劉思佳，李 波，宋 雪，沈 瑩，何錄文，孟祥才

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

平貝母Fritillaria ussuriensisMaxim.為百合科多年生草本植物，其干燥鱗莖為我國東北三省道地藥材，具有清熱潤肺、化痰止咳的功效，用于肺熱燥咳、干咳少痰、陰虛勞嗽、咳痰帶血等癥的治療。平貝母屬早春植物，每年在土壤解凍后立即開始迅速生長，當(dāng)5月下旬氣溫到達(dá)20℃以上時(shí)開始枯萎，地上部分生長期不足60 d，地上部分生長發(fā)育期很短。平貝母的生長習(xí)性比較獨(dú)特，喜冷怕熱，高溫脅迫會(huì)對(duì)平貝母的生長發(fā)育造成不可逆轉(zhuǎn)的損傷[1]，大大降低了平貝母的產(chǎn)量。植物產(chǎn)量來源于光合作用，減少逆境危害對(duì)平貝母高產(chǎn)具有重要影響。外源物質(zhì)如SA[2]、BR[3]、6-BA[4]及Ca2+（CaCl2）[5]能夠誘導(dǎo)植物體發(fā)生一系列生理生化反應(yīng)，能夠緩解高溫脅迫對(duì)植物造成的損傷，增強(qiáng)植物對(duì)逆境的適應(yīng)能力。因此探究外源物質(zhì)對(duì)高溫脅迫下平貝母的凈光合速率和生理生化的影響，對(duì)提高栽培產(chǎn)量具有重要意義。

1 材料、儀器與試劑

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)于2019年在黑龍江省哈爾濱市通河縣清河鎮(zhèn)五七干校平貝母種植基地進(jìn)行。試驗(yàn)對(duì)象為6年生平貝母Fritillaria ussuriensisMaxim.選取植株長勢(shì)良好、大小一致者作為實(shí)驗(yàn)材料。

1.2 儀器

UV-1240型紫外分光光度儀（日本島津公司）；CI-340型便攜式光合測定儀（美國 CID Bio-Science公司）；TOLEDO AG135型電子分析天平（瑞士METTLER公司）；KDC-160HR型高速低溫離心機(jī)（科大創(chuàng)新股份有限公司）；Julabo TW20型數(shù)顯恒溫水浴鍋（德國Julabo有限公司）。

1.3 試劑

6-芐氨基嘌呤、水楊酸（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）；蕓苔素內(nèi)酯（河南中浪農(nóng)業(yè)科技有限公司）；CaCl2、NaH2PO4·2H2O、丙酮、Na2HPO4·12H2O（北京化工廠）；甲硫氨酸（MET）（上海士鋒生物科技有限公司）；氮藍(lán)四唑（NBT）（上海靜融生物科技有限公司）；核黃素（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；EDTA-Na2（上海正極生物科技有限公司）；愈創(chuàng)木酚、硫代巴比妥酸（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；30%H2O2（天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠）；三氯乙酸（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）；農(nóng)用有機(jī)硅助劑（青島綠隴作物營養(yǎng)有限公司）。

2 方法

2.1 田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)文獻(xiàn)或生長調(diào)節(jié)劑使用說明書確定平貝母葉面最佳的噴施濃度。于2019年5月18日18：00葉面施用水楊酸（SA）、CaCl2、蕓苔素內(nèi)酯（BR）、6-芐氨基嘌呤（6-BA），使葉片上下均沾滿液體。實(shí)驗(yàn)分為SA（0.2 mmol/L）處理組、CaCl2（10 mmol/L）處理組、BR（0.01%蕓苔素內(nèi)酯乳油1 750倍液）處理組、6-BA（20 μmol/L）處理組和對(duì)照組（蒸餾水）。每組處理1 m×1 m，三次重復(fù)。5月20日—21日各組覆蓋塑料拱棚，棚內(nèi)溫度最高溫度30℃左右。各組分別于5月18日、5月20日、5月22日、5月24日17：00左右采集6年生平貝母植株中部葉片10片，共隨機(jī)采集15株，將各組分別切碎混勻，用封口袋密封，于-40℃冰箱備存，測定各組生理生化指標(biāo)。

