呂 潔，趙樹立，張雪峰,3

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京 210023；2.南京市第一醫(yī)院 臨床研究中心，江蘇 南京 210012；3.江蘇鼎泰藥物研究股份有限公司，江蘇 南京 210000）

近年來，隨著人口老齡化以及年輕人吸煙、不健康飲食、不規(guī)律作息等現(xiàn)象的增加，肝癌已成為世界第六大常見癌癥和第四大癌癥死亡原因[1]。肝細胞癌是最常見的肝癌類型，總體生存率較低，患者就醫(yī)時大多已處于癌癥中晚期，發(fā)現(xiàn)晚且預(yù)后差。中醫(yī)藥作為我國優(yōu)秀傳統(tǒng)文化遺產(chǎn)，具有難以比擬的優(yōu)勢，可以有效改善西醫(yī)西藥毒性大反應(yīng)強的不足，減輕患者痛苦[2]。

美洲大蠊Periplaneta americana（L.）為蜚蠊科動物 ，民間俗稱“蟑螂”?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，美洲大蠊具有促血管增生、保肝、促進創(chuàng)傷愈合[3]、強心升壓[4]、抗菌[5]、抗病毒、抗腫瘤[6-8]、抗炎鎮(zhèn)痛[9-11]、增強免疫力[12]等作用。在抗腫瘤方面，臨床觀察表明美洲大蠊提取物多肽及康復(fù)新液對原發(fā)性肝癌有一定緩解治療作用，可有效延長患者生存時間，但其發(fā)揮藥效作用機制尚不明朗[13-14]。本實驗將在細胞和動物水平上探討美洲大蠊提取物康復(fù)新液對肝癌細胞HepG2的凋亡誘導(dǎo)作用，并進一步探討其抗肝癌機制，以期為該藥物的臨床廣泛應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

35l型氣套CO2培養(yǎng)箱（Thermo Fisher Scientific公司）；XW-80A型渦旋混合器（上海醫(yī)大儀器有限公司）；BSA124S型分析天平（奧多利斯科學(xué)儀器有限公司）；CKX41型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；Spectra Max Plus 384型酶標儀（Molecular Devices公司）；BD C6型流式細胞儀（美國Becton ＆ Dickinson公司）；Mini-Protean@ Tetra型電泳槽、Mini Trans-Blot型轉(zhuǎn)印槽、ChemiDOCTM XRS+型分子成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司）。

美洲大蠊提取物：康復(fù)新液（批號：20200701），購于內(nèi)蒙古京新藥業(yè)有限公司，經(jīng)37℃減壓濃縮，揮去乙醇，得到浸膏。

RPMI培養(yǎng)基（Thermo Fisher Scientific公司）；胰蛋白酶、胎牛血清、過硫酸銨、MT（碧云天生物技術(shù)有限公司）；Cleaved Caspase-3 （D175）（5A1E）Rabbit、Cleaved Caspase-9 （D175）（5A1E）Rabbit（美國Cell Signaling Technology公司）；Annexin V-FITC/PI 雙染細胞凋亡檢測試劑盒（諾唯贊公司）；蛋白預(yù)染Marker（美國Bio-Rad公司）；PVDF蛋白轉(zhuǎn)移膜（美國Immobilon公司），其余試劑均為市售分析純。

1.2 細胞株與動物

LO2和HepG2，購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。

BALB/c-nu裸鼠，SPF級，4～5周齡，雌性，體質(zhì)量為19 ～ 21 g，由南京大學(xué)-南京生物醫(yī)藥研究所提供，正常飼養(yǎng)一周后開始實驗。

1.3 細胞培養(yǎng)

在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)人肝癌細胞HepG2及LO2人正常肝細胞，使用含10% 胎牛血清的常規(guī)培養(yǎng)液，細胞貼壁生長，使用顯微鏡觀察細胞生長情況，及時確認細胞是否能夠正常生長。當(dāng)細胞密度達80% ～ 90% 時，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗兩次，加入適量胰酶進行細胞消化，當(dāng)細胞形態(tài)變圓，細胞間隙擴大后，吸出胰酶，然后加入含有胎牛血清的培養(yǎng)基使細胞消化終止，輕輕吹打下細胞，吸取轉(zhuǎn)移到EP管，1 000 rpm 離心5 min后棄上清，用新鮮培養(yǎng)基重懸細胞，接種到新的無菌培養(yǎng)皿中，置于細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每2 ～ 3 d換液或傳代。

