盧昱希，程搏幸，趙 宇，張 濤，唐遠江，陶小燕，周思旋，劉 飛

（1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，貴州 貴陽 550002；2. 貴州師范學(xué)院 生物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550018；3. 鹽城工學(xué)院 海洋與生物工程學(xué)院，江蘇 鹽城 224051）

水蛭Hirudo nipponica隸屬于無吻蛭目Arhynchobdellida Blanchard，醫(yī)蛭科Hirudinidae Whitman，醫(yī)蛭屬HirudoLinnaeus。作為2020年版《中國藥典》收錄的水蛭藥材的基原動物[1]，水蛭在我國分布廣泛，通常棲息于常年積水或排水不良的水田及與其相通的溝渠、池塘和沼澤中，靠吸食動物的新鮮血液為生[2]。近二十年來，隨著對水蛭研究的深入，發(fā)現(xiàn)其體內(nèi)含有多種藥用活性成分。具有凝血酶抑制功效的大分子化合物水蛭素（Hirudin）[3-4]、具有抗凝活性的多肽New Leech Protein-1（NLP-1）[5]和螞蟥寡肽-1（Whitide-1）[6]能抑制血小板聚集的多肽Saratin[7]、Decorsin[8]以及具有藥用活性的蛋白酶抑 制 劑Destabilase[9]、Guamerin[10]、Bdellin-HM-2[11]、Hirudinaria manil-lensis[12]、Heparin cofactor II[13]等多種活性成分已被鑒定并從水蛭中分離出來。越來越多的研究表明水蛭具有抗凝血[14]、溶血栓[15]、抗炎[16]等藥用功效，可應(yīng)用于心腦血管疾病的治療[17]，藥用價值潛力巨大。

一直以來，水蛭作為我國一味傳統(tǒng)中藥，其研究主要集中在抗凝血活性及機理方面，有關(guān)其抗菌活性的研究鮮見報道。但隨著對水蛭研究的深入，研究人員發(fā)現(xiàn)水蛭不僅會分泌水蛭素以防止血液凝固，在其攝食和儲食過程中，還會分泌其它生物活性物質(zhì)以防止血液中外來病原體入侵，且這些活性物質(zhì)中含有大量蛋白，能有效抑制革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌[18-19]?；谏鲜鲅芯浚狙芯恳运蜨irudo nipponica作為實驗材料，從其轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選到1條與抗菌生物活性相關(guān)的基因序列，克隆水蛭chitotriosidase-1-like基因的cDNA 全長序列，構(gòu)建原核表達載體并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達菌株進行表達，得到重組蛋白后進行抑菌活性測定，并分析該基因在水蛭不同攝食期表達規(guī)律，為后期深入研究chitotriosidase-1-like基因生物學(xué)功能及水蛭攝食、儲食機理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用水蛭來源于貴州省黔南布依族苗族自治州荔波縣境內(nèi)，經(jīng)貴州師范學(xué)院程搏幸副教授鑒定為水蛭藥材的基原動物水蛭H.nipponica。養(yǎng)殖30 d后，取外表健康、體質(zhì)量0.5 g左右的水蛭，一部分水蛭在冰上無菌解剖，取出水蛭唾液腺組織，儲存于-80℃冰箱，用于提取總RNA；另一部分水蛭讓其飽食新鮮血液1次，并按上述方法分別采取攝食前、攝食中、攝食后第1天、攝食后第2天、攝食后第3天、攝食后第5天、攝食后第7天、攝食后第9天、攝食后第12天、攝食后第15天水蛭唾液腺組織，儲存于-80℃冰箱，用于測定chitotriosidase-1-like基因相對表達量。

1.2 菌種與載體

大腸桿菌菌株TOP 10、大腸桿菌表達菌株BL21（DE3）來自貴州師范學(xué)院生物科學(xué)學(xué)院實驗室保存，實驗用大腸桿菌25922、金黃色葡萄球菌6538、沙門氏菌13076來自貴州省畜牧獸醫(yī)研究所實驗室保存，均為標準菌株。

