常金翠，陳沙，馮濤，熊建，李凡，李沛

(1.上海應用技術大學 香料香精化妝品學部，上海 201418；2.安琪酵母股份有限公司，湖北 宜昌 443000)

酵母抽提物(yeast extract，YE)是以食品用酵母為主要原料，在酶的作用下自溶并分離得到的產(chǎn)品。酵母抽提物富含多種氨基酸、多肽、核苷酸、維生素等物質，具有營養(yǎng)、調味及保健功能，與味精、水解蛋白、呈味核苷酸(I+G)并稱為我國四大天然調味料[1-3]。酵母抽提物一般應用于食品工業(yè)和生命科學領域，在雞精、醬油、肉制品及食用香精中已經(jīng)得到了很好的應用[4]。

“Koku”一詞源于日本，它是由味道、香氣和質地所引起的整體感覺，它由3個要素組成：復雜性、滿口感和綿延感[5]。Kokumi是“koku”加“mi”(“mi”在日語中表示滋味)的復合詞，它既不是一種像鮮味那樣獨特的口味，也不是另一種不同的 koku。Koku是通過添加一些本身沒有味道的物質改變味覺信息誘導出來的，這種物質被稱為“kokumi 物質”，相當于 koku誘導物質。據(jù)報道，從奶酪、豆類、牛骨髓提取物、醬油等物質中分離出的各種肽類，如谷胱甘肽、谷纈甘肽和一些 γ-谷氨酰類的二肽和三肽都屬于kokumi物質[6-9]。谷胱甘肽與谷纈甘肽是目前公認的濃厚感較強的kokumi肽。食品中的 kokumi 物質大致可以分為肽類和非肽類兩大類。本文主要針對酵母抽提物中kokumi肽的研究進行了歸納總結。

1 酵母抽提物及kokumi 肽概述

中華人民共和國國家標準GB/T 23530-2009《酵母抽提物》指出：酵母抽提物是以食品用酵母為主要原料，在酵母自身的酶或外加食品級酶的作用下，酶解自融(可再經(jīng)分離提取)后得到的產(chǎn)品，并富含氨基酸、肽、多肽等酵母細胞中的可溶性成分。不同的生產(chǎn)方法得到的酵母抽提物也各有不同，傳統(tǒng)酵母抽提物的提取方法有自溶法、酶解法、酸解法3種。

酵母自溶是指利用酵母自身水解酶的作用，加入一定的自溶促進劑，控制一定的條件(溫度、pH)，將酵母體內營養(yǎng)物質和大分子物質水解成為可溶性小分子物質的過程[10]。自溶法生產(chǎn)酵母抽提物的優(yōu)點是成本較低、風味較好、游離氨基酸含量高，但呈味核苷酸含量較低[11]。酶解法是首先采用高溫使酵母菌體內的酶失活，然后在外加酶如蛋白酶、核酸酶等的作用下使酵母細胞分解成小分子呈味物質，經(jīng)過分離、干燥等處理得到酵母抽提物的方法[12]。該法的優(yōu)點是有廣泛的原料來源、提取的酵母抽提物的質量好，但是酶制劑的成本較高，因此主要用于高檔酵母抽提物。酸解法是以干酵母為原料，利用鹽酸或硫酸調節(jié)酸濃度，特定條件下水解一定的時間，然后進行過濾、脫色、去除異味、堿中和，最后濃縮或噴霧干燥得到酵母抽提物[13]。該法得到的酵母抽提物分解率高、游離氨基酸含量高，但適口性較差、成本較高。已有研究表明，酵母抽提物中的呈味肽具有增鮮提味的作用，是潛在的濃厚感肽的重要來源之一[14-16]。

呈味肽根據(jù)味覺特性分為酸味肽、甜味肽、苦味肽、咸味肽和鮮味肽五大類[17]。Kokumi 肽是后來新發(fā)現(xiàn)的，其概念易與鮮味肽混淆[18]。由于鮮味肽能夠增強食物的鮮味和醇厚味，減少食鹽和MSG的攝入[19-20]，而kokumi 肽本身不呈現(xiàn)基本味感，但是可以增強飽滿、復雜性，增加可持續(xù)性[21]。因此，可以認為鮮味肽屬于kokumi 肽的范圍。

