卜 超，洪 燕，王學(xué)芹，顧從文，張 偉，韓燕全*

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 國家中醫(yī)藥管理局中藥制劑三級(jí)實(shí)驗(yàn)室/中藥復(fù)方安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/現(xiàn)代藥物制劑安徽省工程技術(shù)中心，安徽 合肥 230012；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，安徽 合肥 230031）

重樓是我國傳統(tǒng)的名貴中藥材，為百合科植物云南重樓Paris polyphyllaSmith var.yunnanensis（Franch.）Hand.-Mazz.或七葉一枝花Paris polyphyllaSmith var.chinensis（Franch.）Hara的 干 燥 根 莖[1]，《本草綱目》中曾對(duì)其記載：“蛇蟲之毒，得此治之即休”[2]。重樓除了治療蛇蟲之毒屢見其效，還具有清熱解毒、止血鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗氧化等作用[3-6]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)甾體皂苷類是重樓的主要活性成分[7]，分別為異螺甾烷醇類（isospirostanol）、螺甾烷醇類（spirostanol）、呋甾烷醇類（furostanol）和變形螺甾烷醇類（pseudospirostanol），具有抗腫瘤、抗菌消炎、止血消腫、抗氧化、保肝等功效?？茖W(xué)研究表明，癌癥、衰老或其它疾病大多與過量自由基的產(chǎn)生有關(guān)聯(lián)，所以對(duì)抗氧化的研究可以有效克服其所帶來的危害。課題組前期研究表明重樓總皂苷部位具有較好的抗肝纖維化動(dòng)物的氧化應(yīng)激作用，但是其具體抗氧化的成分尚不清楚[8]。

譜-效關(guān)系是通過統(tǒng)計(jì)分析方法將指紋圖譜與藥效學(xué)關(guān)聯(lián)起來，能夠明確具有藥效作用的物質(zhì)基礎(chǔ)[9-10]，其廣泛應(yīng)用于中藥材、復(fù)方制劑的質(zhì)量和藥效評(píng)價(jià)。目前對(duì)于重樓的藥效研究主要集中在抗腫瘤、止血等方面，文獻(xiàn)研究表明重樓總皂苷部位具有較明確的抗氧化活性[11]，但具體與哪些成分相關(guān)，研究還較少。基于此，本研究采用正丁醇萃取法得到重樓正丁醇部位，測(cè)定出總皂苷含量，同時(shí)，建立重樓正丁醇部位的UPLC指紋圖譜；采用DPPH法和ABTS法測(cè)定其抗氧化活性，通過皮爾遜相關(guān)分析法和逐步回歸分析法研究其譜-效關(guān)系，以期為進(jìn)一步闡明重樓正丁醇部位的皂苷類成分抗氧化活性的物質(zhì)基礎(chǔ)和重樓皂苷質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters Acquity H-Class型超高效液相色譜儀（美國Waters公司）；ME55型分析天平[梅特勒-托利（上海）有限公司]；1510-02261C 型酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；KQ3200DB型超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；GL-88B型渦旋混合器（其林貝爾儀器制造公司）；KDC-16H型離心機(jī)（科大創(chuàng)新股份有限公司）；BZF-6050型真空干燥箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）；17070063型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）。

1.2 試藥

重樓干燥根莖分別收集于不同地區(qū)，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)謝冬梅副教授鑒定，為百合科植物云南重樓Paris polyphylla Smithvar.yunnanensis（Franch.）Hand.-Mazz.或七葉一枝花Paris polyphyllaSmith var.chinensis（Franch.）Hara的干燥根莖，具體樣品信息見表1。

