周仔莉，賈文江，李 鵬，陳雪琴，蘇陽陽，郭宏波

（1.商洛市藥品檢驗(yàn)所，陜西 商洛 726000；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 化學(xué)與藥學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

2020年版《中國藥典》收錄茵陳為菊科植物濱蒿Artemisia scopariaWaldst.et Kit.或茵陳蒿Artemisia capillarisThunb.的干燥地上部分，其中，春季采收的習(xí)稱“綿茵陳”，秋季釆割的稱“花茵陳”。茵陳苦微寒而清利，并兼梳理，入脾、胃與肝、膽經(jīng)，善清利濕熱而退黃，為治濕熱黃疸之要藥，用于治療黃疸尿少、濕溫暑濕、濕瘡瘙癢等癥[1-2]。

茵陳含有有機(jī)酸類、香豆素類、揮發(fā)油類、黃酮類、萜類等化合物以及豐富的微量元素，具有廣泛的藥理作用[3-5]。茵陳復(fù)方制劑種類眾多，僅2020年版《中國藥典》（一部）就收錄了十余種，如：茵梔黃系列、茵膽平肝膠囊、茵山蓮顆粒、茵芪肝復(fù)顆粒等。因茵陳有2種基原且目前各基原茵陳標(biāo)準(zhǔn)僅用單一成分作為指標(biāo)性成分，缺乏全面的質(zhì)量評(píng)價(jià)和監(jiān)督體系；現(xiàn)有文獻(xiàn)對茵陳及茵陳標(biāo)準(zhǔn)湯劑水提物[6-8]、醇提物[9-10]、揮發(fā)油[11]有少量研究，但尚無對濱蒿和茵陳蒿二者成分及質(zhì)量差異的研究，并且鮮有對不同基原茵陳藥材使用指導(dǎo)原則的報(bào)道。本研究同時(shí)建立濱蒿和茵陳蒿HPLC指紋圖譜，全面比較濱蒿和茵陳蒿兩種基原茵陳所含化學(xué)物質(zhì)種類及含量的差異，為茵陳制劑原料的選擇及茵陳飲片的質(zhì)量控制提供指導(dǎo)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695型高效液相色譜儀（Empower色譜工作站，美國Waters公司）；Agilent 1260Ⅱ型高效液相色譜儀（DAD檢測器，美國安捷倫科技公司）；SQP型電子分析天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，精度：0.1 mg）；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率：250 W，頻率：40 kHz）；Hitech型純水機(jī)（上海和泰儀器公司）；FW-200D型高速萬能粉碎機(jī)（天津鑫博得儀器有限公司）；藥篩（湖南省常德粒度分析儀器廠）等。

1.2 試藥

沒食子酸（批號(hào)：110831-201906，純度：96.5%）、原兒茶酸（批號(hào)：110809-201906，純度：97.7%）、綠原酸（批號(hào)：110753-202018，純度：96.1%）、香草酸（批號(hào)：110776-201503，純度：99.8%）、咖啡酸（批號(hào)：110885-201703，純度：99.7%）、阿魏酸（批號(hào)：110773-201915，純度：99.4%）、蘆丁（批號(hào)：100080-202012，純度：91.6%）、金絲桃苷（批號(hào)：111521-201809，純度：94.9%）、丁香酚（批號(hào)：110725-201917，純度：100%）、3, 5-O-二咖啡?？鼘幩幔ㄅ?hào)：111782-201807，純度：94.3%）、濱蒿內(nèi)酯（批號(hào)：111511-201704，純度：99.9%）、濱蒿對照藥材（批號(hào)：120950-201608、120950-201007）、茵陳蒿對照藥材（批號(hào)：121555-201602、121555-201107）均購于中國食品藥品檢定研究院；甲醇（分析純，天津市天力化學(xué)試劑有限公司）、乙醇（分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司）、色譜乙腈 ［賽默飛世爾科技 （中國）有限公司］，超純水等。

本研究分別從不同產(chǎn)地收集了16批次茵陳藥材，樣品經(jīng)西北農(nóng)林科技大學(xué)郭宏波教授鑒定為濱蒿Artemisia scopariaWaldst.et Kit.或茵陳蒿Artemisia capillarisThunb.的干燥地上部分，藥材信息詳見表1。

表1 茵陳樣品信息Tab. 1 Information of Artemisia Scoparia Herba

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Welch Ultimate xB C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相：乙腈（A）-5 mL/L磷酸水溶液（B），梯度洗脫：0 ～ 30 min，10%→15%A；30 ～ 45 min，15%→30%A；45 ～ 60 min，30%→10%A；60 ～65 min，10%A；流速：1.0 mL/min；檢測波長：220 nm和360 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣體積：20 μL。

