吳秀蘭，王富江，葛海濤,*

（1. 南京中醫(yī)藥大學 藥學院，江蘇 南京 210023；2. 江蘇蘇中藥業(yè)研究院有限公司，江蘇 南京 210031）

糖尿病腎?。―iabetic Nephropathy，DN）是糖尿病最主要的微血管疾病之一，嚴重威脅人類的健康。據(jù)報道，20% ～ 30%的糖尿病患者在患病5年或更長時間后容易發(fā)展為糖尿病腎病[1-3]。高血糖、高血壓、肥胖、久坐不動的生活方式以及遺傳等眾多因素都可導致糖尿病腎病的發(fā)生及發(fā)展[4]。目前，臨床主要通過控制血糖、血脂和血壓治療糖尿病腎病，但治療效果不佳，常伴隨著復發(fā)的風險[5]。

黃葵膠囊是治療腎病的專用藥物，與血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、血管緊張素受體阻滯劑等化藥相比，黃葵膠囊在降低患者尿蛋白、延緩腎損害方面具有獨特優(yōu)勢。研究表明，黃葵膠囊能明顯改善慢性腎病患者24 h尿蛋白定量、血肌酐和尿素氮等，在治療糖尿病腎病、慢性腎炎等方面療效肯定，臨床價值被評為A類[6]。黃葵膠囊含黃酮類、多糖、有機酸、核苷等化學成分，主要通過抑制免疫反應、抗炎、改善腎纖維化、保護腎小管上皮細胞等途徑發(fā)揮藥理作用[7-10]，但目前尚不清楚有效成分如何作用于靶蛋白和調(diào)節(jié)信號傳導通路，從而達到抗炎和抗糖尿病的藥理作用。本研究以黃葵膠囊中治療糖尿病腎病的藥效成分為研究對象，運用網(wǎng)絡藥理學的研究方法，構建“藥物-成分-靶點-通路”網(wǎng)絡關系，探索黃葵膠囊治療糖尿病腎病的藥效物質(zhì)基礎及潛在分子機制，并采用動物實驗驗證其對核心靶點的調(diào)節(jié)作用，為其臨床使用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 數(shù)據(jù)庫及軟件 TCMSP（http://tcmspw.com/tcmsp.php）、GeneCards（https://www.genecards.org/）、PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、微 生信 網(wǎng) 站（http://www.bioinformatics.com.cn/）、STRING（https://www.string-db.org/）、Swiss Target Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）、Uniprot（https://www.uniprot.org）、Cytoscape（3.7.1）、Metascape（https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1）等。

1.1.2 實驗動物 SPF級雄性KM小鼠35只，體質(zhì)量為20 ～ 22 g，實驗動物許可證號SCXK（遼）2020-0001，倫理編號SZSW-2022041504（由遼寧長生生物技術股份有限公司提供）。

1.1.3 實驗儀器 Dimension EXL200型全自動生化分析儀（德國西門子公司）；DM75M型倒置顯微鏡（德國Leica 公司）。

1.1.4 試劑與試藥 鏈脲佐菌素（批號：C2019162）購于aladdin公司；兔抗血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）多克隆抗體（貨號：ab46154）、抗小鼠信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活子3（STAT3）多克隆抗體（貨號：ab68153）、兔抗小鼠腫瘤壞死因子（TNF-α）多克隆抗體（貨號：ab215188）均購于英國Abcam公司；黃葵膠囊（批號：20091805）均購于江蘇蘇中藥業(yè)集團股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 黃葵膠囊治療糖尿病腎病的靶點預測 通過Web of Science、Pubmed、CNKI等數(shù)據(jù)庫檢索黃葵膠囊的化學成分，篩選出文獻已報道的活性成分。將獲取的活性成分英文名稱輸入PubChem數(shù)據(jù)庫，找到該成分的sdf結構，并將該結構導入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫，預測其潛在靶點，Uniprot數(shù)據(jù)庫對蛋白名稱進行規(guī)范化。

將“Diabetic Nephropathy”作 為 關 鍵 詞 輸 入GeneCards數(shù)據(jù)庫，消除重復性基因，并使用中位數(shù)法篩選出合適的基因數(shù)。將以上兩者靶點去除重復值后導入微生信網(wǎng)站，在線分析黃葵膠囊治療糖尿病腎病的作用靶點。