1.4 MTT比色法觀察美洲大蠊提取物對人肝癌細胞HepG2增殖的影響

取對數(shù)生長期的HepG2細胞及LO2細胞，按照前述步驟消化后，利用細胞計數(shù)儀或細胞計數(shù)板計數(shù)后，制成細胞混懸液，接種于96孔板中，每孔5 000個細胞。培養(yǎng)24 h后，實驗組分別加入培養(yǎng)基稀釋的200 μL美洲大蠊提取物至藥物終濃度分別為10、20、40、80 μg/mL，每個濃度設(shè)六個復(fù)孔，空白給藥組加入等體積培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，在試驗終止前4 h按照20 μL/孔加入MTT。到達終止時間點時時，用移液器移走上清，每孔中加入DMSO 150 μL，震蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。使用酶標儀進行比色，選擇570 nm波長檢測各孔OD值。計算細胞生長抑制率：細胞生長抑制率 （%） = （1－OD實驗組/OD對照組）×100%。重復(fù)進行5次同樣水平實驗，計算平均細胞生長抑制率，并采用Graphpad軟件計算IC50值。

1.5 流式細胞術(shù)檢測美洲大蠊提取物對HepG2細胞凋亡的影響

取對數(shù)生長期的HepG2細胞接種到六孔板中，每孔30萬細胞，待細胞貼壁后，給予不同濃度的美洲大蠊提取物并設(shè)置空白對照組，孵育48 h后，收集細胞，2 500 rpm離心5 min后棄上清，用PBS清洗2次，用500 μL 緩沖液混懸細胞，隨后加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，37 °C避光孵育30 min，流式細胞儀檢測細胞熒光。所得數(shù)據(jù)經(jīng)Flow Jo軟件處理，分析細胞凋亡率。

1.6 流式細胞術(shù)檢測美洲大蠊提取物對HepG2細胞周期的影響

取對數(shù)生長期的HepG2細胞接種到六孔板中，每孔25萬細胞。孵育24 h，然后加入美洲大蠊提取物，使終濃度分別為0、20、30、40、50 、60 μg/mL再處理48 h。收集細胞，用70% 冰乙醇4 ℃固定12 h。冰乙醇洗滌后，用染色緩沖液（根據(jù)細胞周期分析試劑盒配制）將細胞重懸。37 ℃孵育30 min 后，用流式細胞儀分析細胞樣本。

1.7 細胞凋亡機制研究

將HepG2細胞按照5 000個/孔的細胞密度接種于96孔板，37 ℃培養(yǎng)24 h。然后用0.1% DMSO、溶解在培養(yǎng)基中的z-VAD（50 μM）或壞死抑制素-1（50 μM）孵育細胞2 h，再用溶解在培養(yǎng)基中的美洲大蠊提取物（60 μg/mL）孵育細胞72 h，加入MTT（5 mg/mL）孵育4 h。棄去懸浮液后，加入DMSO（150 μL）溶解晶體。設(shè)置對照組美洲大蠊提取物濃度為0，空白組只加培養(yǎng)基、MTT和DMSO。使用酶標儀進行比色，在570 nm處檢測OD值。計算細胞存活率：細胞存活率（%）=（OD實驗組－OD空白組）/（OD對照組－OD空白組）×100%。

1.8 蛋白印跡法檢測Cleaved-Caspase-9、Cleaved-Caspase-3及Cleaved-PARP蛋白的表達

取對數(shù)生長期細胞，用不同濃度的美洲大蠊提取物預(yù)處理HepG2細胞48 h 后，胰酶消化，按照“1.3”項下方法收集細胞，2 500 rpm離心5 min 后棄上清液，并用預(yù)冷的PBS清洗兩遍，將細胞轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中。加入細胞裂解液（含有PMSF、磷酸酶抑制劑、蛋白酶抑制劑），冰上裂解20 min 或-80 ℃過夜，12 000 rpm離心10 min，丟棄沉淀物收集上清液并轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL離心管中，利用BCA法測定蛋白濃度，加入適量的2× 蛋白上樣緩沖液和裂解液來調(diào)整蛋白濃度，在100 ℃水浴鍋中煮10 min，最后放入-80 ℃冰箱保存。配制10% SDS-PAGE分離膠與濃縮膠，將電泳膠裝配到電泳槽后在樣品孔中加入合適體積的樣品，用適當(dāng)電壓進行凝膠電泳。使用半干轉(zhuǎn)系統(tǒng)將蛋白從凝膠上轉(zhuǎn)印于印跡膜上，TBST沖洗，封閉液封閉30 min。然后加入1∶ 1 000稀釋的一抗，放入4 ℃冰箱過夜后，洗膜，加入1∶5 000稀釋的二抗，置于搖床上平穩(wěn)振搖1 h，洗膜3次，顯色，照相。以Image J軟件定量分析各蛋白表達水平。

