張 霞，張靈芝，張鈺琦，郭 娟，丁玉琴

（中南林業(yè)科技大學食品科學與工程學院，湖南 長沙 410004）

魚糜制品因具有營養(yǎng)豐富、低脂、高蛋白等特點而深受消費者的歡迎，是我國重要的水產品加工品種。魚糜通常在冷凍條件下進行貯藏和流通，但是凍藏會引起魚糜蛋白質的主要組分——肌原纖維蛋白冷凍變性，如巰基含量和Ca2+-ATPase 活性下降、表面疏水性增加和蛋白質發(fā)生交聯(lián)聚集等，從而使魚糜凝膠形成能力和持水性降低[1-2]。抗凍劑添加后會使得凍藏過程中魚糜中的冰晶生長被抑制，增強蛋白質的結構穩(wěn)定性，從而達到減緩魚糜冷凍變性的效果[3]。4%蔗糖和4%山梨醇混合物是有效的魚糜商業(yè)抗凍劑，但其有高甜度、高熱量的缺陷，不符合健康綠色生活的需求趨勢[4-5]，因此，尋找“低糖、低熱量”的高效冷凍保護劑是冷凍魚糜領域備受關注的研究方向之一。

目前國內外已開展了抗凍蛋白、磷酸鹽、海藻糖、酚類、殼聚糖等多種新型魚糜抗凍劑的研究[6-7]。海藻糖雖具有甜度值和熱量值低的特點，但有研究表明流行病艱難梭菌的爆發(fā)頻率和嚴重性的增加與海藻糖的廣泛使用相關聯(lián)，因而其使用存在潛在危險[8]；抗凍蛋白雖然抗凍效果好，但是其獲取方式主要來自于自然生物或者基因工程，其安全性有待進一步研究[9-10]；很多天然酚類物質帶有顏色，使用后會對食品感官品質造成不良影響[11]。因此，有必要開發(fā)新型的綠色抗凍劑。

刺云實膠（Tara gum，簡稱TG），又稱為刺云豆膠、塔拉膠，由直鏈（1→4）-β-D-吡喃型甘露糖單元與α-D-吡喃型半乳糖單元通過（1→6）鍵聚合而成，具有良好的熱穩(wěn)定性和化學穩(wěn)定性[12]。我國于2006 年4 月批準了刺云實膠作為食品添加劑，其在肉制品中的最大使用量為10.0 g/kg[13]。在冰淇淋中加入刺云實膠后，刺云實膠中半乳糖單元內含有的羥基可與大量游離水結合形成氫鍵，減少游離水含量，進而減小冰淇淋中冰晶的顆粒，使冰淇淋能夠保持良好的質地[12]。然而，刺云實膠在肌原纖維蛋白中的抗凍性及其機制的研究鮮有報道。

因此，本研究以草魚肌原纖維蛋白作為研究對象，以傳統(tǒng)商業(yè)抗凍劑（4%蔗糖+4%山梨醇）為對照，研究刺云實膠對肌原纖維蛋白的冷凍保護作用，旨在為刺云實膠在魚類抗凍保鮮中的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮活草魚 購于步步高超市，尾重約為1.50±0.5 kg；刺云實膠 食品級，購于紹興欣柏貿易有限公司；5-腺苷三磷酸二鈉鹽（5’-ATP，Na2）、1-苯胺基-8-奈基磺酸鹽（1,8-ANS） 均為分析純，購于上海源葉生物有限公司；山梨醇 分析純，購于北京索萊寶科技有限公司；蔗糖 分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司；5-5’-二硫代雙-硝基苯甲酸（DTNB） 分析純，購于上海瑞永生物科技有限公司。