1.2.2 黃葵膠囊-糖尿病腎病關鍵靶點的篩選運用STRING對共有靶點進行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡構建（Protein-Proteininteraction，PPI），選擇物種為“Homo sapiens”,蛋白相互作用綜合得分＞0.4。將PPI導入Cytoscape （3.7.1），根據(jù)網(wǎng)絡拓 撲 學 性 質(zhì)，以中 心 度 值（betweenness bentrality）、親中心度值（closeness centrality）、等級值（degree）對PPI中的關鍵靶點進行篩選。

1.2.3 基因本體及京都基因與基因組百科全書富集分析 將作用靶點導入Metascape數(shù)據(jù)庫，以P值為0.01對作用靶點進行富集分析，并使用微生信在線作圖分析網(wǎng)站對富集分析結果進行可視化。

1.2.4 “藥物-成分-靶點-通路”網(wǎng)絡構建與分析

將黃葵膠囊治療糖尿病腎病的靶點及信號通路分別導入Cytoscape軟件，構建網(wǎng)絡圖并利用網(wǎng)絡分析功能對網(wǎng)絡圖的特征進行分析。黃葵膠囊有效成分與治療DN的靶點相關聯(lián)， 同時映射到相關通路中，通過“藥物-成分-靶點-通路”網(wǎng)絡圖探討黃葵膠囊治療DN的作用機制。

1.2.5 分組及造模 取體質(zhì)量為20 ～ 22 g的SPF級雄性KM小鼠35只，在溫度（19±3）℃、濕度50%～70%，12 h光照/12 h黑暗交替的條件下，適應性飼養(yǎng)一周。隨機選取10只作為正常組，給予常規(guī)清潔級飼料。其余25只小鼠全部造模，腹腔注射（ip）鏈脲佐菌素以0.025 mmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH = 4.4）配制100 mg/kg連續(xù)注射3 d，3 d后于尾靜脈連續(xù)采血2次，以血糖≥16.7 mmol/L者為合格。造模過程中小鼠給予高脂飼料飼養(yǎng)4周，期間有3只小鼠死亡。造模結束時，開始用代謝籠收集小鼠24 h尿液，以全自動生化分析儀檢測小鼠24 h尿蛋白定量、肌酐，以血糖水平≥16.7 mmol/L、尿蛋白陽性，作為糖尿病腎病動物模型建立標準。2只小鼠尿蛋白呈陰性，剔除。將造模成功的小鼠隨機分為模型組、黃葵膠囊組，每組10只。黃葵膠囊組灌胃（ig）黃葵膠囊，正常組和模型組灌胃（ig）等體積生理鹽水，每天1次，連續(xù)4周。每日觀察各組小鼠的精神狀態(tài)、飲食、飲水以及皮毛色澤變化等情況。分別于DN小鼠模型成模前后及給藥期間，定期檢測全部小鼠體質(zhì)量。給藥結束后，收集全部小鼠尿液。用戊巴比妥鈉麻醉后，眼球取血，靜置1 h后離心（3 000 r/min，4℃，10 min），分裝血清凍存。

1.2.6 腎組織病理學 取左、右側腎臟用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，分別進行HE、PAS染色，顯微鏡下觀察腎組織病理變化情況。

1.2.7 免疫組化 采用免疫組織化學（Immunohistochemistry，IHC）SP 法定性分析各組小鼠VEGFA、TNF-α、STAT3的表達特征。組織切片常規(guī)脫蠟，梯度乙醇入水，抗原用檸檬酸緩沖液修復，蛋白一抗抗小鼠信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活子3（STAT3）多克隆抗體、兔抗小鼠腫瘤壞死因子（TNF-α）多克隆抗體、兔抗小鼠β-肌動蛋白（β-actin）（內(nèi)參）多克隆抗體、兔抗血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）多克隆抗體）濃度均為 1∶ 200，4 ℃孵育，過夜，37 ℃復溫。二抗［辣根過氧化物酶（Horseradish peroxidase，HRP）］標記的山羊抗兔疫球蛋白G（IgG）抗體，濃度為1∶1 000，37 ℃孵育，30 min，洗滌，DAB 顯色，蘇木素輕度復染，脫水、二甲苯透明、樹脂封片。每張切片從腎皮質(zhì)外側向內(nèi)，自上而下隨機取5個高倍（×200）視野，觀察陽性細胞分布情況，并用 Image J圖像分析軟件進行半定量分析。VEGFA、TNF-α、STAT3蛋白表達以平均吸光度（累積吸光度/測量面積）表示。