1.9 對荷瘤小鼠腫瘤生長作用的影響

培養(yǎng)足夠多的HepG2細胞，胰酶消化，按相同方法收集細胞，細胞計數(shù)儀計數(shù)后計算細胞總量，1 000 rpm離心5 min，棄去上清并用PBS清洗兩遍，用PBS混懸細胞并調(diào)整細胞密度為1×107/mL，將細胞混懸液置于冰盒并準備給小鼠接種。5周齡雌性無胸腺裸鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，用1 mL 無菌注射器給裸鼠后背部皮下注射200 μL細胞混懸液。當(dāng)腫瘤體積達到100 ～ 200 mm3時，將造模成功的荷瘤小鼠按照隨機分配原則分為5組，分別為對照組、索拉菲尼（20 mg/kg）組、美洲大蠊提取物低劑量組（50 mg/kg）、美洲大蠊提取物中劑量組（100 mg/kg）和美洲大蠊提取物高劑量組（200 mg/kg），每組6只。美洲大蠊提取物組每天灌胃注射50、100或200 mg/kg，索拉菲尼組每2 d灌胃一次，對照組用生理鹽水處理。每間隔3 d仔細記錄小鼠體質(zhì)量，肉眼觀察腫瘤大小，連續(xù)給藥21 d后處死小鼠。收集腫瘤標本稱量并用4%多聚甲醛固定，用于進一步病理切片和免疫組化分析。稱量離體瘤塊重量，計算各組抑瘤率：抑瘤率（%）=（模型組平均瘤重-實驗組平均瘤重）/模型組平均瘤重× 100%。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法

用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 MTT法檢測美洲大蠊提取物對HepG2肝癌細胞株及正常肝細胞LO2的抑制率

不同濃度美洲大蠊提取物作用于正常肝細胞72 h，經(jīng)MTT檢測，IC50＞ 2 000 μg/mL，無明顯的增殖抑制作用；而不同濃度美洲大蠊提取物作用于肝癌細胞HepG2 72 h后顯示了一定抑制作用，IC50為（41.29±1.3 ）μg/mL。表明美洲大蠊提取物具有較好的抗肝癌活性，同時對正常細胞毒性較小，為下一步實驗提供了濃度參考。

2.2 美洲大蠊提取物對HepG2細胞的凋亡誘導(dǎo)作用

Annexin-V可以檢測細胞凋亡的早期階段，其與碘化丙啶（PI）雙染色可以區(qū)分凋亡細胞與壞死細胞。通過 AnnexinVFITC/PI 雙染色法使用流式細胞儀檢測美洲大蠊提取物檢測人肝癌細胞HepG2凋亡，結(jié)果顯示，美洲大蠊提取物作用于人肝癌細胞 48 h 后，其對HepG2細胞具有凋亡誘導(dǎo)作用，且呈現(xiàn)劑量依賴性，見圖1。

圖1 美洲大蠊提取物對HepG2細胞凋亡的影響（±s，n = 3）Fig. 1 Effect of Periplaneta americana extracts on apoptosis of HepG2 cells（±s，n = 3）

2.3 美洲大蠊提取物對HepG2細胞的周期阻滯作用

美洲大蠊提取物作用于肝癌細胞HepG2后，通過流式細胞術(shù)檢測提取物對HepG2的周期阻滯作用，由實驗結(jié)果可知，隨著作用時間的延長，S期細胞明顯減少，美洲大蠊提取物可以將 HepG2細胞阻滯在G2/M期，且呈現(xiàn)劑量依賴性，見圖2。

圖2 美洲大蠊提取物對HepG2細胞周期分布的影響（±s，n = 3）Fig. 2 Effects of Periplaneta americana extracts on cell cycle distribution of HepG2 cells（±s，n = 3）

2.4 美洲大蠊提取物對HepG2細胞的凋亡機制研究

Caspase抑制劑Z-VAD（Caspase Inhibitor Z-VAD）是一種泛Caspase抑制劑，其作用效果為抑制由Caspase激活導(dǎo)致的細胞凋亡，可用于觀察特定的細胞凋亡是否通過Caspase激活來介導(dǎo)。使用壞死性凋亡抑制劑Nec-1和泛Caspase抑制劑Z-VAD共同孵育發(fā)現(xiàn)，加入壞死性凋亡抑制劑后，HepG2細胞存活率沒有顯著改變，加入Z-VAD后，存活率有明顯提升（P＜0.001），說明美洲大蠊提取物誘導(dǎo)HepG2的死亡依賴于Caspase途徑，見圖3。