2.2 供試品溶液制備

精密稱取各批次茵陳樣品及對照藥材0.5 g置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，稱定初始重量，室溫超聲提取30 min（功率：250 W，頻率：40 kHz），冷卻后用70%甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 對照品溶液制備

分別精密稱取各對照品適量，加甲醇制成含沒食子酸、原兒茶酸、綠原酸、香草酸、咖啡酸、阿魏酸、蘆丁、金絲桃苷、丁香酚、3, 5-O-二咖啡?？鼘幩?、濱蒿內(nèi)酯質(zhì)量濃度分別為0.80、2.19、254.67、2.04、112.16、3.25、12.05、19.36、600.00、188.60、10.49 μg/mL混合對照品溶液。

2.4 HPLC指紋圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià)

2.4.1 精密度試驗(yàn) 精密吸取濱蒿對照藥材溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，以5號(hào)峰（綠原酸）為參照峰，計(jì)算各共有峰相對峰面積RSD在0.27% ～ 1.91%，表明該方法精密性良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取濱蒿對照藥材（批號(hào)：120950-201608）6份，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，以5號(hào)峰（綠原酸）為參照峰，計(jì)算各共有峰相對峰面積RSD在0.66% ～ 2.51%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取濱蒿對照藥材溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測定，以5號(hào)峰（綠原酸）為參照峰，計(jì)算各共有峰相對峰面積的RSD在0.35% ～ 2.18%，表明該溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.4 濱蒿及茵陳蒿指紋圖譜相似度評(píng)價(jià) 按照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件及“2.2”項(xiàng)下供試品制備方法，測定4批次對照藥材及16批次茵陳的指紋圖譜。分別將4批次對照藥材及16批次樣品在不同波長（220 nm和360 nm）測定的HPLC指紋圖譜導(dǎo)入“中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）”，以S1為參考，設(shè)定時(shí)間窗寬度為0.01，利用平均數(shù)法，選擇多點(diǎn)校正、自由匹配，建立2種基原茵陳對照指紋圖譜（見圖1）及16批次茵陳藥材的HPLC指紋圖譜疊加圖（見圖2A、2B），通過指紋圖譜比較，根據(jù)濱蒿對照藥材和茵陳蒿對照藥材圖譜標(biāo)定共有峰23個(gè)，已知化合物11個(gè)，即峰1、3、5、7、8、13、16、17、19、21、22分別為沒食子酸、原兒茶酸、綠原酸、香草酸、咖啡酸、蘆丁、金絲桃苷、阿魏酸、丁香酚、3,5-O-二咖啡?？鼘幩?、濱蒿內(nèi)酯；根據(jù)已有相關(guān)研究[12-13]推測出峰2、4、6、9、10、18、20、23分別為1-咖啡?？鼘幩帷⑿戮G原酸、隱綠原酸、對羥基苯乙酮、1,3-二咖啡?？鼘幩?、異槲皮苷、3,4-二咖啡?？鼘幩帷?,5-O-二咖啡?？鼘幩?，尚有4個(gè)未知化合物有待進(jìn)一步研究，初步推斷峰11、12為濱蒿特有峰，由圖譜可得出不同基原茵陳差異較大，且在220 nm更適合于茵陳各類有機(jī)酸的檢出，在360 nm處特異峰（峰11、峰12）更加明顯，構(gòu)建的指紋圖譜可以很好地區(qū)分2種基原的茵陳，根據(jù)圖譜可判定樣品S1、S5、S7、S8、S14、S16為濱蒿，S2、S3、S4、S6、S9、S10、S11、S12、S13、S15為茵陳蒿。

圖1 混合對照品及2種基原茵陳對照指紋圖譜（360 nm）Fig. 1 Chromatograms of mixed reference substances and fingerprints of 2 origins of Artemisia Scoparia Herba（360 nm）

圖2 茵陳樣品HPLC指紋圖譜Fig. 2 Overlay of HPLC fingerprints of Artemisia Scoparia Herba samples

分別以共有模式峰和濱蒿對照藥材圖譜作為參照圖譜，得到16批次茵陳藥材樣品與共有模式色譜峰和濱蒿對照藥材圖譜相似度分別為 0.694 ～ 0.951、0.872 ～ 0.989，見表2。

表2 相似度分析結(jié)果Tab. 2 Similarity evaluation results of 20 batches of Artemisia Scoparia Herba

2.4.5 基于化學(xué)模式對茵陳藥材的分析 應(yīng)用SPSS 21.0軟件，以指紋圖譜23個(gè)共有峰的峰面積為變量，對16批次茵陳樣品進(jìn)行聚類分析[14-15]，結(jié)果見圖3。當(dāng)判別距離大于10時(shí)，樣品可以分為3類，S1、S5、S14分為一類，S3、S7、S8、S16歸為一類，S2、S4、S6、S9、S10、S11、S12、S13、S15歸為一類，與相似度評(píng)價(jià)結(jié)論基本一致。