1.2.8 統(tǒng)計學方法 用 Graphpad Prism 8.0.2軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 黃葵膠囊活性成分靶點預測

通過文獻查閱，黃葵膠囊活性成分有19種，包括11種黃酮類成分、3種核苷以及5種有機酸，靶點共273個，并建立“成分-靶點”網(wǎng)絡，見表1、圖1。

圖1 黃葵膠囊活性成分-靶點網(wǎng)絡Fig. 1 Active ingredients - target network of HKC

表1 黃葵膠囊活性成分及靶點相關信息Tab. 1 Relevant information of active components and targets of Huangkui capsule

2.2 PPI網(wǎng)絡構建及關鍵靶點篩選

PPI網(wǎng)絡圖中含有125個靶蛋白（2個靶蛋白未參與蛋白互）和1 700條互作邊。利用拓撲參數(shù)betweenness bentrality＞0.001 8、closeness centrality＞0.53、degree＞21篩選出關鍵靶點47個，見圖2。該PPI網(wǎng)絡中，節(jié)點按degree值排列，節(jié)點越大，作用的基因數(shù)目越多，相關性越大；連接線按combined-score排列，連接線越粗，相關性越大。評分較高的核心靶點有EGFR 、CASP3、ALB、SRC、HIF1A、GAPDH、VEGFA、TNF、STAT3等。

圖2 黃葵膠囊治療DN核心靶點網(wǎng)絡Fig. 2 The key targets network of HKC in the treatment of DN

2.3 基因功能和通路分析

對127個靶點進行GO以及KEGG通路注釋分析，按顯著性程度對GO前10條分析結果（見圖3）以及KEGG前20條通路（見圖4）進行展示，GO富集分析主要涉及激素的反應、激酶活性的調(diào)節(jié)、細胞因子的調(diào)節(jié)等生物過程，以及蛋白絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性、蛋白質(zhì)結構域特異性結合、磷酸酶結合、胰島素受體底物結合等分子功能。KEGG富集分析包括晚期糖基化產(chǎn)物（AGE-RAGE）信號通路、PI3KAkt 信號通路、低氧誘導因子（HIF-1）信號通路、MAPK信號通路、Ras信號通路、VEGF信號通路等。

圖3 BP-CC-MF柱狀圖Fig. 3 Biological Process（BP）-Cell Composition （CC）-Molecular Function （MF） histogram

圖4 KEGG富集分析氣泡圖Fig. 4 Bubble chart of KEGG enrichment analysis

2.4 “藥物-成分-靶點-通路”網(wǎng)絡分析

使用Cytoscape（3.7.1）構建了“藥物-成分-靶點-通路”網(wǎng)絡分析，見圖5。該網(wǎng)絡通過多個靶點建立了藥物、成分與通路之間的聯(lián)系，包括10種活性成分、6條關鍵KEGG信號通路等。對網(wǎng)絡中各化合物作用通路進行分析，黃葵膠囊治療糖尿病腎病以槲皮素、異槲皮苷、楊梅素、咖啡酸為主要活性成分，作用于微血管、炎癥及免疫相關靶點，并通過不同的代謝途徑和生物過程，共同調(diào)節(jié)機體水平。

圖5 “藥物-成分-靶點-通路”網(wǎng)絡分析Fig. 5 “HKC - ingredients - targets - pathway” network

2.5 動物驗證

2.5.1 黃葵膠囊對糖尿病腎病小鼠尿蛋白及肌酐的影響 與正常組對比，模型組小鼠UCFP、ACR水平明顯升高（P＜ 0.05），結合血糖測量值，糖尿病腎病模型建立成功；與模型組相比，經(jīng)黃葵膠囊治療4周后，小鼠體內(nèi)UCFP、ACR水平明顯降低（P＜0.05），見圖6。表明黃葵膠囊能明顯改善糖尿病腎病小鼠腎功能。

圖6 各組小鼠UCFP 、ACR 變化（n = 10）Fig. 6 UCFP and ACR for mice in various groups（n = 10）