圖3 美洲大蠊提取物對HepG2細胞的凋亡機制研究（±s，n = 3）Fig. 3 Study on the apoptosis mechanism of Periplaneta americana extracts on HepG2 cells（±s，n = 3）

2.5 美洲大蠊提取物對HepG2細胞的凋亡機制Caspase途徑研究

Caspase 家族屬于半胱氨酸蛋白酶，通常以酶原形式存在，是由兩大、兩小亞基兩兩組成的異四聚體，主要負責(zé)選擇性地切割某些蛋白質(zhì)，從而造成細胞凋亡。一旦信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑被激活，Caspase則被活化，隨后發(fā)生凋亡蛋白酶的級聯(lián)反應(yīng)。Caspase包括啟動Caspase（Caspase-8、Caspase-9、Caspase10）和執(zhí) 行Caspase（Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7）兩類。發(fā)揮作用時，在接收促凋亡刺激信號時啟動Caspase裂解激活執(zhí)行Caspase，被激活的執(zhí)行Caspase最后使Caspase靶蛋白水解而引起細胞程序性死亡[15]。

通過Western Blotting實驗表明，美洲大蠊提取物可以激活程序凋亡啟動子Caspase 9，進而激活程序凋亡執(zhí)行子Caspase 3。PARP（聚腺苷二磷酸核糖聚合酶）是Caspase的切割底物，最終表現(xiàn)為Cleaved PARP增加，意味著通過線粒體Caspase途徑誘導(dǎo)人肝癌細胞凋亡，見圖4。此結(jié)果與凋亡機制研究及流式細胞術(shù)結(jié)果一致，提示美洲大蠊提取物對HepG2的凋亡誘導(dǎo)作用確實是依賴于Caspase依賴的程序性凋亡途徑。

圖4 美洲大蠊提取物對HepG2細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響（±s，n = 3）Fig. 4 Effects of Periplaneta americana extracts on expression of apoptosis-related proteins in HepG2 cells（±s，n = 3）

2.6 美洲大蠊提取物對荷瘤小鼠腫瘤生長的抑制作用

體外實驗證明美洲大蠊提取物有一定的抗肝癌活性，為進一步檢測其在體內(nèi)抗肝癌活性，建立HepG2 異種移植裸鼠模型，并通過灌胃方式給藥。美洲大蠊提取物中、高劑量組顯示出有效的抗腫瘤效應(yīng)，它明顯降低了腫瘤的質(zhì)量（P＜0.05），見表2。與對照組相比，給藥組裸鼠的體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表3。說明美洲大蠊提取物對小鼠沒有明顯的毒性。為了研究美洲大蠊提取物對腫瘤組織的影響，對腫瘤組織進行蘇木精-伊紅染色和免疫組化分析。與對照組相比，美洲大蠊提取物給藥組（200 mg/kg）腫瘤組織出現(xiàn)壞死。免疫組化結(jié)果顯示，美洲大蠊提取物能夠誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，見圖5。

表2 美洲大蠊提取物對HepG2 荷瘤小鼠腫瘤的作用（±s，n = 6）Tab. 2 The effect of Periplaneta americana extracts on HepG2 tumorbearing mice（±s， n = 6）

表2 美洲大蠊提取物對HepG2 荷瘤小鼠腫瘤的作用（±s，n = 6）Tab. 2 The effect of Periplaneta americana extracts on HepG2 tumorbearing mice（±s， n = 6）

注：與對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

組別 劑量/（mg/kg） 瘤重/g 抑瘤率/%對照組 0 0.67±0.13 0索拉菲尼組 25 0.23±0.07*** 65.67±6.02***美洲大蠊提取物低劑量組50 0.57±0.09 14.93±4.14美洲大蠊提取物中劑量組100 0.48±0.13* 28.36±5.81*美洲大蠊提取物高劑量組200 0.36±0.09*** 46.27±4.58***F 17.04 14.66 P 0.000 0.000

表3 美洲大蠊提取物對HepG2 荷瘤小鼠體質(zhì)量的影響（±s，n = 6）Tab. 3 The effect of Periplaneta americana extracts on body weight of HepG2 tumor-bearing mice（±s，n = 6）