1.3 試劑

RNAiso Plus總RNA 提 取 試 劑、PrimeScript?II 1st Strand cDNA Synthesis Kit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TB Green? Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNase Plus）熒 光定量試劑盒均購于寶生物工程（大連）有限公司；pEASY-Blunt Cloning Kit平端克隆載體試劑盒購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；FastPure? Gel DNA Ex-traction Mini Kit膠回收試劑盒、Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase高保真酶等購于南京喏唯贊生物科技股份有限公司；DNA膠純化試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購于愛思進生物技術(shù)（杭州）有限公司；（AXYGEN）Protein Marker購于賽默飛世爾科技有限公司（Thermo）；IPTG、Acr、Bis、Tris購于默克科學(xué)技術(shù)有限公司（Sigma）；SDS購于Amresco公司，TEMED購于BIO-RAD公司；限制性內(nèi)切酶購于寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司（TaKaRa）；Pfu DNA聚合酶購于南京鐘鼎生物有限公司；Tyrptone、Yeast Extract購于OXOID公司，Agarose購于上?；蚬荆?.22 μm無菌濾器和透析帶購于密理博公司（Millipore）；Ni-IDA親和層析膠購于安諾倫（北京）生物科技有限公司（Novagen）；LB培養(yǎng)基購于上海生工生物有限公司，其它試劑均為國產(chǎn)分析純或化學(xué)純。

1.4 基因數(shù)據(jù)獲取

在水蛭唾液腺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫（SRP151118）中篩選到1條轉(zhuǎn)錄本序列，該序列比對到鴨嘴海豆芽Lingula anatina的chitotriosidase-1基 因 序 列，E值為6.0×10-138。本研究將該序列作為研究對象，命名為chitotriosidase-1-like。

1.5 總RNA的提取

按照RNAiso Plus總RNA 提取試劑操作步驟提取水蛭唾液腺總RNA，經(jīng)1.0%凝膠電泳與微量分光光度計檢驗，將質(zhì)量合格的總RNA通過PrimeScript?II 1st Strand cDNA Synthesis Kit 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，供克隆使用。

1.6 chitotriosidase-1-like基因的克隆

利 用DNAMAN設(shè) 計chitotriosidase-1-like基 因cDNA擴增引物，上、下游引物見表1。以水蛭唾液腺cDNA為模版，運用Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase高保真酶對chitotriosidase-1-like基因進行PCR擴增，1.5%凝膠電泳檢驗PCR產(chǎn)物，使用FastPure? Gel DNA Extraction Mini Kit膠回收試劑盒對條帶大小正確的DNA片段進行膠回收，按照pEASYBlunt Cloning Kit平端克隆載體試劑盒操作說明，將膠回收后的目的片段連接到克隆載體上，轉(zhuǎn)入克隆用大腸桿菌，將陽性克隆送至上海生工公司測序。

表1 水蛭chitotriosidase-1-like基因克隆及熒光定量所用引物Tab. 1 Primer for clone and fluorescence quantitation of chitotrosidase-1-like gene in Hirudo nipponica

1.7 chitotriosidase-1-like基因序列的生物信息學(xué)分析

在NCBI在線網(wǎng)站中，利用ORF Finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）查找該基因開放閱讀框（ORF），將測序得到的chitotriosidase-1-like基因序列通過DNAMAN軟件翻譯成氨基酸序列，利用SinalP 5.0（https://novopro.cn/tools/signalp.html）進行蛋白序列的信號肽預(yù)測分析。通過Cell-PLoc 2.0在線網(wǎng)站（http: //www. csbio. sjtu. edu. cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）對蛋白進行亞細胞定位分析。通過Expasy在線網(wǎng)站中的Protparam工具（https: //web. Expasy. org/protparam/）分析蛋白去除信號肽后的理化性質(zhì)。通過Expasy在線網(wǎng)站中的ProtScale工具（https: //web. Expasy. org /protscale/）進行蛋白親/疏水性分析。通過TMHMM Server 2.0在線網(wǎng)站（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0）預(yù)測蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域。通過NetPhos 3.1 Server在線網(wǎng)站（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetPhos-3.1）進行蛋白磷酸化位點分析。通過NCBI在線網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）預(yù)測蛋白保守結(jié)構(gòu)域。