表1 重樓飲片產(chǎn)地信息Tab. 1 Origin information of Paridis Rhizoma

重樓皂苷Ⅰ（批號(hào)：DST201206-027，純度≥98%），重樓皂苷Ⅱ（批號(hào)：DST201105-028，純度≥98%），重樓皂苷Ⅵ（批號(hào)：DST200210-029，純度≥98%），重樓皂苷Ⅶ（批號(hào)：DSTDC003001，純度≥98%），薯蕷皂苷（批號(hào)：DST200114-005，純度≥98%）以上對(duì)照品均購自成都德思特生物技術(shù)有限公司；1，1-二苯基-2-苦基苯肼（批號(hào)：30931-67-0，上海源葉生物科技有限公司）；屈臣氏純凈水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）；過硫酸鉀（K2S2O8）（批號(hào)：XK 13-011-00008，天津河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠）；色譜級(jí)乙腈（Tedia,美國）；正丁醇（批號(hào)：920915，蕪湖日新化工）；高氯酸（批號(hào)：20030801-1，廣州化學(xué)試劑廠）；2，2-聯(lián)氮基（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二氮鹽（批號(hào)：TN1121CB14，上海笛柏生物科技有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 正丁醇部位的制備

將12個(gè)批次的重樓飲片分別打粉，過40目篩，各稱取50 g，加入70%的乙醇300 mL回流提取1 h，同法再提取40 min，將兩次過濾后的提取液混合搖勻，減壓旋蒸法蒸去乙醇，萃取三次（濃縮液與正丁醇的比例為1∶1.5），回收正丁醇，濃縮至干得到12批重樓正丁醇部位。

2.2 重樓總皂苷含量測(cè)定

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取6.65 mg薯蕷皂苷元對(duì)照品于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，制備成濃度為0.266 mg/mL的溶液。

2.2.2 總皂苷含量測(cè)定的樣品制備 精密稱定12批重樓的正丁醇部位20 mg于25 mL容量瓶中，加入甲醇定容，超聲溶解得到12批樣品溶液。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線 分別準(zhǔn)確量取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8 mL對(duì)照品溶液到10 mL容量瓶中，各加入高氯酸5.0 mL，并加甲醇定容，置60℃的水浴中顯色25 min，冷卻，以甲醇溶液為空白，在408 nm處分別測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)（Y）對(duì)濃度為橫坐標(biāo)（X，mg/mL）繪制曲線，回歸方程為：Y=0.016 33X- 0.005 8，回歸系數(shù)R2= 0.999 4。

2.2.4 精密度試驗(yàn) 準(zhǔn)確量取“2.2.1”項(xiàng)下薯蕷皂苷元對(duì)照品溶液0.4 mL于10 mL試管中，加入高氯酸5.0 mL，置60℃水浴中顯色25 min，冷卻，測(cè)定6次，RSD為0.26%，表明儀器精密度良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱定S10重樓正丁醇部位20 mg，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備為供試品溶液，測(cè)定0、10、20、30、40、60 min的吸光度值，結(jié)果RSD為0.35%，表明溶液在60 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 準(zhǔn)確量取S10重樓正丁醇部位20 mg 6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，分別測(cè)其吸光度值，結(jié)果RSD為2.22%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.7 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取S10重樓正丁醇部位6份，每份10 mg，分別加入4.52 mg/mL薯蕷皂苷元對(duì)照品1 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，測(cè)定并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab. 2 Average recoveries results

2.2.8 總皂苷含量測(cè)定 參考文獻(xiàn)[10]方法，準(zhǔn)確量取12批樣品溶液各0.3 mL分別于10 mL試管中，加入高氯酸5.0 mL，置60℃水浴中顯色25 min，冷卻，分別測(cè)其吸光度值并計(jì)算其含量，結(jié)果顯示總皂苷含量在41.21% ～ 47.99%，計(jì)算其RSD為5.30%，表明12批重樓正丁醇部位的總皂苷含量具有一定的差異，具體見表3。

表3 12批重樓正丁醇部位UPLC圖譜相似度及含量Tab. 3 UPLC similarity and content of n-butanol parts in 12 batches of Paridis Rhizoma