許多食品中都發(fā)現(xiàn)了 kokumi 肽，其主要來源于動物性食品、植物性食品、發(fā)酵食品、酵母提取物等。目前市場上較常見的是來自酵母抽提物中的kokumi肽。陳志穎等[22]利用啤酒廢酵母制備富含谷胱甘肽的酵母抽提物，所得成品中GSH平均含量為4.11%，固形物含量達到61.87%。劉建彬等[23]在3種酵母抽提物的kokumi 物質研究中發(fā)現(xiàn)，導致其濃厚味感的主要滋味物質為<1000 kDa 分子量的寡肽(約70%)。Wang 等[24]利用超濾-納濾(UFNF)聯(lián)合工藝從酵母提取物中提取出谷胱甘肽。Liu 等[25]應用超濾、色譜、液質聯(lián)用和感官分析技術，在酵母提取物中發(fā)現(xiàn)了10種kokumi活性肽，它們分別是γ-Glu-Cys-Gly、γ-Glu-Leu、γ-Glu-Val、γ-Glu-Tyr、Leu-Lys、Leu-Gln、Leu-Ala、Leu-Glu、Leu-Thr和Ala-Leu，它們能賦予空白雞湯典型的口感、持久和復雜的感覺(kokumi)。

2 酵母抽提物中kokumi 肽的評價標準

酵母抽提物中kokumi肽一般用感官評價法進行評價，該方法簡單、直觀、成本較低，但是對評價人員的能力要求較高，易受評價人員主觀判斷的影響。電子舌作為一種新型智能味覺仿生系統(tǒng)，能夠方便有效地檢測樣品味覺信息，通常會將其與感官評價法聯(lián)合使用作為某種物質的評價標準[26]。鈣敏感受體(calcium sensing receptor， CaSR) 法一般用于醫(yī)學研究中，在此用于kokumi 物質的檢測中，根據(jù)是否激活CaSR以改變Ca2+的濃度來判斷該物質是否為kokumi物質。綜合使用以上幾種評價方法有利于研究的準確性。

2.1 感官評價法

感官評價是通過視覺、嗅覺、觸覺、味覺和聽覺對樣品進行測量、分析、解釋的一種科學方法[27]。由于該方法直觀、科學、簡便，目前在市場上應用較為廣泛。感官評定法在kokumi 物質中的應用，最初是由日本科學家提出來的，后來人們對其進行了改進和完善[28-30]。酵母抽提物中kokumi 肽的感官評價方法一般分為3個步驟：篩選感官評價人員，成立感官評價小組。小組成員一般10人以上，年齡在20～35歲，身體健康且無味覺障礙；對感官評價成員進行5種基本味覺的感知評價，采用空白雞湯及加入谷胱甘肽的雞湯進行kokumi 肽的味覺訓練；安排具體的感官實驗[31]。酵母抽提物中kokumi 肽的感官評價方法主要分為描述性感官評價和感官反饋評價。

描述性感官評價是指將樣品加入到基礎溶液或標準模型溶液中，讓評價員用一些描述性詞語如酸、甜、苦、咸、鮮、濃厚感、滿口感、綿延感等來描述樣品的味道[32]。待測樣品的味道強度可以用5分法、9分法、10分法或15分法測量，味道強度由弱到強，基礎溶液為0分，味道最強為最高分[33]。

感官反饋評價測試可細分為劑量反饋測試和時間反饋測試。劑量反饋測試為配制不同濃度梯度的樣品加入到標準模型溶液或基礎溶液中，采用評分制對基本味強度進行打分。計量反饋測試能夠直觀地看出樣品濃度與基本味強度的關系。時間反饋測試是將一定濃度待測樣品加入標準模型溶液中后，受試者在入口不同時間(如5，10 s)吐出并進行打分。該過程采用啜食技術，即待鑒評的溶液在口中旋轉鑒評而不要咽下，每個樣品測試完需用大量清水漱口，相鄰樣品溶液測試需要間隔一定的時間，以保證實驗的準確性。時間反饋測試能很好地反映樣品溶液在評價員口中的味道變化。