MS105DU 分析天平 梅特勒儀器（上海）生產有限公司；BD-159WVUT 低溫冰箱 海信集團有限公司；TGL-20M 離心機 湘儀離心機廠；NMI20 核磁共振成像分析儀 上海紐邁電子有限公司；F95S熒光分光光度計 上海棱光技術有限公司；UV-2660紫外-可見光分光光度計 日本島津公司；EL20 pH 計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 肌原纖維蛋白及其溶液的制備 參考Benjakul等[14]的方法并略作改進。將草魚宰殺、去頭、去皮、去內臟，采肉。將新鮮的草魚魚肉攪碎，加入10 倍（W/V）冷的Tris-maleate 緩沖液（50 mmol/L KCl-20 mmol/L Tris-maleate，pH7.0），充分混勻，于4 ℃下10000×g離心13 min，隨后除去上清液，重復上述操作兩次。隨后加入3 倍（W/V）Tris-maleate 緩沖液（0.6 mol/L KCl-20 mmol/L Tris-maleate，pH7.0），放入4 ℃冰箱提取60 min。4 ℃，10000×g 冷凍離心15 min，離心后所得上清液即為肌原纖維蛋白溶液，加入10 倍體積冷去離子水，將蛋白沉淀，4 ℃，10000×g 離心15 min，沉淀是肌原纖維蛋白。用上述高濃度緩沖液溶解所得肌原纖維蛋白，并用0.6 mol/L 的NaCl 調整其濃度為40 mg/mL。

1.2.2 肌原纖維蛋白溶液的凍藏 分別向肌原纖維蛋白溶液中添加0%（空白對照組）、0.5%、1.0%刺云實膠和4%蔗糖+4%山梨醇（商業(yè)抗凍劑組）后于-20±1 ℃冰箱中凍藏，每隔7 d 取出并于4 ℃冰箱中解凍，用于檢測各種指標。

1.2.3 肌原纖維蛋白溶液凍結曲線的測定 將溫度記錄儀探頭插入每組新鮮肌纖維蛋白溶液樣品的幾何中心，置于-20±1 ℃的冰箱冷凍。等待中心溫度下降到-18 ℃，完成凍結。設置溫度記錄溫度頻率：1 min/次，根據(jù)溫度變化繪制處凍結曲線[15]。

1.2.4 Ca2+-ATPase 活性的測定 參考任麗娜[16]的方法。取1.0 mL 肌原纖維蛋白稀釋液加入0.5 mol/L Tris-maleate（pH7.0）溶液0.5 mL，0.1 mol/L CaCl2溶液0.5 mL，2.0 mol/L NaCl 溶液2.2 mL，去離子水5.3 mL，混勻后，進行25 ℃恒溫，隨后加入20 mmol/L ATP 溶液，反應10 min 后加入15% TCA 作反應終止劑，過濾反應液，用去離子水定容至25 mL。測定上清液含有的無機磷的量，采用鉬藍比色法[17]。Ca2+-ATPase 活性用每毫克肌原纖維蛋白在反應10 min內釋放出的無機磷的量表示，即μmolPi/mg protein/10 min[7]。

1.2.5 總巰基和活性巰基的測定 總巰基含量測定參考Noman 等[7]的方法，并略作修改。將肌原纖維蛋白溶液用0.6 mol/L KCl 溶液稀釋，使蛋白溶液濃度為4 mg/mL 左右，取1 mL 稀釋后的樣液，加入4 mL的Ellman 試劑（10 mmol/L 乙二胺四乙酸、2%SDS、8 mol/L 尿素、0.2 mol/L 的Tris 鹽酸）?；靹?，隨后加入0.5 mL 的Tris-HCl 緩沖液（pH8.0）振蕩混勻，40 ℃水浴25 min。以0.6 mol/L KCl 溶液作為空白，412 nm 處測定吸光值。

活性巰基取稀釋后的樣液2.25 mL 加入15 μL Ellman 試劑混勻，于4±1 ℃放置1 h，412 nm 處測定吸光值。

注：A-測得的吸光值；C-蛋白濃度 (mg/mL)；ε-DTNB 的摩爾消光系數(shù)，13600 mol-1·cm-1；D-稀釋倍數(shù)；測得的巰基含量以mol/105g 蛋白質計[7]。

1.2.6 表面疏水性的測定 參考Riebroya[18]等的方法并適當修改。以蛋白質濃度為橫坐標，熒光強度為縱坐標繪制曲線，肌原纖維蛋白的表面疏水指數(shù)S0ANS 用該曲線初始階段的斜率表示。