2.3 重樓正丁醇部位指紋圖譜的建立

2.3.1 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱定重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅶ對(duì)照品適量，加甲醇配制成濃度分別為0.025 6 mg/mL、0.025 2 mg/mL、0.056 2 mg/mL、0.060 2 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.3.2 供試品的制備 精密稱定“2.1”中重樓正丁醇部位各50 mg置5 mL容量瓶，加甲醇定容，超聲溶解，0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3.3 色譜條件 Waters Acquity BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-水（B），洗脫程序：0 ～ 2 min，5% → 25%A；2 ～6 min，25%A；6 ～ 11 min，25% → 50%A；11 ～ 13 min，50% → 70%A；13 ～ 15 min，70% → 100%A；15 ～17 min，100%A，流速：0.20 mL/min，柱溫：30 ℃，檢測(cè)波長：203 nm。

2.3.4 方法學(xué)考察 （1） 精密度試驗(yàn) 取S10供試品溶液，按“2.3.3”項(xiàng)下方法重復(fù)進(jìn)樣6次，結(jié)果各色譜峰保留時(shí)間和峰面積基本一致，相似度均大于0.999（中位數(shù)），表明儀器精密度良好。

（2） 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取S10供試品溶液，在“2.3.3”項(xiàng)方法下分別在0、2、4、8、10、12、24 h進(jìn)樣，得到相似度均大于0.998（中位數(shù)），表明樣品穩(wěn)定性良好。

（3） 重復(fù)性試驗(yàn) 取6份重樓正丁醇部位按照“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3.3”項(xiàng)方法下進(jìn)樣，結(jié)果相似度均大于0.996（中位數(shù)），表明此方法重復(fù)性良好。

2.3.5 指紋圖譜中的共有峰指認(rèn) 將12批供試品溶液和混合對(duì)照品溶液，在“2.3.3”項(xiàng)方法下依次進(jìn)樣檢測(cè)，結(jié)果導(dǎo)入“指紋圖譜相似度軟件2004（A）版”，生成重樓共有模式的對(duì)照指紋圖譜，其中共有峰14個(gè)。通過比對(duì)保留時(shí)間，確定6號(hào)峰為重樓皂苷Ⅶ、7號(hào)峰為重樓皂苷Ⅵ、11號(hào)峰為重樓皂苷Ⅱ、12號(hào)峰為重樓皂苷Ⅰ。

圖1 重樓皂苷混合對(duì)照品（A）和重樓正丁醇部位的UPLC圖譜共有峰色譜圖（B）Fig. 1 The common peaks UPLC fingerprints of mixed reference substance （A） and n-butanol fraction of Paridis Rhizoma （B）

2.3.6 指紋圖譜相似度評(píng)價(jià) 將所得的12組供試品溶液的圖譜導(dǎo)入“指紋圖譜相似度軟件2004（A）版”，得到指紋圖譜疊加圖見圖2，相似度結(jié)果見表3，共有峰的相對(duì)峰面積和RSD見表4。結(jié)果12批重樓正丁醇部位的色譜峰相似度均大于0.958，12批重樓正丁醇部位的14個(gè)共有色譜峰相對(duì)峰面積RSD差異較明顯，最大達(dá)到26.75%，表明其皂苷的含量有一定差異。

表4 12批重樓正丁醇部位指紋圖譜共有色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積Tab. 4 The relative retention time, relative peak area of chromatographic peaks of 12 batches of n-butanol chromatographic fingerprints

圖2 12批重樓正丁醇部位UPLC疊加圖譜Fig. 2 UPLC atlas of n-butanol parts in 12 batches of Paridis Rhizoma

2.4 體外抗氧化實(shí)驗(yàn)

2.4.1 清除DPPH自由基能力 參考張靜等[8]的方法，用70%的乙醇配制濃度25.5 mg/L的DPPH自由基溶液。取12批樣品溶液各1 mL，加入DPPH溶液5 mL，混合避光反應(yīng)30 min，在517 nm測(cè)定吸光度Ai；對(duì)照組為1 mL樣品溶液與70%乙醇5 mL混合均勻，測(cè)定的A值記為A1；空白組以5 mL DPPH溶液與1 mL甲醇混合，測(cè)定的A值記為A0。通過公式清除率（SH）＝[1-（Ai－A1）÷A0]×100%計(jì)算重樓總皂苷的抗氧化能力。以清除百分率（%）為縱坐標(biāo)，樣品濃度C（μg/mL）為橫坐標(biāo)，制作擬合曲線，根據(jù)擬合方程計(jì)算重樓正丁醇部位抗氧化的IC50值。結(jié)果顯示，12批重樓正丁醇部位的IC50值在1.031～1.284，具體見表5。

