李博 楊童 劉錦 蔣鵬 周倩

(1.廣東藥科大學(xué)中醫(yī)藥研究院，廣東 廣州 510006；2.暨南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510632；3.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院輸血研究所，四川 成都610052)

血栓是指由血管壁損傷或炎癥引起諸如膠原、組織因子及凝血酶等激活，進(jìn)而誘發(fā)局部血小板及纖維蛋白活化，并形成斑塊的病理過程[1]。臨床數(shù)據(jù)表明，由動脈粥樣硬化斑塊剝離等偶發(fā)事件導(dǎo)致的急性血栓會在血管內(nèi)隨機附著并快速增長，其是心肌梗死、肺栓塞及卒中等嚴(yán)重臨床事件的主要誘因，每年血栓性疾病致死人數(shù)占全球死亡人數(shù)的25%[2]。因此，血栓的早期診斷具有重大臨床意義。然而，現(xiàn)階段臨床影像學(xué)僅能識別晚期血栓，對血栓形成缺乏靈敏性及特異性，開發(fā)針對血栓形成的分子影像探針刻不容緩[3]。

隨著微納米技術(shù)的蓬勃發(fā)展，靶向標(biāo)志物的分子探針方興未艾，前景廣闊。血栓形成包含血管上皮細(xì)胞和血小板無序活化、凝血酶激活、纖維蛋白生成及紅細(xì)胞附著等生理過程，這些關(guān)鍵組分被認(rèn)為是血栓形成的標(biāo)志物分子[4]?，F(xiàn)綜述微納米探針在血栓診斷領(lǐng)域的研究進(jìn)展，并對其臨床轉(zhuǎn)化前景進(jìn)行展望。

1 基于血小板的分子成像

血小板是血栓形成的關(guān)鍵組分，其一般處于靜息狀態(tài)，當(dāng)血管內(nèi)壁受損或炎癥發(fā)生時，血小板被激活進(jìn)入活化狀態(tài)，形成血栓[5]。研究表明，血小板從靜息狀態(tài)進(jìn)入活化狀態(tài)后，其表面會高表達(dá)P選擇素；同時，糖蛋白Ⅱb/Ⅲa(glycoprotein Ⅱb/Ⅲa，GPⅡb/Ⅲa)亦會轉(zhuǎn)變?yōu)閷w維蛋白具有高親和力的構(gòu)象[6]。因此，這兩種分子可作為區(qū)分靜息和活化血小板的標(biāo)志物，用來鑒定早期血栓。

1.1 P選擇素

血小板激活表達(dá)P選擇素后，可通過其糖蛋白配體-1將白細(xì)胞募集至病灶區(qū)域參與血栓形成。因此，將P選擇素抗體或糖蛋白配體-1重組靶向配體與造影劑相偶聯(lián)，將有望通過靶向活化血小板實現(xiàn)血栓特異性成像。Lindner等[7]率先將P選擇素單抗與脂質(zhì)體微泡(microbubbles，MBs)偶聯(lián)，證實其能提高炎癥病灶的超聲信號。Davidson等[8]將MBs與糖蛋白配體-1重組靶向配體偶聯(lián)，發(fā)現(xiàn)其在心肌缺血再灌注模型中能實現(xiàn)病灶區(qū)域的超聲分子成像。Appeldoorn等[9]發(fā)現(xiàn)沒食子酸修飾的Glu-Trp-Val-Asp-Val短肽(GA-EWVDV)與P選擇素具有特異性高親和力(IC50=15.4 nm)，其可作為P選擇素靶標(biāo)分子。Xu等[10]將四氧化三鐵(Fe3O4)、全氟己烷(perfluorohexane，PFH)和墨汁裝載入聚乳酸乙醇酸(polylactic-co-glycolic acid，PLGA)納米結(jié)構(gòu)，并在其表面用GA-EWVDV修飾得到納米體系，其能靶向血栓性病灶并提供光聲、磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)和超聲三模成像。盡管上述分子探針已取得一定成果，但肽類及蛋白質(zhì)類配體制備耗時長、花費高，且在體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)中極易被降解，其臨床應(yīng)用需進(jìn)一步驗證。