1.8 chitotriosidase-1-like基因的原核表達

1.8.1chitotriosidase-1-like基因的原核表達載體的構(gòu)建

根據(jù)克隆結(jié)果及核酸序列分析，去除chitotriosidase-1-like基因的信號肽序列，針對原核表達系統(tǒng)，優(yōu)化密碼子，基因合成由南京鐘鼎生物有限公司合成，并將合成片段連接到pEt-32a上，獲得重組質(zhì)粒pEt-32a-chitotriosidase-1-like，將獲得的重組質(zhì)粒pEt-32achitotriosidase-1-like轉(zhuǎn)入TOP10克隆菌株，挑取陽性克隆子測序。進行質(zhì)粒酶切鑒定，構(gòu)建質(zhì)粒梅切體系，體系為：質(zhì)粒3 μL，內(nèi)切酶10.25 μL，內(nèi)切酶20.25 μL，10×Buffer 1.0 μL，DDW 10 μL，進行酶切鑒定。

1.8.2 重組載體的誘導(dǎo)表達 將構(gòu)建好的原核表達載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21（DE3）感受態(tài)細胞，在LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，220 r/min振搖培養(yǎng)1 h，離心后全部涂布于含50 μg/mL氨芐西林（以下簡稱Amp）的LB固體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)過夜。挑取固體培養(yǎng)基上的單克隆接種于含50 μg/mL Amp的3 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，220 r/min振搖培養(yǎng)過夜。次日按1∶100接種于含50 μg/mL的 Amp的30 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振搖至OD600值為0.6 ～ 0.8，取1 mL培養(yǎng)物，10 000 r/min室溫離心2 min，棄上清液，用100 μL 1×上樣緩沖液重懸菌體沉淀；向剩余的培養(yǎng)物中加入IPTG至終濃度為0.5 mM，37℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h，取1 mL培養(yǎng)物，離心棄上清后用上述上樣緩沖液重懸菌體沉淀；剩余培養(yǎng)物繼續(xù)離心10 min，棄上清后用PBS重懸菌體沉淀，重懸液進行超聲破碎，破碎后取上清液與沉淀液加入上述上樣緩沖液重懸，將4次緩沖液重懸樣品進行12% SDS-PAGE檢測分析。

1.8.3 包涵體蛋白的變復(fù)性 將菌體沉淀重懸于20 mL裂解液，超聲破碎后于4 ℃、10 000 r/min離心20 min，收集沉淀，使用包涵體洗滌液洗滌包涵體3次，用溶解緩沖液按一定比例溶解包涵體，4 ℃放置過夜；次日恢復(fù)至室溫，10 000 r/min離心15 min，將30 mL上述溶液逐步滴加到30 mL 0.15 M NaCl，20 mM Tris-HCl，pH 8.0緩沖液中，緩慢攪拌，滴加速度為1 mL/min，再將稀釋蛋白溶液裝入透析袋于0.15 M NaCl，20 mM Tris-HCl，pH 8.0溶液中透析過夜。

1.8.4 Ni柱純化 利用低壓層析系統(tǒng)，按0.5 mL/min流速，將上清溶液上樣至Ni-IDA Binding-Buffer預(yù)平衡的Ni-IDA-Sepharose C1-6B親和層析柱，按0.5 mL/min流速，用Ni-IDA Binding-Buffer沖洗，沖洗至流出液OD280值到達基線，按1 mL/min流速，用Ni-IDA Washing-Buffer （0.15 M NaCl，20 mM咪唑，20 mM Tris-HCl，pH 8.0）沖洗，沖洗至流出液OD280值到達基線，按1 mL/min流速，用Ni-IDA ELution-Buffer（0.15 M NaCl，250 mM咪唑，20 mM Tris-HCl，pH 8.0）洗脫目的蛋白，收集流出液，將收集的流出液加入透析袋中，使用0.15 M NaCl，20 mM Tris-HCl，pH 8.0進行透析過夜，進行12% SDS-PAGE分析。