2.4.2 清除ABTS自由基能力 參考徐坤勇等[12]的方法，取7.5 mmol/L的ABTS溶液1.50 mL與2.6 mmol/L過硫酸鉀溶液2.86 mL混合，置于暗處孵育15 h，加入去離子水稀釋，在波長734 nm處其A值為0.700±0.005（0.702、0.703、0.704）。分 別 取12批樣品溶液50 μL與ABTS溶液200 μL于96孔板中，在室溫下反應(yīng)6 min后測(cè)量反應(yīng)物在734 nm處的Ai值，對(duì)照組以200 μL去離子水與50 μL的樣品溶液混合均勻，測(cè)定吸光度值A(chǔ)1?？瞻捉M則以200 μL ABTS溶液與50 μL甲醇混合均勻，測(cè)定吸光度值A(chǔ)0。通過公式清除率（SH）＝[1-（Ai－A1）÷A0]×100%，計(jì)算重樓總皂苷抗氧化能力。以清除百分率（%）為縱坐標(biāo)，樣品濃度C（μg /mL）為橫坐標(biāo)，制作擬合曲線，根據(jù)擬合方程計(jì)算重樓正丁醇部位抗氧化的IC50值。結(jié)果顯示12批重樓正丁醇部位的IC50值在1.079～1.325，具體見表5。

表5 抗氧化實(shí)驗(yàn)IC50值Tab. 5 IC50 values of anti-oxidant test

2.5 譜-效相關(guān)分析

2.5.1 皮爾遜相關(guān)分析 對(duì)14個(gè)共有峰面積與12批重樓正丁醇部位的IC50，采用SPSS 26.0軟件，進(jìn)行雙變量分析，見表6。由表6得出，峰6、峰11、峰12與抗氧化活性相關(guān)性很高（P＜0.01），且呈正相關(guān)。通過與重樓對(duì)照品分析，峰6為重樓皂苷Ⅶ、峰11為重樓皂苷Ⅱ，峰12為重樓皂苷Ⅰ。此結(jié)果反應(yīng)出這3個(gè)成分為發(fā)揮抗氧化活性的物質(zhì)基礎(chǔ)。

表6 共有峰與抗氧化活性成分的相關(guān)系數(shù)Tab. 6 Correlation coefficient between common peaks and anti-oxidant active components

2.5.2 逐步回歸分析 以IC50值和共有峰面積分別作為因變量和自變量，采用SPSS 26.0軟件，進(jìn)行逐步回歸分析，得到方差分析表（表7）和回歸系數(shù)分析表（表8）。由表7得出顯著性P＜0.05，可以說明整體存在顯著的回歸模型，共有峰面積對(duì)IC50值具有明顯的預(yù)測(cè)作用，證明重樓正丁醇部位的指紋圖譜峰與其抗氧化活性之間存在明顯的線性關(guān)系。由表8得出6號(hào)峰和11號(hào)峰與抗氧化活性呈現(xiàn)正相關(guān)（P≤0.01），6號(hào)峰為重樓皂苷Ⅶ，12號(hào)峰為重樓皂苷Ⅰ。得到的結(jié)果與皮爾遜相關(guān)分析一致，而逐步回歸分析結(jié)果中沒有表明重樓皂苷Ⅱ與抗氧化作用具有相關(guān)性，因此對(duì)于重樓皂苷Ⅱ的抗氧化作用還需進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。

表7 方差分析表Tab. 7 Analysis of variance table

3 討論

中藥是多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的復(fù)雜體系，研究成分與靶點(diǎn)的協(xié)同作用存在一定的難度，譜-效關(guān)系即在中藥指紋圖譜與藥效研究的基礎(chǔ)上，通過數(shù)據(jù)分析方法建立指紋圖譜與藥效之間的關(guān)系，揭示了化學(xué)成分與藥效之間的相互關(guān)系，明確了發(fā)揮作用的具體活性成分。譜-效關(guān)系已成為了現(xiàn)代中藥研究的熱點(diǎn)，并廣泛應(yīng)用于中藥的質(zhì)量控制。