Kuroda等[34]應用感官評定方法發(fā)現(xiàn)，γ-Glu-Val-Gly的厚味強度是GSH的12.8倍，它增強了食物的口感、厚度(或濃味)和連續(xù)性，表明γ-Glu-Val-Gly是一種強濃厚感物質。Xu等對牛骨髓提取物(BBME)酶解產(chǎn)物的美拉德反應產(chǎn)物中鮮味和厚味活性肽進行了純化鑒定和感官評價，發(fā)現(xiàn)Cys-Pro-Arg、Pro-Cys和Leu-Met能顯著提高空白牛肉湯的濃厚味。Yang 等[35]借鑒該種感官評價法驗證了具有kokumi活性的γ-谷氨?；嚯哪茉鰪娢毒孽r味，并在激活T1R3方面表現(xiàn)出協(xié)同作用。

2.2 電子舌分析法

電子舌(electronic tongue)又稱味覺傳感器，是一種新型的分析測試儀器，基于仿生學原理、傳感器技術并結合計算機科學等多種新型技術手段，通過模擬人的味覺以實現(xiàn)對液體樣品進行定性分析或定量測定的目的[36]。利用電子舌分析法測定kokumi物質，可與人類感官分析法結合，使評價結果更加可信。具體方法可參考吳陽的雙孢菇中濃厚感呈味肽與基本味感相互作用的研究。將kokumi物質設置不同濃度梯度，分別添加到咸(氯化鈉)、鮮(谷氨酸鈉)、甜(蔗糖)、酸(檸檬酸)、苦(咖啡因)5種基本味感溶液中，對所配制的一系列溶液進行電子舌檢測分析。結合感官分析發(fā)現(xiàn)，電子舌檢測與感官分析結果規(guī)律保持一致：隨著濃厚感肽濃度的增加，氯化鈉溶液的咸味強度、谷氨酸鈉溶液的鮮味強度、蔗糖溶液的甜味強度均為先增強再減弱，檸檬酸溶液的酸味強度逐漸減弱，咖啡因溶液的苦味強度先減弱再增強。

2.3 鈣敏感受法

2.3.1 CaSR 結構

2009年，Gabriel等[37]首次在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)味覺組織中的鈣敏感受體(calcium sensing receptor，CaSR)，并提出CaSR作為受體，根據(jù)其表達的細胞類型和可用的信號轉導級聯(lián)來檢測Ca2+和可能的其他味道。隨后，Ohsu 等的研究表明，CaSR激動劑在味覺細胞中被CaSR識別，并在人體中產(chǎn)生令人滿意的kokumi味覺，這是第一份表明CaSR在人類味覺感知中獨特功能的報告。2012年，Maruyama等[38]在舌組織切片和共聚焦顯微鏡下使用了加載鈣離子熒光探針Calcium Green-1的小鼠味覺細胞。 在味覺孔周圍局部施用kokumi物質，誘導一部分味覺細胞的細胞內Ca2+濃度([Ca2+]i)增加，這些反應被CaSR抑制劑NPS-2143預處理所抑制。研究結果進一步表明表達CaSR的味覺細胞是kokumi物質的主要檢測者，并且它們是獨立于甜味和鮮味受體的。

人源CaSR(NCBI：000379.2)屬于C 類的G蛋白偶聯(lián)受體(G-protein coupled receptors，GPCR)，由1078個氨基酸組成，它在哺乳動物細胞外鈣穩(wěn)態(tài)中起核心作用[39-40]。CaSR由GPCR家族的3個特征結構組成：細胞外N端Venus Flytrap結構域(VFTD)、TMD和富含半胱氨酸的結構域(CRD)[41]。從結構上看，人類CaSR與甜味和鮮味受體相似，但不同之處在于它是同二聚體而不是異二聚體[42]。

2.3.2 CaSR檢測法

目前，使用鈣敏感受體(CaSR)法評估kokumi 物質主要采用卵母細胞和HEK-293細胞兩種受體。以卵母細胞為例簡述如下：CaSR激動劑誘導的電流用顯微注射hCaSR-cRNA的卵母細胞來表征。卵母細胞是從非洲爪蛙卵巢中獲得的，然后用hCaSR 的互補RNA顯微注射。卵母細胞中表達的CaSR(Gq類G蛋白偶聯(lián)受體)的激活導致細胞間Ca2+的增加。游離鈣離子的增加會激活卵母細胞內源性鈣依賴性氯離子通道，同時產(chǎn)生可測量的電流。CaSR激活劑通過兩個電極刺穿卵母細胞產(chǎn)生電流，記錄的峰值電流被認為是受體激活的強度。Amino等通過檢測 γ-谷氨酰肽的CaSR活性，以此輔助驗證具有CaSR活性的γ-谷氨酰肽的結構[43]。