圖3 16批茵陳樣品聚類分析樹狀圖Fig. 3 Dendrogram of cluster analysis of 16 batches of Artemisia Scoparia Herba samples

為了進(jìn)一步分析茵陳樣品間及不同基原茵陳的差異，將指紋圖譜得到的23個(gè)共有峰峰面積數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件，基于PCA分析，進(jìn)一步進(jìn)行OPLS-DA判別分析，得分圖見圖4，可得知16批茵陳樣品可大致分為兩組，即S1、S5、S7、S8、S14、S16歸 為 一 類，S2、S3、S4、S6、S9、S10、S11、S12、S13、S15歸為一類，正交偏最小二乘判別分析與聚類分析結(jié)果一致。

圖4 16批茵陳樣品 OPLS-DA 散點(diǎn)圖Fig. 4 Scatter diagram of OPLS-DA of 16 batches of Artemisia Scoparia Herba samples

提取共有峰峰面積作為變量的權(quán)重值（VIP）進(jìn)行分析，以VIP＞1作為對整體模型的貢獻(xiàn)度高于平均水平值為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出了5個(gè)對樣本分類具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異標(biāo)志物，即綠原酸、3,5-O-二咖啡?？鼘幩帷?,5-O-二咖啡酰奎寧酸、新綠原酸、金絲桃苷，VIP值分別為3.05、2.38、1.39、1.35、1.08（見圖5），這些化學(xué)成分對不同基原樣品分類具有顯著影響，是區(qū)分濱蒿和茵陳蒿的主要標(biāo)志性成分。

圖5 茵陳樣品各成分VIP圖Fig. 5 VIP diagram of components in Artemisia Scoparia Herba samples

2.5 不同基原茵陳含量分析

2.5.1 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.3”項(xiàng)下混合對照品溶液0.5、1、2、5、15、20μL，注入色譜儀中，按照擬定色譜條件進(jìn)行分析。以對照品 質(zhì) 量 濃 度（μg/mL）（X1，X2，X3，X4，X5，X6，X7，X8，X9，X10，X11）對 峰 面 積（Y1，Y2，Y3，Y4，Y5，Y6，Y7，Y8，Y9，Y10，Y11）進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表3。說明11個(gè)組分在擬定色譜條件下，具有較好的線性關(guān)系及檢測靈敏度。

表3 成分線性關(guān)系Tab. 3 Linear relashionship of components

2.5.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對照品溶液10μL，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，結(jié)果沒食子酸、原兒茶酸、綠原酸、香草酸、咖啡酸、蘆丁、金絲桃苷、阿魏酸、丁香酚、3, 5-O-二咖啡酰奎寧酸、濱蒿內(nèi)酯峰面積的RSD均小于1.5%，表明該方法精密度良好。

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取濱蒿對照藥材（批號(hào)：120950-201608）6份，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果沒食子酸、原兒茶酸、綠原酸、香草酸、咖啡酸、蘆丁、金絲桃苷、阿魏酸、丁香酚、3,5-O-二咖啡?？鼘幩?、濱蒿內(nèi)酯峰面積的RSD均小于1.5%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一濱蒿對照藥材溶液（批號(hào)：120950-201608），按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測定，結(jié)果沒食子酸、原兒茶酸、綠原酸、香草酸、咖啡酸、蘆丁、金絲桃苷、阿魏酸、丁香酚、3, 5-O-二咖啡?？鼘幩帷I蒿內(nèi)酯峰面積的RSD均小于1.5%，表明該溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.5 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的S6樣品6份 ，精密稱取0.5 g，分別加入沒食子酸、原兒茶酸、綠原酸、香草酸、咖啡酸、蘆丁、金絲桃苷、阿魏酸、丁香酚、3,5-O-二咖啡?？鼘幩?、濱蒿內(nèi)酯對照品適量，按照“2.2”項(xiàng)下的方法平行制備6份供試品溶液，分別進(jìn)樣，計(jì)算回收率，結(jié)果見表4。

表4 茵陳11個(gè)共有成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n = 6）Tab. 4 The recoveries of 11 common components in Artemisia Scoparia Herba（n = 6）

2.5.6 樣品測定 分別取16批次樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖，采用外標(biāo)法分別對樣品中的11種共有成分含量進(jìn)行測定，結(jié)果見表5。

表5 茵陳11個(gè)共有成分含量測定結(jié)果（n = 3）Tab. 5 Result of determination of 11 components in Artemisia Scoparia Herba（n = 3）