褐藻糖膠是海藻中提取的一種天然多糖，其被證實與P選擇素具有高親和力。99mTc標(biāo)記的褐藻糖膠(99mTc-Fuco)能通過靶向P選擇素，實現(xiàn)血栓的單光子發(fā)射計算機斷層成像(single photon emission computed tomography，SPECT)[11]。Suzuki等[12]將褐藻糖膠修飾到超小順磁納米顆粒上，證實其能靶向活化血小板并實現(xiàn)血栓的MRI分子成像。Li等[13]通過聚合反應(yīng)得到褐藻糖膠修飾的微泡(Fuco-MBs)，其能在體內(nèi)靶向富集到新生靜脈血栓并提供超聲信號；當(dāng)施加瞬時高頻超聲后，MBs結(jié)構(gòu)會被破壞，從而丟失超聲信號，F(xiàn)uco-MBs被證實其有望實現(xiàn)體內(nèi)血栓的定量分析及溶栓藥物的超聲控釋。Nguyen等[14]借助多元醇構(gòu)建了褐藻糖膠包被的摻雜鐵元素的超小型氧化鋅納米體系，其具有磁性及熒光特質(zhì)，靶向富集血栓后能提供病灶區(qū)域的MRI及熒光雙模成像。2019年完成了有關(guān)99mTc-Fuco的臨床Ⅰ期評估，證實其良好的體內(nèi)分布效應(yīng)及生物安全性，Ⅱ期臨床試驗即將開展對患者不穩(wěn)定新發(fā)血栓的臨床檢測研究，這些成果將為基于褐藻糖膠的分子探針臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)[15]。

1.2 GPⅡb/Ⅲa

GPⅡb/Ⅲa隸屬于整合素蛋白家族，其在血小板上高表達(dá)。當(dāng)血小板被激活后，GPⅡb/Ⅲa構(gòu)象從與纖維蛋白原的低親和力構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)楦哂H和力構(gòu)象，誘發(fā)血小板聚集而形成血栓。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(arginine-glycinema-aspatic acid，RGD)短肽被證實能模擬纖維蛋白原與GPⅡb/Ⅲa結(jié)合，其偶聯(lián)造影劑可用于血栓成像[16]。Hu等[17]利用環(huán)狀RGD(cyclic RGD，cRGD)與MBs偶聯(lián)得到Mb-cRGD，證實其能增強腹腔動脈血栓超聲信號，在多普勒成像輔助下可進(jìn)一步確認(rèn)血管狹窄程度。Ye等[18]將釓(Gd)和超順磁氧化鐵封裝到cRGD功能化的脂質(zhì)體得到cRGD@MLP-Gd，其能靶向活化血小板并增強病灶區(qū)域MRI的T1和T2造影信號，提升血栓診斷的精確性和靈敏性。Rix等[19]將cRGD修飾到聚氰基丙烯酸正丁酯構(gòu)建的MBs上，得到可長期穩(wěn)定保存的超聲造影劑cRGD-MB，證實其能監(jiān)視血管受損后的炎癥發(fā)生及血栓形成。Kang等[20]將二聚cRGD通過鏈親和素/生物素與熒光分子Alexa Fluor 680偶聯(lián)，并進(jìn)一步用64Cu標(biāo)記，得到可檢測GPⅡb/Ⅲa表達(dá)水平的正電子發(fā)射斷層掃描(positron emission tomography，PET)/光學(xué)雙模成像分子探針。Wu等[21]近期將RGD修飾到近紅外二區(qū)熒光分子TTQ的表面得到TTQ-PEG-cRGD，其不但能在小鼠頸動脈血栓區(qū)域提供近紅外二區(qū)熒光信號，還能區(qū)分新舊血栓，該體系為早期血栓非侵入精準(zhǔn)影像學(xué)鑒定提供了新的思路和方法。Bai等[22]通過多步乳化法將PFH和吲哚箐綠(indocyanine green，ICG)共封裝入PLGA納米結(jié)構(gòu)，并在其表面修飾cRGD后得到PLGA-cRGD-PFH-ICG納米平臺，證實其能靶向富集到冠狀動脈微血栓病灶并通過ICG實現(xiàn)光聲和熒光雙模成像。同時，PFH在超聲觸發(fā)下還能形成空化效應(yīng)，發(fā)揮溶栓效果?；赗GD靶向GPⅡb/Ⅲa的分子探針開發(fā)取得了一定進(jìn)展，但由于RGD無法區(qū)分未激活和激活狀態(tài)的GPⅡb/Ⅲa構(gòu)象，該類分子探針理論上可與所有血小板結(jié)合，其成像效果僅依賴于血栓區(qū)域血小板與循環(huán)系統(tǒng)血小板的信噪差，特異性有待進(jìn)一步提高。