表3 美洲大蠊提取物對HepG2 荷瘤小鼠體質(zhì)量的影響（±s，n = 6）Tab. 3 The effect of Periplaneta americana extracts on body weight of HepG2 tumor-bearing mice（±s，n = 6）

組別 劑量/（mg/kg）實驗前體質(zhì)量/g實驗后體質(zhì)量/g體質(zhì)量增長率/%對照組 0 19.90±0.37 21.90±0.99 10.05±1.52索拉菲尼組 25 19.30±0.23 21.00±2.15 8.81±1.75美洲大蠊提取物低劑量組50 19.00±1.05 21.90±1.70 15.26±0.87美洲大蠊提取物中劑量組100 20.03±0.82 22.97±1.51 14.68±1.78美洲大蠊提取物高劑量組200 20.30±0.39 22.60±1.96 11.33±2.01 F 128.36 43.71 88.91 P 0.599 0.295 0.383

圖5 H＆E染色及美洲大蠊提取物對HepG2荷瘤裸鼠腫瘤組織蛋白表達的影響（200×）Fig. 5 H＆E staining and effects of Periplaneta americana extract on protein expression in tumor tissues of HepG2 tumor-bearing nude mice（200×）

3 討論

研究證實美洲大蠊提取物可通過線粒體途徑誘導(dǎo)人肝癌細胞Bel-7402凋亡[17]。細胞凋亡作用在許多其它類型的癌癥中實現(xiàn)有前景的抗癌作用，因此研究細胞凋亡機制是抑制腫瘤發(fā)展和有效治療的重要策略[18]。本實驗發(fā)現(xiàn)，美洲大蠊提取物對HepG2肝癌細胞具有明顯的增殖抑制作用，還可誘導(dǎo)HepG2細胞凋亡。真核生物有規(guī)律的細胞周期，可分為G1、S、G2和M期。研究還發(fā)現(xiàn)，美洲大蠊提取物可使G2/M期細胞聚集，從而破壞了HepG2細胞的規(guī)律細胞分裂周期，因此美洲大蠊提取物可以引起HepG2細胞G2/M期阻滯。

細胞凋亡與細胞壞死有明顯區(qū)別。使用壞死性凋亡抑制劑Nec-1和泛Caspase抑制劑Z-VAD共同孵育發(fā)現(xiàn)，加入壞死性凋亡抑制劑后，HepG2存活率沒有明顯改變，而加入泛Caspase抑制劑Z-VAD后，存活率有了明顯提升，說明美洲大蠊提取物誘導(dǎo)HepG2的死亡至少部分是依賴于Caspase途徑的。Caspase導(dǎo)致的細胞凋亡主要分為外在死亡受體途徑和內(nèi)在線粒體途徑[19]。有研究發(fā)現(xiàn)，被激活的Caspase3是線粒體凋亡途徑與死亡受體途徑的交匯點，其作用是在凋亡啟動時剪切其底物PARP，引起級聯(lián)反應(yīng)，細胞發(fā)生凋亡，剪切后變構(gòu)的PARP又可激發(fā)其它Caspase家族蛋白水解[20]。免疫印跡實驗顯示，美洲大蠊提取物可以激活程序凋亡啟動子Caspase 9，進而激活程序凋亡執(zhí)行子Caspase 3，最終表現(xiàn)為Cleaved PARP增加，意味著細胞凋亡增加。表明美洲大蠊提取物可能是通過Caspase途徑誘導(dǎo)細胞凋亡，動物免疫組化實驗也證實了這一點。

4 結(jié)論

美洲大蠊提取物能夠有效抑制HepG2肝癌細胞增殖，誘導(dǎo)HepG2細胞凋亡，使細胞發(fā)生G2/M期阻滯，通過激活程序凋亡啟動子Caspase 9，進而激活程序凋亡執(zhí)行子Caspase 3，誘導(dǎo)細胞凋亡。因此美洲大蠊提取物通過介導(dǎo)內(nèi)在線粒體途徑誘導(dǎo)細胞凋亡，而外源性途徑是否參與凋亡，還需進一步進行相應(yīng)研究。體內(nèi)實驗表明，美洲大蠊提取物能夠明顯抑制荷瘤小鼠腫瘤生長，且對器官沒有明顯毒性。因此，美洲大蠊提取物在體內(nèi)外均可抑制肝癌HepG2細胞增殖，對其抗肝癌機制進行了初步研究，仍需全面深入探索，以對其臨床廣泛應(yīng)用提供依據(jù)。