2.2 生理生化指標(biāo)測定

2.2.2 H2O2含量測定 采用南京建成過氧化氫測定試劑盒（A064）（比色法）測定。

2.2.3 SOD活性測定 測定采用氮藍(lán)四唑NBT法，參照李合生[6]的方法。

2.2.4 POD活性測定 測定采用愈創(chuàng)木酚法，參照李合生[6]的方法。

2.2.5 CAT活性測定 測定紫外吸收法，參照李合生[6]的方法。

2.2.6 MDA含量測定 采用南京建成植物MAD測定試劑盒（A003-3-1）（微板法）測定。

2.2.7 葉綠素含量測定 采用南京建成葉綠素測試盒（A147-1-1）（比色法）測定。

2.3 光合作用測定

于2019年5月20日使用便攜式光合測定儀CI-340分別于7：00、9：00、11：00、13：00、15：00、17：00時(shí)間點(diǎn)測定各組6年生平貝母20 cm高度處葉片的凈光合速率，每一組測定4株平貝母。

3 結(jié)果

3.1 外源物質(zhì)對(duì)高溫下平貝母·、H2O2含量的影響

圖1 不同處理組·O2-和H2O2含量變化 （n = 3）Fig. 1 Changes of · and H2O2 contents in different treatment groups（n = 3）

3.2 外源物質(zhì)對(duì)高溫下平貝母抗氧化酶系統(tǒng)的影響

三種抗氧化酶的活性較對(duì)照組均有升高的趨勢(shì)。除5月20日6-BA處理組外，各處理組各時(shí)間點(diǎn)SOD活性均高于對(duì)照組，其中，CaCl2、BR處理組分別在5月22日、24日及5月20日、24日有明顯提升，其余各組與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。其中CaCl2處理組提升最高，在5月22日、24日分別高于對(duì)照組18.5%（P＜0.05）、35.7%（P＜0.01）。

除5月20日CaCl2處理組及5月22日、5月24日BR處理組CAT活性較對(duì)照組略有下降外，其余處理組略高于對(duì)照組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

各處理組POD活性均高于對(duì)照組。SA處理組效果最為明顯，脅迫開始5 d內(nèi)的平均值分別高于對(duì)照組17.5%（P＜0.05）、31.3%（P＜0.01）和67.1% （P＜0.01）；CaCl2處理組提升效果僅次于SA處理組，其在5月20日與對(duì)照組相比雖有提高但并不明顯，在5月22日、24日分別高于對(duì)照組25.1% （P＜0.01）、60.9%（P＜0.01）；BR、6-BA處理組僅在5月24日較對(duì)照組有明顯提高，分別高于對(duì)照組22.3%（P＜0.05）、37.6%（P＜0.01），見圖2。

圖2 不同處理組抗氧化酶（SOD、POD）活性 （n = 3）Fig. 2 Activities of anti-oxidant enzymes （SOD，POD）in different treatment groups （n = 3）

3.3 外源物質(zhì)對(duì)高溫下平貝母葉綠素、MDA含量的影響

除SA處理組和5月24日BR處理組葉綠素a、b含量略高于對(duì)照組外，各處理組均略低于對(duì)照組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

與對(duì)照組相比各處理組均降低了平貝母葉片的MDA含量。除5月20日、24日CaCl2處 理組及5月22日6-BA處理組外，其余處理組各時(shí)間較對(duì)照組均有明顯降低。SA、CaCl2、BR、6-BA處理組各天葉片的MDA含量的平均值比對(duì)照組降低了22.8%（P＜0.01）、14.4%（P＜0.05）、27.9%（P＜ 0.01）和18.3%（P＜0.01），見圖3。

圖3 不同處理組丙二醛含量變化 （n = 3）Fig. 3 Changes of chlorophyll and malondialdehyde contents in different treatment groups （n = 3）