近期，可特異性靶向GPⅡb/Ⅲa激活構(gòu)象的單鏈抗體(single-chain variable antibody fragment，svFv)受到廣泛關(guān)注。基于svFv的分子探針也已在血小板活化相關(guān)的多種疾病中取得初步成果。Lim等[23]將近紅外熒光分子與svFV偶聯(lián)后，證實其可用于血栓早期三維光學(xué)成像。單鏈抗體與MBs和氧化鐵納米顆粒偶聯(lián)后，也展示出與早期血栓較強的特異性結(jié)合能力[24]。Ta等[25]將單鏈抗體與具備MRI T1和T2雙重造影特性的超小型磁性氧化鐵納米粒子偶聯(lián)，實現(xiàn)了小鼠頸動脈血栓的MRI雙模造影成像，其克服了T1或T2單獨成像的缺陷，顯著提高了血栓檢測的精準(zhǔn)性。Li等[26]將svFv通過“點擊反應(yīng)”修飾到具有熒光及磁性雙重特質(zhì)的DBM-NaGdF4表面，證實其能靶向聚集到高表達(dá)GPⅡb/Ⅲa區(qū)域，提供MRI和熒光雙模造影信號。

2 基于纖維蛋白的分子成像

纖維蛋白是血栓形成中的另一個關(guān)鍵因素，其在血栓形成初期往往濃度較高，后期逐漸被膠原蛋白或其他纖維蛋白所取代[27]?；诖?，設(shè)計開發(fā)靶向纖維蛋白的分子探針將有望為血栓早期影像學(xué)鑒定提供幫助。

Botnar等[28]率先合成了能與纖維蛋白特異性結(jié)合的含Gd短肽(EP-1873)，其可實現(xiàn)易損斑塊的MRI分子成像。Overoye-Chan等[29]用羥基脯氨酸、氯酪氨酸及谷氨酸取代修飾EP-1873得到新型短肽EP-2104R，其具備更好的靶向和造影效果，動物模型證實其能實現(xiàn)冠狀動脈血栓和肺栓塞的MRI分子成像。Ay等[30]將EP-2104R用64Cu標(biāo)記后，其能實現(xiàn)大鼠血栓PET成像；而當(dāng)溶栓治療后，其病灶區(qū)域信號減弱甚至消失，表明該探針可用于血栓成像及定量分析?？紤]到Gd對腎功能不全患者的安全風(fēng)險，Gale等[31]以EP-2104R為模板，用錳基螯合物取代Gd制備了Mn-FBP探針，其在頸動脈血栓模型中顯示出與EP-2104R相當(dāng)?shù)脑煊靶Ч?，為開發(fā)適用于腎功能不全人群的非Gd血栓分子探針奠定了基礎(chǔ)。在另一項研究中，Oliveira等[32]將EP-2104R用68Ga或111In標(biāo)記，證實其能實現(xiàn)血栓的SPECT/PET/CT三模成像。Hara等[33]則以EP-2104R為基礎(chǔ)設(shè)計了近紅外染料標(biāo)記的肽，證實其能實現(xiàn)頸靜脈血栓熒光成像。盡管EP-2104R現(xiàn)階段已開展部分臨床試驗，但尚無產(chǎn)品獲批臨床使用。

3 基于凝血酶響應(yīng)的分子探針

凝血酶主要通過將纖維蛋白原裂解為纖維蛋白，使后者發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)而穩(wěn)定血栓結(jié)構(gòu)，其在血栓形成階段往往表達(dá)活性升高，亦可作為早期血栓性疾病的生物標(biāo)志分子。

