冉偉，姜婷婷，李興華，李想

(四川旅游學(xué)院，成都 610100)

目前醬油的釀造方法主要為高鹽稀態(tài)發(fā)酵工藝和低鹽固態(tài)發(fā)酵工藝兩種，通常采用黃豆和黃豆粕為原料[1]。低鹽固態(tài)發(fā)酵工藝相對(duì)于高鹽稀態(tài)發(fā)酵工藝具有發(fā)酵溫度高、生產(chǎn)周期較短、通過發(fā)酵劑添加能有效地保證生產(chǎn)過程穩(wěn)定、提高原料的利用率等特點(diǎn)，目前被國內(nèi)大部分生產(chǎn)企業(yè)選用[2]。同時(shí)因在發(fā)酵過程中鹽的添加量相對(duì)較低，符合目前低鹽健康的生活理念，低鹽固態(tài)發(fā)酵工藝制備的醬油深受消費(fèi)者喜愛[3]。但是其風(fēng)味物質(zhì)含量及口味不及高鹽稀態(tài)發(fā)酵工藝制備的醬油。如何改善低鹽發(fā)酵醬油的風(fēng)味成為目前亟需解決的問題。

復(fù)合發(fā)酵法是食品工業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域常用的一種風(fēng)味改良方法，生物發(fā)酵劑的添加能有效去除醬油在制備過程中產(chǎn)生的異味，同時(shí)還能豐富其風(fēng)味物質(zhì)種類及含量，達(dá)到改善口味的目的[4]。目前醬油生產(chǎn)企業(yè)多采用多菌種混合發(fā)酵的方式，實(shí)現(xiàn)菌種互補(bǔ)、縮短發(fā)酵時(shí)間及改善發(fā)酵效果。房峻等[5]通過強(qiáng)化嗜鹽四聯(lián)球菌，添加魯氏接合酵母菌改善醬油品質(zhì)，有效提高了醬油樣品中氨基酸和有機(jī)酸含量，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類總量提高2.4倍；鄧岳等[6]通過多菌混合制曲制備醬油，特征性風(fēng)味物質(zhì)含量均高于傳統(tǒng)非添加菌種醬油，醬油品質(zhì)得到了有效改善。目前，采用復(fù)合發(fā)酵法優(yōu)化低鹽醬油工藝的研究相對(duì)較少。

嗜鹽四聯(lián)球菌是一種中度嗜鹽菌，能夠在發(fā)酵過程中產(chǎn)生高濃度乳酸，對(duì)發(fā)酵速度和成品呈味物質(zhì)含量有一定影響[7]。魯氏接合酵母在醬油的制備過程中能產(chǎn)生多種風(fēng)味物質(zhì)，使醬油醇厚的香氣增加。本研究選取富含不飽和脂肪酸、膳食纖維等生物活性物質(zhì)且抗氧化效果較好的黑豆替代傳統(tǒng)黃豆為原料，在傳統(tǒng)低鹽固態(tài)發(fā)酵工藝基礎(chǔ)上添加嗜鹽四聯(lián)球菌和魯氏接合酵母菌進(jìn)行發(fā)酵，以感官評(píng)定和氨基態(tài)氮含量為指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面優(yōu)化復(fù)合發(fā)酵法制備低鹽黑豆醬油的最佳工藝，并對(duì)比分析其與傳統(tǒng)工藝制備的低鹽黑豆醬油品質(zhì)差異，為相關(guān)企業(yè)生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑豆、麩皮：購于中糧集團(tuán)有限公司；米曲霉3.042 (Aspergillusoryzae3.042)：購于成都市青羊生物科技有限公司；嗜鹽四聯(lián)球菌(Tetragenococcushalophilus)、魯氏接合酵母(Saccharomycesrouxii)：購于美國QLED公司；氨基酸標(biāo)樣、酵母膏、胰蛋白胨、MRS 培養(yǎng)基等：購于成都瑞星生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

XRP100電子天平 梅特勒-托利多國際有限公司;BJPX88恒溫培養(yǎng)箱 濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司；UV-4430紫外可見光分光光度計(jì) 青島明博環(huán)保科技有限公司；GBQ100L發(fā)酵罐 山東雙子機(jī)械工程有限公司；高效液相色譜儀 深圳市鴻永精儀科技有限公司；API 5000液質(zhì)聯(lián)用儀、氣質(zhì)聯(lián)用儀 譜質(zhì)分析檢測(cè)技術(shù)(上海)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 低鹽黑豆醬油制備工藝

1.3.1.1 制曲工藝

將黑豆浸泡8 h，放入蒸鍋中蒸45 min，添加1.5倍的水后再于123 ℃滅菌15 min，按6∶4的比例將黑豆和麩皮混合，接種0.5%的醬油曲精，攪拌均勻后放入培養(yǎng)箱內(nèi)，在溫度32 ℃、濕度75%的條件下制曲48 h，每8 h翻曲1次。