1.9 chitotriosidase-1-like基因的抑菌活性測定

將大腸桿菌25922、金黃色葡萄球菌6538、沙門氏菌13076凍存液接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、120 r/min振搖培養(yǎng)12 h；菌體復(fù)蘇后接種于LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃過夜培養(yǎng)；從固體培養(yǎng)基中挑取3 ～ 5個菌落接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、120 r/min振搖培養(yǎng)8 h；取100 μL菌體溶液滴于新的LB固體培養(yǎng)基平板中央，用玻璃棒從各個方向涂抹均勻，采用紙片擴散法，根據(jù)抑菌圈大小判斷抑菌活性。

1.10 不同攝食期chitotriosidase-1-like基因表達規(guī)律分析

根據(jù)chitotriosidase-1-like基因的cDNA序列，設(shè)計chitotriosidase-1-like基因熒光定量引物，模版為不同攝食時期的唾液腺（HN0、HN、HN1、HN2、HN3、HN5、HN7、HN9、HN12、HN15）的cDNA，內(nèi)參基因選取β-Actin基因。利用ABI StepOne Real-Time PCR測定chitotriosidase-1-like基因的相對表達 量，按 照TB Green? Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNase Plus）熒光定量試劑盒操作說明書要求，分別加 入2 μL的cDNA，0.4 μL的ROX Reference Dye（50×），10 μL的TB Green Premix Ex TaqⅡ（Tli RNase Plus）（2×），各0.8 μL的引物，RNase Free dH2O 0.6 μL，反應(yīng)體積為20 μL。按照試劑盒說明書設(shè)定程序進行反應(yīng)，每組設(shè)置3個重復(fù)，計算chitotriosidase-1-like基因在不同攝食時期唾液腺中的相對表達量，使用Excel軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 chitotriosidase-1-like基因克隆

根據(jù)水蛭唾液腺轉(zhuǎn)錄組中chitotriosidase-1-like基因的cDNA序列設(shè)計特異性引物F：ATGGAACATC TGCGTGGCTGCTAT、R：GCCATCAGGCTTTTTACTG CAATCA，以水蛭唾液腺cDNA為模版，進行PCR擴增，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)在理論值附近出現(xiàn)特異性條帶，測序結(jié)果與轉(zhuǎn)錄本堿基序列一致。

2.2 chitotriosidase-1-like基因的核酸分析

在NCBI在線網(wǎng)站中，利用ORF Finder對chitotriosidase-1-like基因序列進行分析，chitotriosidase-1-like基因開放閱讀框全長1 872 bp，編碼624個氨基酸，包含18個氨基酸組成的信號肽和606個氨基酸組成的成熟蛋白序列見圖1，屬于分泌蛋白，定位于細胞外。

圖1 水蛭chitotriosidase-1-like蛋白質(zhì)開放閱讀框及其氨基酸序列Fig. 1 Open Reading Frame of chitotriosidase-1-like protein in Hirudo nipponica and its amino acid sequence

2.3 chitotriosidase-1-like基因編碼蛋白理化性質(zhì)分析

除去chitotriosidase-1-like蛋白質(zhì)信號肽后，成熟chitotriosidase-1-like蛋白氨基酸序列蛋白質(zhì)分子式為C3028H4627N795O962S32，原子總數(shù)為9 444，相對分子質(zhì)量為68.585 KD，理論等電點（pI）為4.96，該蛋白含有73個堿性氨基酸（Arg + Lys），含有103個酸性氨基酸（Asp + Glu），谷氨酸（Glu）含量最多，含有60個，占9.9%，其次是亮氨酸（Leu），含有58個，占9.6%。脂肪酸系數(shù)為61.47，不穩(wěn)定指數(shù)為36.24，屬于穩(wěn)定蛋白。成熟chitotriosidase-1-like蛋白中第33個氨基酸（Arg）處疏水性最強，最高值為1.822，第469個氨基酸（Cys）和第538個氨基酸（Cys）處親水性最強，最低值為-2.833，親水性（GRAVY）總平均值為-0.694，屬于親水蛋白（圖2A）。成熟的chitotriosidase-1-like蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)域，不屬于跨膜蛋白（圖2B）。該蛋白含有多個磷酸化位點，分別為絲氨酸（Ser）31個，蘇氨酸（Thr）20個，酪氨酸（Tyr）5個（圖2C）。通過保守結(jié)構(gòu)域分析，該蛋白屬于GH18超級家族（圖2D）。