2.5.2 黃葵膠囊對糖尿病腎病小鼠腎組織病理學分析 正常組小鼠腎小球、腎小管或間充質(zhì)均未見明顯的組織病理學改變,腎臟組織結構基本完整；而模型組小鼠腎小球系膜擴張，基底膜增厚，皮質(zhì)部腎小管上皮細胞重度壞死，說明模型組小鼠腎組織出現(xiàn)了病理性損傷；黃葵膠囊治療后，小鼠腎組織病理損傷均有不同程度的減輕。PAS 染色顯示：模型組小鼠糖原沉積，系膜擴張、腎小管空泡變性。黃葵膠囊治療后，模型組小鼠腎組織糖原累積及系膜擴張程度明顯降低，見圖7。

圖7 黃葵膠囊對糖尿病腎病小鼠腎組織病理變化的影響（×200）Fig. 7 Effect of HCK on renal pathological changes in DN mice （×200）

2.5.3 黃葵膠囊對糖尿病腎病小鼠腎組織VEGFA、TNF-α、STAT3蛋白表達的影響 TNF-α、STAT3是免疫和炎癥的關鍵蛋白，是發(fā)生炎癥反應的重要信號因子。與正常組相比，VEGFA、TNF-α在模型組中表達上調(diào)（P＜0.05），STAT3的表達上調(diào)，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與模型組相比，黃葵膠囊治療組中VEGFA、TNF-α蛋白明顯下調(diào)（P＜0.05），STAT3蛋白下調(diào)，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖8。

圖 8 各組小鼠腎組織VEGFA、TNF-α、STAT3蛋白表達的影響Fig. 8 Renal tissue protein expressions of VEGFA, TNF-α and STAT3 in mice in various

3 討論

研究結果表明，黃葵膠囊通過VEGFA、STAT3、TNF、HIF1A、GAPDH等多基因共同表達，AGERAGE信號通路、PI3K-Akt 信號通路、低氧誘導因子（HIF-1）信號通路、MAPK信號通路、Ras信號通路、VEGF 信號通路等多條通路調(diào)控，發(fā)揮對DN的治療作用。在DN等腎臟疾病早期時，VEGFA在足細胞中表達水平升高，而在DN晚期時，由于足細胞凋亡，VEGFA表達水平下降，抑制足細胞中VEGFA的表達可改善蛋白尿，但由于VEGFA能保護微血管，完全抑制VEGFA表達，則加重腎小球損害[11-17]。信號轉(zhuǎn)導與STAT3，是免疫和炎癥的關鍵蛋白，STAT3磷酸化并入核，結合靶基因， 使IL-6產(chǎn)生增加，從而加重炎癥[18]。STAT3蛋白表達越低，DN大鼠蛋白尿減少，腎小球系膜細胞增殖和系膜擴張減少，巨噬細胞浸潤減少[19-20]。TNF具有免疫調(diào)節(jié)和促炎作用，TNF-α作為TNF家族的主要表達蛋白，刺激單核細胞和巨噬細胞聚集，引起ROS的產(chǎn)生，增加血管通透性，從而導致白蛋白的產(chǎn)生，進一步損害腎小球[21]。

為進一步探討黃葵膠囊治療DN的潛在分子機制，本研究利用動物實驗證實了黃葵膠囊中的活性成分可通過下調(diào)VEGFA、TNF-α蛋白的表達，發(fā)揮治療作用。但與正常組相比，DN小鼠STAT3無明顯變化，HKC治療后，STAT3蛋白具有上調(diào)趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義。已有研究證實，DN大鼠中STAT3總表達水平并不會明顯上調(diào)， p-STAT3表達水平才會明顯上調(diào)，從而使p-STAT3/ STAT3增大，敲除STAT3基因可明顯降低炎癥因子的表達，與本研究結果一致。根據(jù)本研究結果推測，黃葵膠囊可能通過下調(diào)VEGFA、TNF-α蛋白的表達，改善血液微循環(huán)、降低炎癥反應，從而降低DN患者尿蛋白。

4 結論

網(wǎng)絡藥理學研究發(fā)現(xiàn)黃葵膠囊治療糖尿病腎病關鍵靶點47個，可能與AGE-RAGE、PI3K-Akt 等信號通路相關。動物實驗驗證了黃葵膠囊能降低VEGFA、TNF-α蛋白的表達，從而降低糖尿病腎病小鼠尿蛋白。本研究存在一定局限性，僅僅通過動物實驗驗證了預測到的靶點，針對于黃葵膠囊中何種活性成分發(fā)揮作用，以及如何作用于相關靶點及通路，還需要結合分子對接技術以及細胞實驗進行研究。