3.4 外源物質(zhì)對(duì)高溫下平貝母光合速率的影響

平貝母各處理組各時(shí)間點(diǎn)的光合速率較對(duì)照組均有增加，除9：00、11：00、15：00時(shí)SA處理組凈光合速率明顯大于對(duì)照組，分別比對(duì)照組增加了23.6%（P＜0.05）、33.7%（P＜0.05）、20.4%（P＜0.05），其余各組雖有增加但并不明顯。SA、CaCl2、BR、6-BA處理組各時(shí)間點(diǎn)的平均凈光合速率分別比對(duì)照組增加了24.9%（P＜0.05）、11.7%（P＞0.05）、19.0%（P＞0.05）、10.2%（P＞0.05），見圖4。通過噴施外源性植物生長調(diào)節(jié)劑SA、BR、6-BA及Ca2+提高了平貝母的高溫強(qiáng)光天氣下的凈光合速率，以0.2 mmol/L SA效果最佳。

圖4 各處理組凈光合速率日變化 （n = 4）Fig. 4 Diurnal variation of net photosynthetic rate in each treatment group （n = 4）

4 討論

植物在逆境條件下產(chǎn)生大量的活性氧[7]，而活性氧是造成植物細(xì)胞傷害或致死的主要原因[8]?！ぁ2O2、·OH等活性氧破壞DNA和蛋白質(zhì)等決定生命活動(dòng)的大分子結(jié)構(gòu)以及生物膜。植物體為了提高對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力，進(jìn)化出了活性氧的清除系統(tǒng)，高溫脅迫會(huì)引其起植物細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)，激活抗氧化系統(tǒng)，及時(shí)清除活性氧，從而能夠較好適應(yīng)高溫環(huán)境。SOD是植物活性氧清除系統(tǒng)的第一道防線，·的活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于H2O2，SOD通過歧化反應(yīng)將超氧自由基·轉(zhuǎn)化為H2O2和O2，大大減輕活性氧對(duì)細(xì)胞的傷害。CAT和POD是植物體內(nèi)清除H2O2的專一酶，可直接將H2O2徹底分解成無毒害的H2O和O2，消除活性氧自由基對(duì)植物造成的細(xì)胞傷害[9]?；钚匝蹩墒鼓ぶ胁伙柡椭舅徇^氧化為MDA[10]，MDA就是細(xì)胞膜系統(tǒng)受害程度的重要指標(biāo)之一[11]。大量研究表明，逆境脅迫下植物體保護(hù)酶活性越高，其對(duì)活性氧的清除能力就越強(qiáng)，植物的抗逆性也越強(qiáng)。

4.1 施用外源SA對(duì)高溫下平貝母的影響

SA是提高植物抗逆性的信號(hào)分子[12]。關(guān)于SA誘導(dǎo)植物抗高溫的機(jī)理主要是增加膜保護(hù)物質(zhì)（膜保護(hù)酶和抗氧化物質(zhì)）、減少活性氧[13]，誘導(dǎo)抗逆基因表達(dá)或通過脫落酸（ABA）來調(diào)節(jié)抗逆基因表達(dá)[14]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示施用植物生長調(diào)節(jié)劑SA可大幅增加平貝母葉片抗氧化酶SOD、CAT、POD活性，分別提高了3.8%、13.3%和38.6%，·與H2O2含量分別降低了16.14%和34.68%，葉片MDA的含量降低了22.8%，增強(qiáng)了平貝母對(duì)高溫的耐受性，從而使其凈光合速率提高24.9%。

4.2 施用外源BR對(duì)高溫下平貝母的影響

BR是廣譜高效的植物生長調(diào)節(jié)劑，能夠提高1，5-二磷酸核酮糖羧化酶的活性，提高植物對(duì)多種逆境的抗性。施用BR可明顯提高熱敏型水稻品種的葉片葉綠素及蛋白質(zhì)含量、SOD和POD活性，降低葉片MDA含量、電解質(zhì)外滲率[15]，脯氨酸和可溶性蛋白含量，降低了丙二醛含量，增加了凈光合速率[16]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示施用植物生長調(diào)節(jié)劑BR使平貝母葉片SOD、CAT、POD活性分別提 高13.8%、0.97%和9.8%，·與H2O2分別降低11.29%和17.32%，MDA含量降低27.9%，保護(hù)葉片細(xì)胞不被高溫破壞，從而使其凈光合速率提高11.7%。