圖2 水蛭chitotriosidase-1-like蛋白理化性質(zhì)分析Fig. 2 Physical and chemical properties of chitotriosidase-1-like protein in Hirudo nipponica

2.4 重組質(zhì)粒pEt-32a-chitotriosidase-1-like的獲得

對重組質(zhì)粒pEt-32a-chitotriosidase-1-like進行測序驗證，測序結(jié)果與預(yù)期序列一致。此外，為了進一步驗證重組質(zhì)粒pEt-32a-chitotriosidase-1-like的準確性，將重組質(zhì)粒進行BamH I和Xho I雙酶切，見圖3。酶切出2條帶，一條與pEt-32a質(zhì)粒大小一致，另一條與目的片段大小一致，以上結(jié)果表明，成功獲得了重組質(zhì)粒pEt-32a-chitotriosidase-1-like。

圖3 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定Fig. 3 Identification of double digestion of recombinant plasmid

2.5 chitotriosidase-1-like基因重組載體的誘導(dǎo)表達

重組菌株表達后收集菌體并進行破碎裂解，以未誘導(dǎo)的菌體作為對照，對誘導(dǎo)后的菌體、誘導(dǎo)破碎后上清、誘導(dǎo)破碎后沉淀進行12% SDS-PAGE分析，該蛋白大小理論分子量為69.46 KD左右，從圖4中可以看到，誘導(dǎo)后的菌體及破碎后沉淀中均能看到目的條帶，目標蛋白主要存在于誘導(dǎo)破碎后的沉淀中。

圖4 蛋白表達鑒定SDS-PAGE分析Fig. 4 SDS-PAGE for identification of protein expression

2.6 包涵體蛋白變復(fù)性和純化

通過12% SDS-PAGE分析，在洗脫液中得到目的蛋白，見圖5。

圖5 蛋白純化SDS-PAGE分析Fig. 5 SDS-PAGE for identification of protein purification

2.7 chitotriosidase-1-like基因的抗菌活性

利用BCA蛋白濃度測定試劑盒測得原核表達收集得到的重組蛋白濃度為0.3 mg/mL，在該濃度下，重組蛋白對金黃色葡萄球菌具有抑菌效果，抑菌圈直徑為12 mm，對大腸桿菌、沙門氏菌無抑菌效果，結(jié)果見表2。

表2 chitotriosidase-1-like重組蛋白對不同細菌的抗菌活性Tab. 2 Anti-microbial activity against different bacterial of recombinant protein chitotriosidase-1-like

2.8 不同攝食期chitotriosidase-1-like基因的表達規(guī)律

利用實時熒光定量PCR檢測chitotriosidase-1-like基因的相對表達量，從圖6中可以看到，在攝食血餐時，chitotriosidase-1-like基因在水蛭唾液腺中的表達量很低，在攝食1 d后，chitotriosidase-1-like基因在水蛭唾液腺中的表達量陡然增高且達到最大，之后在未進食的情況下鮮有表達。

注：HN0. 未攝食；HN. 攝食中；HN1. 攝食后1 d；HN2. 攝食后2 d；HN3. 攝食后3 d；HN5. 攝食后5 d；HN7. 攝食后7 d；HN9. 攝食后9 d ；HN12. 攝食后12 d；HN15. 攝食后15 d。