除了kokumi 物質，陽離子、多胺、氨基酸、多肽等也可激活CaSR[44-46]。因此，激活CaSR的不一定就是kokumi 物質，CaSR法僅能對kokumi 物質初篩，結合感官評定法和電子舌分析法將加大kokumi 物質檢測的準確性。

3 Kokumi肽呈味機制

Ohsu等首次報道了kokumi肽(GSH、γ-Glu-Val-Gly和各種γ-谷氨酰肽)通過CaSR發(fā)出信號，并能與甜味、咸味和鮮味協(xié)同作用，以增強kokumi感覺。通過使用異源表達系統(tǒng)和人類感官分析，kokumi肽通過CaSR賦予甜味、咸味和鮮味kokumi感覺。

谷胱甘肽(GSH)和谷氨酰肽被認為在與L-氨基酸相同的位點與CaSR變構結合，并在0.5～1 mmol/L游離鈣的存在下增強其活性，從而作為正變構調節(jié)劑[47-48]。通過對大量γ-谷氨酰肽-CaSR-活性關系的不斷研究，Amino等確定了γ-谷氨酰肽的強CaSR活性的結構要求如下：氨基末端 γ-L-谷氨酰殘基的存在； 在具有 L構型的第二個殘基上存在中等大小的脂肪族中性取代基；羧基末端羧酸的存在，優(yōu)選甘氨酸作為第三組分的存在。通過使用CaSR活性分析篩選的 γ-谷氨酰肽的感官分析，發(fā)現(xiàn)γ-谷氨酰纈氨酰甘氨酸是有效的kokumi肽。此外，含有正纈氨酸的γ-谷氨酰肽具有極好的kokumi物質的感覺活性。

CaSR的整個N端胞外結構域(ECD)的靜止構象和活性構象的晶體結構提供了關于Ca2+和L-氨基酸結合之間的動力學的額外信息。通過使用L-色氨酸(L-Trp)，該研究提供了L-氨基酸是CaSR共激動劑的直接證據(jù)，它們與Ca2+協(xié)同作用，實現(xiàn)受體的完全激活，示意圖見圖1。具體有以下幾點原因：它在細胞外的捕蠅草模塊(VFT區(qū))的域間縫隙結合，這是C類GPCRs的典型激動劑結合位點；L-Trp與代謝型谷氨酸受體(mGluRs)和γ-氨基丁酸受體(GABAB)的內源性激動劑具有共同的受體結合模式，它們也是氨基酸或其類似物。參與激動劑識別的殘基位于這些受體結構的相同位置；L-Trp與LB1和LB2結構域相互作用，促進胞外結構域的關閉，這是CaSR激活過程中至關重要的第一步。相反，在假定的構型激動劑結合位點沒有發(fā)現(xiàn)Ca2+來誘導結構域關閉；L-Trp結合殘基的突變完全阻斷了Ca2+誘導的IP積累和細胞內Ca2+動員，表明L-Trp是Ca2+介導的受體反應所必需的；L-Trp 在細胞外Ca2+存在下直接激活CaSR介導的胞內Ca2+動員。

圖1 CaSR的激活機制[49]Fig.1 Activation mechanism of CaSR

Liu等開發(fā)了一種創(chuàng)新的基于無細胞 F?rster 共振能量轉移(FRET)構象 CaSR 生物傳感器，以闡明與激活相關的主要構象變化。通過對環(huán)境營養(yǎng)物質的完美控制，該測定結果表明單獨的 Ca2+完全穩(wěn)定了活性構象，而氨基酸則表現(xiàn)為純正變構調節(jié)劑[50]。Ling 等進一步使用單粒子低溫電子顯微鏡確定了處于非活性狀態(tài)、Ca2+或L-Trp結合狀態(tài)和Ca2+/L-Trp結合活性狀態(tài)的全長人源CaSR的結構。 L-Trp結合誘導CaSR的金星捕蠅草(VFT)結構域關閉，使受體進入中間活性狀態(tài)。Ca2+結合將VFT結構域的構象變化傳遞到跨膜區(qū)(TMDs)，從而誘導二聚CaSR的兩個TMDs之間的緊密接觸，激活受體。