近期，Lux等[34]將凝血酶敏感的細(xì)胞穿膜肽(ACPP)與MBs偶聯(lián)，其能在血栓區(qū)域通過凝血酶特異性裂解ACPP而暴露MBs正電荷表面，黏附至帶負(fù)電荷的紅細(xì)胞表面從而實現(xiàn)血栓分子的造影成像。Kwon等[35]將近紅外熒光分子Cy5.5通過凝血酶響應(yīng)肽偶聯(lián)至二氧化硅包裹的金納米顆粒表面，得到熒光/CT雙模分子探針TAP-SiO2@AuNPs，其在正常生理狀態(tài)下，Cy5.5信號被AuNPs淬滅而無成像效果；在血栓區(qū)域，結(jié)構(gòu)中的連接肽可被凝血酶特異性切割，從而釋放Cy5.5發(fā)出熒光信號，AuNPs則可通過納米尺寸效應(yīng)積聚至血栓部位，從而實現(xiàn)病灶區(qū)域的熒光/CT雙模造影成像。類似地，Wang等[36]利用凝血酶敏感肽(LASG)將熒光分子FITC與Fe3O4偶聯(lián)得到FITC-LASG-Fe3O4分子探針，正常情況下其FITC信號會被Fe3O4所淬滅，而當(dāng)LASG被血栓區(qū)域凝血酶特異性切割時，其釋放的FITC才會呈現(xiàn)信號，從而聯(lián)合Fe3O4實現(xiàn)病灶區(qū)域熒光/MRI聯(lián)合可視化成像。

4 基于雙靶向系統(tǒng)的分子探針

不同于腫瘤等疾病的分子探針，血栓分子探針需面臨高血流剪切力沖擊考驗，其與血栓標(biāo)志物的黏附強度及滯留時間將直接影響其提供的造影信號。構(gòu)建針對不同靶標(biāo)的雙配體探針將有望提高靶向富集效率并延長滯留時間，從而達(dá)到增強血栓分子成像信號的目的。Zhang等[37]將cRGD與GA-EWVDV共同修飾到聚多巴胺納米表面，相比單肽修飾的納米體系，雙肽修飾的納米結(jié)構(gòu)對不同類型的急性血栓均展示出更高的靶向富集效率及更長的滯留時間，顯著增強了血栓的MRI和光聲雙模成像效果。Günther等[38]將能與GPⅡb/Ⅲa特異性結(jié)合的抗體及P選擇素天然配體sialyl lewis X共同修飾到MBs表面，構(gòu)建了雙重靶向超聲造影劑(MBDual)；在體外模擬中，其與血小板的黏附能力明顯高于單配體修飾MBs，且MBDual在體內(nèi)頸動脈血栓模型也顯示出較高的超聲信號。近期，Yang等[39]將纖維蛋白靶向肽與ACPP共修飾至脂質(zhì)體納米表面，證實了纖維蛋白靶向肽與ACPP的雙靶向組合能顯著提高納米體系的靶向效率和滲透效率，從而更有利于實現(xiàn)血栓的3維立體精準(zhǔn)成像。相比于單配體探針，雙配體修飾的分子探針在血栓病灶黏附強度、滯留時間及滲透效率方面展現(xiàn)出更大優(yōu)勢，其為血栓的精準(zhǔn)成像提供了全新的思路。

5 小結(jié)與展望

盡管基于血小板、纖維蛋白及凝血酶等血栓關(guān)鍵組分的分子影像探針已取得一定成果，但其仍有各自不足[40]。例如，靜脈血栓中血小板占比遠(yuǎn)低于動脈血栓，導(dǎo)致基于血小板的分子探針在靜脈血栓成像中效果不佳；而纖維蛋白不僅在血栓部位表達(dá)，還在血管炎癥部位表達(dá)，其分子探針存在脫靶風(fēng)險；此外，凝血酶往往存在于血栓內(nèi)部，物理阻隔也成為響應(yīng)型探針成像效果的限制因素；同時，肽類分子探針往往面臨體內(nèi)降解風(fēng)險，其穩(wěn)定性也需更多研究。在未來，更多血栓標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)和加入將為開發(fā)多元化血栓分子探針帶來機遇，這些成果在血栓早期診斷方面具有廣闊的應(yīng)用前景，其終將為臨床患者帶來幫助。