凋亡。提示高糖可通過多種途徑誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，進(jìn)而參與糖尿病心肌病的進(jìn)展。

circRNA多位于細(xì)胞質(zhì)中，具有穩(wěn)定性、保守性、組織特異性等特性，已被發(fā)現(xiàn)在糖尿病、心血管疾病及神經(jīng)系統(tǒng)疾病等多種疾病的發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮重要調(diào)控作用〔14～16〕。Zhou等〔17〕研究發(fā)現(xiàn)circ_010567在糖尿病小鼠心肌和心臟成纖維細(xì)胞中均顯著上調(diào)，功能實(shí)驗(yàn)證實(shí)敲除circ_010567能夠抑制小鼠心肌纖維化。Li等〔18〕研究發(fā)現(xiàn)circNCX1在缺氧再灌注刺激的心肌細(xì)胞中高表達(dá)，促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡，而心肌缺血再灌注小鼠的心肌細(xì)胞和心臟組織中circNCX1表達(dá)的降低可減輕心肌細(xì)胞凋亡和缺血再灌注損傷。本研究結(jié)果說明circ_0031739高表達(dá)參與高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡過程，敲除circ_0031739則能夠減弱高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖，對心肌細(xì)胞起保護(hù)作用。circRNA的功能研究表明〔19，20〕，circRNA分子富含microRNA(miRNA)結(jié)合位點(diǎn)，在細(xì)胞中主要作為miRNA的海綿起作用。miRNA是一類長約22個核苷酸的非編碼小分子RNA，在機(jī)體各種組織和器官中廣泛表達(dá)，參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的生理和病理過程〔21〕。李祖霞等〔22〕研究表明，高糖可誘導(dǎo)小鼠心肌細(xì)胞中miR-26a和miR-197表達(dá)升高，干擾miR-26a和miR-197可通過調(diào)節(jié)MCL1基因表達(dá)，促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞增殖活力，降低細(xì)胞凋亡率。miR-98被報道在缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷中表達(dá)降低，而姜黃素可通過上調(diào)miR-98減輕缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷〔23〕。此外，有研究表明〔24，25〕，miR-98在心肌炎和心肌梗死中表達(dá)降低，參與調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞凋亡。

本研究證實(shí)抑制circ_0031739能夠上調(diào)細(xì)胞中miR-98-5p的表達(dá)。進(jìn)一步功能實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-98-5p能夠增強(qiáng)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞增殖活性，減少細(xì)胞凋亡，而將miR-98-5p inhibitor和circ_0031739 siRNA共轉(zhuǎn)染細(xì)胞后， circ_0031739對高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的保護(hù)作用減弱或消失，說明抑制circ_0031739對高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的保護(hù)作用是通過上調(diào)miR-98-5p實(shí)現(xiàn)的。