4 Kokumi肽信號轉導

味覺檢測的解剖單位是味覺受體細胞，它們被組裝成味蕾，分布在舌和腭上皮的不同乳頭狀突起上[51]。味蕾細胞可以根據(jù)它們的功能分為3種主要類型。一般來說，苦味、甜味和鮮味刺激由Ⅱ型細胞檢測，酸味刺激由Ⅲ型細胞檢測，咸味(氯化鈉)刺激由尚未確定的味蕾細胞檢測[52]。其中，甜味、苦味和鮮味是由GPCRs介導的:甜味細胞使用TAS1R2和TAS1R3的異二聚體(TAS1R2/3)來檢測天然和人工甜味劑，鮮味細胞使用TAS1R1和TAS1R3的異二聚體(TAS1R1/3)來檢測各種L-氨基酸和核苷酸，人類和小鼠的每個苦味細胞分別表達約25～35個TAS2Rs，以檢測大量的、化學上不同的苦味物質[53]。

圖2 CaSR信號轉導通路Fig.2 CaSR signaling pathway

Kokumi 味覺是由另一種GPCR-CaSR轉導的、CaSR-配體結合和G蛋白的募集導致復雜的擴增信號網(wǎng)絡的激活，從而啟動許多細胞內功能。CaSR的功能多樣性源于其激活多種Gα蛋白(Gq/11、Gi/o、G12/13和Gs)的能力[54]，隨后影響與甲狀旁腺激素分泌、癌癥和轉移的病理生理學相關的多種信號通路[55-56]。

目前對于CaSR信號轉導的研究主要集中于藥理學，對于味覺信號轉導的研究相對較少，結合幾種基本味覺信號傳導及對mGlus的研究，可以預測kokumi 肽激活CaSR的信號通路與GPCR介導的Ca2+信號通路類似。以Gα-q偶聯(lián)的GPCR為例，kokumi底物激活CaSR，并通過Gα-q/11蛋白傳遞信號，Gα-q/11蛋白進一步激活磷脂酶C(PLC)，使其催化磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(PIP2)水解并產(chǎn)生雙二信使：1,4,5-三磷酸肌醇(IP3)和二酰甘油(DAG)。IP3作用于內質網(wǎng)(ER)上的IP3受體，釋放細胞內的Ca2+[57]。Kokumi途徑是否嚴格依賴于Gα-q/11蛋白，或者也可以像其他味覺方式一樣使用Gα-味導素進行下游信號傳導，仍然需要更多的研究進行驗證。

5 酵母抽提物在食品中的應用

酵母抽提物在食品中可應用調味品、飲料、肉制品和功能性食品中，其種類、添加比例及應用效果見表1。酵母抽提物由于含有大量氨基酸、多肽、核苷酸等物質，常用于如醬油、雞精、火鍋底料、方便面料包等調味品中。酵母抽提物在醬油中主要可去除醬油中的豆腥味和雜味，尤其可以減少食鹽的用量。李沛等[58]通過醬香型酵母抽提物協(xié)助醬油減鹽，發(fā)現(xiàn)醬香型酵母抽提物可協(xié)助減鹽20%～30%，其風味及鹽味與減鹽前差別不大。雞精、火鍋底料及方便面料包中加入酵母抽提物可提升其鮮味及濃厚感，黎怡林等[59]通過對比實驗、感官評價的方法，發(fā)現(xiàn)添加 2%肉湯味型酵母抽提物的雞精產(chǎn)品，在氣味、鮮味、肉質感、復雜感、持久感、飽滿度方面要明顯優(yōu)于添加 2%普通型酵母抽提物的雞精產(chǎn)品，而添加 2%普通型酵母抽提物的雞精產(chǎn)品又明顯優(yōu)于未添加酵母抽提物的雞精產(chǎn)品。酵母抽提物應用在果汁、果茶、食醋中還能起到降低酸味和澀味的作用，提升使產(chǎn)品口感更加協(xié)調，整體喜好度。