1.2.7 內源性熒光光譜的測定 稀釋肌原纖維蛋白溶液濃度至0.05 mg/mL，參數(shù)設置：激發(fā)波長295 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm，波長掃描范圍為300～400 nm，掃描速度為12000 nm/min，每個樣品做3 次平行[19]。通過內源熒光光譜觀察凍藏過程中肌原纖維蛋白三級結構變化。

1.2.8 肌原纖維蛋白溶液水分流動性的測定 將肌原纖維蛋白溶液裝入核磁管中，選用Q-FID 序列進行校正，Q-CMPG 序列進行數(shù)據(jù)采集。每組測量3 個平行。參數(shù)設置：采樣頻率SW（kHz）=100；弛豫時間TW=2500 ms；采樣次數(shù)NS=8；回波個數(shù)NECH=4000。反演方法：SIRT。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個實驗重復三次，結果表示為平均值±標準差，數(shù)據(jù)結果采用Excel 2010 繪圖進行統(tǒng)計學分析。采用SPSS22.0 軟件進行方差分析和顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 刺云實膠對肌原纖維蛋白溶液凍結曲線的影響

圖1 為添加不同抗凍劑的肌原纖維蛋白溶液的凍結曲線。在凍結過程中，空白對照組，添加0.5%刺云實膠組，1%刺云實膠組，商業(yè)抗凍劑組通過最大冰晶帶（ -1～5 ℃）所用時間分別為29、34、31、25 min。添加商業(yè)抗凍劑組和空白對照組通過最大冰晶帶的速率略快于添加刺云實膠的組。由圖1可看出空白對照組、添加0.5%刺云實膠組、1%刺云實膠組和商業(yè)抗凍劑組凍結點分別為 -5.5、 -6.3、-8.3、 -7.3 ℃，到達凍結點的時間分別為10、11、17、14 min，凍結速率分別為12.01、14.00、10.29、11.94 ℃/min。添加刺云實膠對肌原纖維蛋白樣品中心溫度的變化均慢于商業(yè)抗凍劑組，但1.0%刺云實膠添加組凍結速率與空白對照組相接近。在凍結過程中，冷凍食品品質與凍結速率密切相關，快速通過最大冰晶帶可以減少肌原纖維蛋白的冷凍損傷[20-21]。由此可得， -18 ℃凍結環(huán)境下，添加刺云實膠對肌原纖維蛋白通過最大冰晶帶的速度稍有負面影響，但其對整體凍結過程影響較小。

圖1 肌原纖維蛋白溶液凍結過程中心溫度的變化Fig.1 Changes of central temperature during freezing of myofibrillar protein solution

2.2 刺云實膠對肌原纖維蛋白凍藏過程中Ca2+-ATPase活性的影響

Ca2+-ATPase 的活性是判斷肌球蛋白變性程度的敏感指標之一[22]，在凍藏過程中，由于冰晶的形成和生長，導致結合水與蛋白質的結合狀態(tài)以及肌球蛋白頭部聚集或發(fā)生構象變化[23]，進而導致肌原纖維蛋白的Ca2+-ATPase 活性隨凍藏時間增加而降低[7]。如圖2 所示，凍藏28 d 后，空白對照組，添加0.5%、1.0%刺云實膠和添加商業(yè)抗凍劑的肌原纖維蛋白的Ca2+-ATPase 活性分別比新鮮肌原纖維蛋白下降了60.12%、53.53%、45.69%、45.17%，添加1%刺云實膠的肌原纖維蛋白的Ca2+-ATPase 活性與商業(yè)抗凍劑組沒有顯著性差異（P＞0.05）。由此可知，1.0%刺云實膠添加后，減緩了蛋白Ca2+-ATPase 活性的下降。

圖2 肌原纖維蛋白凍藏過程中Ca2+-ATPase 活性的變化Fig.2 Changes of Ca2+-ATPase activity of myofibrillar protein during freezing