3 討論

抗菌肽（AMPS）是生物機體產(chǎn)生的一種具有自我防御功能的多肽[20]。上世紀80年代，科學(xué)家從天蠶蛹體內(nèi)分離得到一種具有抗菌活性的小分子多肽，并將這種具有抑菌活性的小分子多肽命名為天蠶素（Cecropins）。次年，其氨基酸序列被公布，這是歷史上首次發(fā)現(xiàn)抗菌肽[21]。截至2021年7月，ADP3數(shù)據(jù)庫（http://aps.unmc.edu/AP/）中收錄的已知編碼抗菌肽或預(yù)測的抗菌肽基因序列已達7 000多個。其廣泛分布于動物[22]、植物[23]、微生物[24]中?？咕闹饕ㄟ^損傷細胞膜[25-26]、細胞內(nèi)抑制[27-28]等機理發(fā)揮抑菌作用，尤其對一些耐藥性細菌具有較好的抑菌活性[29]。正是因為具備穩(wěn)定的抗菌活性、綠色、無公害等優(yōu)點，抗菌肽被廣泛地應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、畜牧業(yè)及食品工業(yè)等方面[30-32]，具有較大的應(yīng)用價值。一直以來，對水蛭的研究主要集中在溶血栓、抗凝血方面。水蛭作為一種吸血蛭類，靠吸食動物的新鮮血液為生，且飽食一次血液，可維持長達1年的生命活動[2]。因此推測其在攝食、儲食過程會分泌抗菌活性蛋白，抵御外源性病原微生物入侵，以便于其順利攝食和長久儲食。隨著研究的深入，一些新的抗菌活性蛋白也從水蛭中提取分離出來并獲得其氨基酸序列，將其命 名 為Theromacin、Theromyzin、Neuromacin[33-34]、Grafskaia等[35]，從水蛭體內(nèi)分離鑒定得到6種抗菌肽，對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌具有抑制作用。本研究通過水蛭唾液腺轉(zhuǎn)錄組篩選1條可能具有抑菌活性的轉(zhuǎn)錄本序列，通過原核表達得到重組蛋白，對重組蛋白進行體外抑菌活性測定，發(fā)現(xiàn)其對金黃色葡萄球菌具有抑制作用，根據(jù)抑菌圈大小判定，金黃色葡萄球菌對重組蛋白中度敏感。

生物在新陳代謝的過程中，由于功能需求不同，某一特定基因的表達嚴格按特定的時間順序發(fā)生，即基因的表達在時間維度上具有特異性。研究基因表達的時間特異性，分析某一基因在特定時間順序內(nèi)的表達規(guī)律，對闡述該基因的功能和作用機制具有重要意義。食物信號作為一種外源信號，對基因表達量的高低具有非常重要的調(diào)控作用。有研究表明，從埃及伊蚊唾液腺中分離得到的LTRIN蛋白，在埃及伊蚊攝食時，可通過影響 NF-κB轉(zhuǎn)錄因子信號通路和抑制炎癥因子的產(chǎn)生，從而增加寨卡病毒（Zika virus）傳播性和致病性的作用，且在吸血過后，埃及伊蚊唾液腺內(nèi)LTRIN基因表達量顯著上調(diào)[36]。DING A D等[37]研究水蛭攝食不同階段Hmc基因表達規(guī)律時發(fā)現(xiàn)，Hmc基因的表達量在攝食前最低，在攝食時，Hmc基因的表達量出現(xiàn)上調(diào)，并在攝食結(jié)束后24 h其表達量達到最大值，明顯高于其它階段，說明該基因?qū)λ螖z食功能具有重要影響。一般情況下，動物體內(nèi)會儲藏相關(guān)功能蛋白，當攝食時分泌出來，攝食結(jié)束后，通過基因高表達翻譯蛋白后儲存在體內(nèi)，蛋白含量達到攝食前水平，以便在下次進食時發(fā)揮功能作用。本研究結(jié)果表明，水蛭攝食前和攝食中，chitotriosidase-1-like基因表達較少，在攝食后1 d，chitotriosidase-1-like基因在水蛭唾液腺中的表達量明顯上升且達到最大，之后在未進食的情況下鮮有表達，說明血餐能刺激和誘導(dǎo)chitotriosidase-1-like基因的表達，攝食后1 d，chitotriosidase-1-like基因會大量表達蛋白儲存在水蛭唾液腺內(nèi)，以便為水蛭下一次攝食做準備。

4 結(jié)論

本研究證實了chitotriosidase-1-like基因主要與水蛭攝食功能相關(guān)，在水蛭攝食時，chitotriosidase-1-like基因表達的蛋白會大量釋放，抵御血液中外源病原體入侵，以便于水蛭能順利進食和長久儲食，攝食結(jié)束后chitotriosidase-1-like基因會大量表達蛋白儲存于水蛭體內(nèi)，為水蛭下一次攝食做準備。本研究結(jié)果對后期深入研究chitotriosidase-1-like基因生物學(xué)功能及水蛭攝食、儲食機理奠定了基礎(chǔ)，對水蛭中藥材的多元化開發(fā)和利用具有重要意義。