表1 酵母抽提物在傳統(tǒng)食品中的應用Table 1 Application of yeast extract in traditional food

續(xù) 表

酵母抽提物應用于肉制品中可使產(chǎn)品香氣純正、濃郁、圓潤，與其他呈味物質產(chǎn)生協(xié)同效應, 添加后可減少其他調味料，降低成本[85-86]。美拉德反應是肉制品風味產(chǎn)生的一個重要途徑, 酵母抽提物中富含蛋白質、氨基酸、肽類物質等成分,其與含硫化合物、還原糖、HVP及肉提取物等物質共熱, 在優(yōu)化條件下產(chǎn)生很強的肉香味[87-88]。黎彩平等通過對加入酵母抽提物的廣式臘腸進行分析，發(fā)現(xiàn)其氮含量有所增加，氣味和滋味(臘香味)均比不加酵母抽提物時有所提高。李庫等研究發(fā)現(xiàn)在醬牛肉中添加0.5%的風味型酵母抽提物(TB01)后產(chǎn)品質量提高，香氣豐滿濃郁、回味悠長，口感鮮嫩爽口,細膩柔軟。酵母抽提物應用于雞肉腸、速凍包子餡、魚糜制品中均有增鮮、提高濃厚感的作用。隨著近兩年植物肉市場的火熱，也有人將酵母抽提物加入植物肉中，結合肉味香精，用純素原料做出具有肉味口感與風味的植物肉漢堡。

酵母抽提物不僅在滋味方面有廣泛的應用，在功能性食品中也有很大的市場。日本科學家已經(jīng)研發(fā)出了一款高谷胱甘肽含量的酵母抽提物，作為營養(yǎng)補充劑添加于功能性食品和保健品中。朱明軍等利用維生素C、酵母抽提物、蝦青素及輔料開發(fā)了一種含蝦青素的營養(yǎng)食品，專供人類營養(yǎng)和保健需要。丁紅莉等利用嗜熱鏈球菌grx02、酵母抽提物及?；撬衢_發(fā)了一種具有醒酒護肝作用的保健食品，其中酵母抽提物中富含谷胱甘肽，可以提高肝組織的抗氧化能力，增強肝細胞活力，增強肝細胞代謝能力，達到解酒護肝的目的。膠原蛋白飲品中酵母抽提物能使其他各種原料中的氨基酸、肽、蛋白質、糖類在加工和儲存過程中發(fā)生美拉德反應，對成品色澤、風味的形成與提高有著非常重要的作用。施小輝以酵母抽提物為主要原料，結合膠原蛋白、水蘇糖等物質開發(fā)了一種谷胱甘肽口服液，并采用等滲等壓技術提高人體對谷胱甘肽的吸收率，改善肌膚暗沉、暗黃、黃褐斑、曬斑等問題，使皮膚白皙細膩，并增強機體免疫力。

6 展望

隨著人們對食品風味和質量要求的提高，減鹽、減糖、減脂逐漸成為市場的趨勢。Kokumi 肽能與其他呈味物質相互作用從而引起味覺方面的濃厚感、持久性與復雜感，添加少量到食品中即可達到減鹽、減糖的效果，這使得酵母抽提物中kokumi 物質在調味領域具有很好的開發(fā)潛力。因此，kokumi 物質有希望成為一種新的健康食品價值來源。但關于kokumi在未來趨勢上的研究還有許多不足，制備方面：目前我國對kokumi 肽的研究開發(fā)停留在實驗室的分離鑒定上，kokumi 肽的制備技術尚未成熟，常見的化學合成方法成本極高。未來可利用現(xiàn)有的生物工程技術實現(xiàn) kokumi 肽的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，并有目的地合成、改造或設計 kokumi 肽[89]；機制研究：目前kokumi肽主要通過感官、細胞實驗、計算機模擬、冷凍電鏡等手段進行分析，未來需要大量研究人員通過不同手段進一步研究kokumi 肽的呈味機制和信號傳導機制；與其他基本味覺相互作用：kokumi肽是通過對其他基本味覺進行加強來發(fā)揮作用的，該類物質是否對基本味覺受體及其傳導途徑產(chǎn)生影響也有待研究；與其他感官的聯(lián)系：味覺信號并非是孤立存在的，它與其他感覺如嗅覺、視覺等及神經(jīng)信號之間是否有某種聯(lián)系，也是未來可以研究的方向。