2.3 刺云實膠對肌原纖維蛋白凍藏過程中蛋白結構的影響

2.3.1 刺云實膠對肌原纖維蛋白凍藏過程中總巰基和活性巰基含量的影響 在冷凍貯藏過程中，肌纖維蛋白結構的變化使蛋白質內部的巰基暴露在表面，巰基易于氧化并產生二硫鍵，導致總巰基含量減少[14]，因此通過蛋白質巰基的含量變化能夠估測蛋白質變性程度[24]。如圖3 所示，在凍藏過程中，肌原纖維蛋白總巰基含量和活性巰基隨凍藏時間延長而下降，添加1%刺云實膠的肌原纖維蛋白的巰基含量和活性巰基含量顯著高于其他組（P＜0.05）。添加0.5%的刺云實膠與商業(yè)抗凍劑組的巰基保護作用無顯著性差異（P＞0.05）。從總巰基含量和活性巰基含量的角度來看，1%刺云實膠添加的抗凍效果優(yōu)于商業(yè)抗凍劑，能很大程度上抑制巰基氧化，起到保護肌原纖維蛋白的作用。Huang 等[25]研究證明半乳甘露聚糖具有良好的抗菌活性和抗氧化活性，推測刺云實膠具有抗凍性可能是由于刺云實膠具有抗氧化活性而抑制了巰基的氧化，或是由于刺云實膠中半乳甘露糖的半乳糖支鏈含有羥基，羥基與游離水結合形成氫鍵，使得凍藏過程中魚糜中形成較小的冰晶顆粒，減小了凍藏對肌原纖維蛋白的損傷[26]。

圖3 肌原纖維蛋白凍藏過程中總巰基含量（A）和活性巰基含量（B）的變化Fig.3 Changes of total sulfhydryl group content (A) and active sulfhydryl group content (B) of myofibrillar protein during freezing

2.3.2 刺云實膠對肌原纖維蛋白凍藏過程中表面疏水性的影響 如圖4，隨凍藏時間的延長，肌原纖維蛋白的表面疏水性增加，這是因為，魚肉新鮮時，其肌原纖維蛋白的疏水性基團被包圍在分子內部，表面疏水性低，冷凍貯藏后，蛋白質多肽鏈上最初的疏水基團暴露在表面并被氧化，導致蛋白質分子表面疏水性增強[17]。與新鮮肌原纖維蛋白相比（凍藏0 d），在凍藏28 d 后，空白對照組、添加0.5%刺云實膠、添加1%刺云實膠和添加商業(yè)抗凍劑的肌原纖維蛋白表面疏水性分別增加了436.04%、191.65%、176.00%、122.23%，刺云實膠組和商業(yè)抗凍劑組樣品的表面疏水性上升程度顯著低于空白對照組（P＜0.05），主要因為肌原纖維蛋白受到保護，變性程度減小，分子結構沒有發(fā)生大程度破壞，減少了疏水基團暴露[27]。說明添加商業(yè)抗凍劑和刺云實膠有助于抑制凍藏過程中表面疏水性的增加。

圖4 肌原纖維蛋白凍藏期間表面疏水性的變化Fig.4 Changes of surface hydrophobicity of myofibrillar protein during freezing

2.3.3 刺云實膠對肌原纖維蛋白凍藏過程中內源性熒光的影響 蛋白質具有內源熒光性，但冷凍貯藏會導致蛋白質構象的變化，一些氨基酸的內源熒光顯色基團的微環(huán)境和位置也會發(fā)生相應的變化，因此，內源熒光光譜可以用來反映蛋白質在冷凍貯藏過程中的構象變化[28]。