4.3 施用外源Ca2+對(duì)高溫下平貝母的影響

Ca2+是細(xì)胞內(nèi)的第二信使，雖然不是植物激素，但可以通過調(diào)控SA誘導(dǎo)植物的耐熱性。外源SA可通過提高SOD和CAT活性，降低MDA含量來提高葡萄幼苗的耐熱性，促進(jìn)SA對(duì)葡萄幼苗耐熱性的誘導(dǎo)[17]。用CaCl2和SA + CaCl2藥劑噴施柑橘，各處理組均較高溫條件下對(duì)照組光合速率增加，SA與CaCl2具有相互促進(jìn)效應(yīng)[18]。本研究顯示施用植物生長調(diào)節(jié)劑Ca2+與施加SA效果相似，均可增加平貝母葉片抗氧化酶SOD、CAT、POD活性，分別提高19.3%、1.4%和30%，·與H2O2分別降低了5.0%和22.0%，降低葉片MDA的含量降低14.4%，提高平貝母的耐熱性，凈光合速率提高10.2%，但其凈光合速率的增長效果低于SA。

4.4 施用外源6-BA對(duì)高溫下平貝母的影響

6-BA是人工合成的細(xì)胞分裂素，能夠提高玉米的1，5-二磷酸核酮糖羧化酶和丙酮酸磷酸雙激酶活性及葉綠素含量[19]；明顯提高了高溫脅迫下甜椒幼苗對(duì)光強(qiáng)的利用率，從而増加了生物量，促進(jìn)葉綠素的合成，降低·的產(chǎn)率及MDA的積累[20]；使高溫脅迫下的微型月季葉片中的SOD、POD和APX活性及蛋白質(zhì)和游離脯氨酸含量明顯提高，相對(duì)電導(dǎo)率及MDA含量明顯降低[4]。此外6-BA還有緩解葉片衰老的作用[21]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示施用植物生長調(diào)節(jié)劑6-BA分別提高平貝母葉片SOD、CAT、POD活性1.5%、5.6%、17.6%，·與H2O2的含量分別降低了14.7%、28.5%，減少了活性氧自由基對(duì)平貝母葉片細(xì)胞的傷害，使凈光合速率增加19.0%。

平貝母為早春植物，土壤解凍后立即萌發(fā)，夏季來臨前枯萎，地上部分生長僅50余天，極不耐高溫。對(duì)于北方來說，春季氣溫波動(dòng)較大，每年在此期間都會(huì)出現(xiàn)30℃的高溫，加速葉片衰老，對(duì)平貝母產(chǎn)量造成影響。然而，高溫出現(xiàn)早晚不同對(duì)平貝母生長的影響也不同。早期高溫一旦對(duì)葉片生理造成損害，將影響整個(gè)生長發(fā)育期，而晚期影響較小，高溫對(duì)產(chǎn)量的影響具有很大的不確定性。基于此，采用凈光合速率間接評(píng)價(jià)對(duì)產(chǎn)量的影響更具有參考意義。

5 結(jié)論

施用外源SA、BR、6-BA及Ca2+，能夠提高高溫強(qiáng)光下平貝母抗氧化酶SOD、CAT、POD的活性；減少活性氧·、H2O2的含量；降低活性氧對(duì)植物細(xì)胞的傷害程度（MDA含量降低）；增強(qiáng)平貝母葉片對(duì)高溫的耐受性，使平貝母凈光合速率較對(duì)照組有明顯增加。以葉面噴施0.2 mmol/L SA效果最佳。外源SA無毒廉價(jià)，在平貝母生長期中后期高溫來臨前葉面施用，可增加平貝母的高溫抗性，維持葉片的功能性，可作為提高平貝母產(chǎn)量的一項(xiàng)重要措施。