重樓中的主要有效成分為甾體皂苷類成分，現(xiàn)代研究表明，此類成分具有酚羥基，可與自由基反應(yīng)形成穩(wěn)定半酮式自由基結(jié)構(gòu)，從而終止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，起到抗氧化的作用[13]；YAN S等[14]研究證實(shí)重樓皂苷類成分能夠通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯，抑制環(huán)氧化酶-2通路發(fā)揮抗氧化作用。測(cè)定體外抗氧化能力的方法現(xiàn)如今已有許多種，例如二苯基苦基苯肼（DPPH）法、鄰苯三酚自氧化（Pyrogallol autoxidation）法、羥基自由基清除能力法、ABTS（ABTS assay）法、鐵離子還原/抗氧化能力測(cè)定（Ferric reducing anti-oxidant power, FRAP）法等。本實(shí)驗(yàn)選取了ABTS法和DPPH法，以綜合比較重樓皂苷的抗氧化能力，且這二種方法的原理都以清除自由基來測(cè)定抗氧物質(zhì)的抗氧化能力，因其方法快速、便捷，成為了目前使用最多的方法。因此，實(shí)驗(yàn)采用ABTS法、DPPH法驗(yàn)證了重樓的正丁醇部位具有較強(qiáng)的體外抗氧化能力，同時(shí)，采用皮爾遜法和逐步回歸法對(duì)譜效關(guān)系進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷Ⅰ與抗氧化活性成顯著正相關(guān)，可能是重樓起到抗氧化作用的主要活性成分。皮爾遜法分析得到的重樓皂苷Ⅱ與抗氧化活性的相關(guān)性在逐步回歸法中沒有體現(xiàn)，此結(jié)果可能與兩種分析方法存在差異有關(guān)，而現(xiàn)代已有研究表明重樓皂苷Ⅱ具有抗氧化作用[15-16]，因此，關(guān)于重樓正丁醇部位抗氧化活性還需后期動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

本實(shí)驗(yàn)在文獻(xiàn)基礎(chǔ)上，對(duì)重樓正丁醇部位的乙醇回流提取、正丁醇萃取和樣品處理?xiàng)l件等實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化，最終得到較穩(wěn)定的提取、萃取和樣品處理?xiàng)l件。參考課題組前期方法，實(shí)驗(yàn)對(duì)總皂苷測(cè)定的紫外分光光度法條件進(jìn)行了優(yōu)化和改進(jìn)；本實(shí)驗(yàn)根據(jù)前期對(duì)條件的優(yōu)化采用了甲醇超聲溶解的方法，實(shí)驗(yàn)中考察了不同洗脫條件、流動(dòng)相配比、不同柱溫、不同流速及不同型號(hào)的色譜柱，經(jīng)過優(yōu)化確定以乙腈-水溶液為流動(dòng)相，Waters Acquity BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7μm）為色譜柱，柱溫為30℃，在此條件下測(cè)定的各色譜峰分離度較好，峰形較好且基線平穩(wěn)。最終得到較理想的指紋圖譜測(cè)定條件，這為重樓正丁醇部位的整體性質(zhì)量評(píng)價(jià)方法提供了參考。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)成功建立了重樓正丁醇部位的UPLC指紋圖譜，指認(rèn)了14個(gè)共有峰，通過譜-效關(guān)系相關(guān)性研究，明確了其中3種成分可能是重樓正丁醇部位抗氧化活性的物質(zhì)基礎(chǔ)，實(shí)驗(yàn)為后續(xù)建立化學(xué)特征關(guān)聯(lián)功效活性的評(píng)價(jià)方法來評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地重樓的質(zhì)量奠定了基礎(chǔ)。后期還需對(duì)其它色譜峰進(jìn)行進(jìn)一步的定性歸屬，同時(shí)，需要通過整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證重樓皂苷的抗氧化作用及其量-效關(guān)系。