由圖5 可以看出，隨著凍藏時間延長，熒光強度均逐步降低，這是因為在凍藏過程中，蛋白變性伸展，原先位于蛋白內部的色氨酸殘基暴露于表面，致使色氨酸熒光猝滅，造成內源熒光強度下降[18]。此外添加抗凍劑后相比空白對照組熒光光譜紅移（向長波方向移動）。添加刺云實膠和商業(yè)抗凍劑的肌原纖維蛋白溶液的內源性熒光強度的下降程度顯著慢于空白對照組（P＜0.05）。在凍藏第7～21 d 時，添加1%刺云實膠的肌原纖維蛋白內源熒光強度較為穩(wěn)定；在21 d后，添加1%刺云實膠的肌原纖維蛋白內源熒光強度出現(xiàn)顯著下降。添加商業(yè)抗凍劑組的肌原纖維蛋白在第7～28 d 的內源熒光強度下降緩慢，較為穩(wěn)定。說明刺云實膠和商業(yè)抗凍劑的添加可有效抑制肌原纖維蛋白熒光強度的下降，抑制凍藏過程中肌原纖維蛋白的冷凍變性。1%刺云實膠可達到與商業(yè)抗凍劑相當?shù)目箖鲂Ч?/p>

2.4 刺云實膠對凍藏過程中肌原纖維蛋白水合能力的影響

將肌原纖維蛋白溶液凍藏0、14、21 和28 d 后在4 ℃下解凍12 h 后，采用低場核磁共振技術測其水分流動性，分析肌原纖維蛋白的水合能力，結果如圖6 所示。

圖6 肌原纖維蛋白溶液解凍后水分流動性的變化Fig.6 Changes of moisture fluidity of myofibrillar protein solution after thawing

肌原纖維蛋白溶液中的水分主要存在3 種不同狀態(tài)：與大分子緊密結合的結合水、存在于肌原纖維網(wǎng)絡內部的不易流動水和肌原纖維網(wǎng)絡外部的自由水，表現(xiàn)為3 個峰[29]，圖6 中T23峰（＞1000 ms）代表自由水含量。弛豫時間越長，則魚糜中水分流動性越強[30]。由圖6 中不同組別肌原纖維蛋白溶液的水分流動性可看出，隨著凍藏時間的增加，自由水的峰值時間后延，由此說明肌原纖維蛋白結合水的能力有所下降?？瞻讓φ战M和添加0.5%刺云實膠組的肌原纖維蛋白溶液，在28 d 凍藏結束時，T23峰峰值時間顯著增加（P＜0.05）；而添加1%刺云實膠和商業(yè)抗凍劑的肌原纖維蛋白溶液T23峰峰值時間增加顯著慢于空白對照組（P＜0.05）。圖6 中T22（100～1000 ms）峰代表不易流動水含量 ，可以看出，四組凍藏樣品隨著凍藏時間增加，T22峰面積比例減小，不易流動水相對含量減少，表明肌原纖維蛋白結合水的能力下降?？瞻讓φ战M在28 d 凍藏結束時，T22峰面積比例顯著下降；而添加1%刺云實膠和商業(yè)抗凍劑的肌原纖維蛋白溶液T22峰峰面積減小顯著慢于空白對照組。1%刺云實膠抗凍劑的加入可在很大程度上穩(wěn)定蛋白的結構，減少肌纖維網(wǎng)絡中水分的流失。

3 結論

刺云實膠和商業(yè)抗凍劑可以降低草魚肌原纖維蛋白溶液的凍結點。隨著凍藏時間的延長，未添加抗凍劑、0.5%刺云實膠、1.0%刺云實膠、商業(yè)抗凍劑的草魚肌原纖維蛋白均發(fā)生了不同程度的冷凍變性。與未添加抗凍劑的空白肌原纖維蛋白相比，添加1.0%刺云實膠和商業(yè)抗凍劑可以有效延緩草魚肌原纖維蛋白凍藏過程中Ca2+-ATPase 活性、巰基含量和內源性熒光強度的下降，表面疏水性和解凍后水分流動性的增加。1.0%刺云實膠在抑制凍藏過程中肌原纖維蛋白總巰基和活性巰基含量下降方面表現(xiàn)出比商業(yè)抗凍劑更好的效果。另外，1.0%刺云實膠可以減弱解凍后肌原纖維蛋白溶液的水分流動性。因此，1.0%刺云實膠可以增強草魚肌原纖維蛋白的冷凍穩(wěn)定性，是一種潛在的新型魚糜抗凍劑。