3 討論

3.1 提取溶劑及提取方法的選擇

本研究采用DAD檢測器對樣品進(jìn)行全波長210 ～800 nm掃描，發(fā)現(xiàn)茵陳樣品中所含綠原酸、咖啡酸等有機(jī)酸在220 nm附近有很強(qiáng)吸收，濱蒿特異峰（峰11、峰12）在360 nm附近有較強(qiáng)吸收及較好的分離，故而最終確定了雙波長測定；對比了茵陳采用不同溶劑超聲提取圖譜，發(fā)現(xiàn)茵陳70%甲醇提取液對各種有機(jī)酸類及黃酮類提取效果好；研究中用70%甲醇作為提取溶劑，對比濱蒿對照藥材回流和超聲提取的色譜圖，發(fā)現(xiàn)兩種處理方式對目標(biāo)成分影響差異不大，最終選擇了操作簡便的超聲提取方法。

3.2 不同基原茵陳的區(qū)別

茵陳藥材不同基原品種在性狀上差異不大，僅能從氣味等細(xì)微的差別上進(jìn)行判定，而本研究構(gòu)建的方法可以作為茵陳基原鑒定除性狀之外的一種有效的補(bǔ)充方法。結(jié)合指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)、聚類分析、PCA分析、正交偏最小二乘判別以及含量測定結(jié)果分析所得結(jié)論與本研究中藥材基原的鑒定結(jié)論是一致的，即S1、S5、S7、S8、S14、S16被判定為濱蒿，S2、S3、S4、S6、S9、S10、S11、S12、S13、S15被判定為茵陳蒿；從樣品S1、S5、S7、S8、S14、S16中檢測到了峰11、峰12，而S2、S3、S4、S6、S9、S10、S11、S12、S13、S15未檢測到，與濱蒿對照藥材及茵陳蒿對照藥材指紋圖譜一致，進(jìn)一步證明了此差異是真實(shí)存在的，未受其它干擾因素影響。

研究中共收集到了6個(gè)省的16批次茵陳樣品及中國食品藥品檢定研究院4批次對照藥材，發(fā)現(xiàn)不同基原茵陳共有成分含量差異較為明顯，茵陳蒿中金絲桃苷、蘆丁平均含量是濱蒿的2倍 ～ 6倍，綠原酸、阿魏酸、香草酸、咖啡酸等有機(jī)酸平均含量均高于濱蒿，各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果顯示回收率均在98% ～100%范圍，RSD均小于1.5%，表明含量測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，故可作為茵陳藥材不同基原區(qū)分的一個(gè)量化指標(biāo)。S1樣品中23個(gè)共有峰峰面積整體偏小，結(jié)合性狀及含量分析，推測可能是采收貯存時(shí)間過長，造成所含成分整體降低，但當(dāng)增加取樣量或進(jìn)樣體積時(shí)，峰11、12峰面積成比例增大，繼而驗(yàn)證峰11、12也為S1樣品的特征峰。通過性狀觀察發(fā)現(xiàn)S3樣品老莖較多，猜測是春季采收較晚或是秋季采收，檢測到濱蒿內(nèi)酯成分積累較多，與相關(guān)文獻(xiàn)[16] “綿茵陳”幾乎不含濱蒿內(nèi)酯及《中國藥典》收錄“花茵陳”以濱蒿內(nèi)酯為指標(biāo)性成分相一致。目前尚無有關(guān)兩種基原的茵陳品種比較研究，有關(guān)濱蒿特有的2種差異成分具體化學(xué)結(jié)構(gòu)，需要進(jìn)一步確定。

4 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了濱蒿與茵陳蒿的HPLC指紋圖譜，可將兩種基原茵陳進(jìn)行有效區(qū)分，綜合指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)的結(jié)果與聚類分析、共有化學(xué)成分PCA分析、OPLS-DA綜合分析結(jié)果，均可明確將不同基原茵陳分為濱蒿和茵陳蒿，且結(jié)論一致。根據(jù)PCA分析可確定綠原酸、3, 5-O-二咖啡?？鼘幩帷?,5-O-二咖啡?？鼘幩?、新綠原酸、金絲桃苷5種成分為茵陳藥材的主要質(zhì)量標(biāo)志性成分，不同基原的茵陳含量差異明顯，茵陳蒿中各成分平均含量明顯高于濱蒿。結(jié)合相似度評(píng)價(jià)、指紋圖譜分析研究及多成分同時(shí)測定協(xié)同多指標(biāo)定量評(píng)價(jià)不僅為茵陳的質(zhì)量控制提供優(yōu)化方案，同時(shí)也為茵陳藥材兩種不同基原（濱蒿、茵陳蒿）的特異性、差異性研究提供了科學(xué)依據(jù)。