1.3.1.2 發(fā)酵工藝

成曲樣品粉碎，按1∶2的比例將粉碎后的樣品與鹽水(100 g/L NaCl)混合，放入發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，期間每天攪拌1次。傳統(tǒng)制備方法在30 ℃條件下自然發(fā)酵120 d。復(fù)合發(fā)酵法按試驗(yàn)設(shè)計(jì)的發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行發(fā)酵，其中在發(fā)酵0 d添加魯氏接合酵母，在發(fā)酵10 d添加嗜鹽四聯(lián)球菌。

1.3.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上，復(fù)合發(fā)酵法制備的低鹽黑豆醬油的條件：發(fā)酵時(shí)間80 d，發(fā)酵溫度30 ℃，魯氏接合酵母菌接種量2%，嗜鹽四聯(lián)球菌接種量1%。在其他條件不變的前提下對(duì)單個(gè)因素不同梯度進(jìn)行單因素試驗(yàn)，分析其對(duì)感官品質(zhì)及氨基態(tài)氮含量的影響。各因素單因素試驗(yàn)水平：發(fā)酵時(shí)間60，65，70，75，80，85，90，95，100 d，發(fā)酵溫度26，27，28，29，30，31，32，33，34 ℃，魯氏接合酵母菌接種量1.6%、1.7%、1.8%、1.9%、2.0%、2.1%、2.2%、2.3%、2.4%，嗜鹽四聯(lián)球菌接種量0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、1.1%、1.2%、1.3%、1.4%。

隨著我國城市化的推進(jìn)，物業(yè)管理企業(yè)也逐漸的從大城市普及到了中小城市，隨之而來的競(jìng)爭也日益激烈，為了爭奪資源，物業(yè)管理公司都想盡辦法來擴(kuò)大資源，物業(yè)管理的覆蓋面積不斷增大，這就需要更多的人力。除此之外，監(jiān)控線延長帶來的管理上的困難也可想而知，相應(yīng)的管理成本也會(huì)隨之增長。

1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、魯氏接合酵母菌接種量和嗜鹽四聯(lián)球菌接種量等因素對(duì)低鹽黑豆醬油品質(zhì)影響較大的水平，運(yùn)用Design-Expert 13軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，并確定試驗(yàn)方案，建立回歸方程預(yù)測(cè)模型，確定最佳工藝條件。具體因素及水平見表1。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels

1.3.4 感官評(píng)價(jià)

通過對(duì)低鹽黑豆醬油的感官屬性進(jìn)行分析，確定感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，分別從色澤、氣味、滋味和形態(tài)4個(gè)方面進(jìn)行評(píng)價(jià)，具體見表2。選取10名具有食品科學(xué)等相關(guān)專業(yè)背景的感官評(píng)價(jià)員，其中男5名，女5名,年齡在18～22歲，在評(píng)價(jià)前進(jìn)行統(tǒng)一培訓(xùn)。樣品用相同的器皿盛裝，置于45 ℃水浴鍋中加熱5 min，隨機(jī)抽樣評(píng)價(jià)，取評(píng)分平均值為最終評(píng)分。

表2 感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)Table 2 The sensory evaluation standard

1.3.5 其他理化指標(biāo)測(cè)定

氨基態(tài)氮含量測(cè)定參考胡伊等[9]的方法，采用高氯酸非水滴定法；氯化鈉的測(cè)定參考董淑杰等[10]的方法，采用離子色譜-電導(dǎo)法；可溶性無鹽固形物的測(cè)定參考尹樂斌等[11]的方法，采用直接干燥重量法；游離氨基酸含量的測(cè)定參考褚千千等[12]的方法，采用三硝基苯磺酸法測(cè)定；有機(jī)酸含量的測(cè)定參考于敏等[13]的方法，采用高效液相色譜法測(cè)定；揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定參考袁爾東等[14]的方法，采用固相微萃取聯(lián)合氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(SPME-GC-MS)進(jìn)行測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果用平均值表示，使用Excel 2010軟件進(jìn)行作圖和數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合發(fā)酵法優(yōu)化低鹽黑豆醬油工藝條件

2.1.1 單因素試驗(yàn)

復(fù)合發(fā)酵法優(yōu)化低鹽黑豆醬油單因素試驗(yàn)結(jié)果見圖1～圖4。

圖1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)氨基態(tài)氮含量和感官評(píng)分的影響Fig.1 The effect of fermentation time on the content of amino nitrogen and sensory score

由圖1可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，感官評(píng)分和氨基態(tài)氮含量均呈上升趨勢(shì)，發(fā)酵時(shí)間為90 d時(shí)，感官評(píng)分達(dá)到最大值96.12，此時(shí)氨基態(tài)氮含量為(8.25±0.12) mg/mL，說明此時(shí)低鹽黑豆醬油風(fēng)味最佳。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，二者均呈下降趨勢(shì)，主要受發(fā)酵后期有機(jī)酸等次生代謝物的影響，導(dǎo)致風(fēng)味品質(zhì)下降。綜合分析，發(fā)酵時(shí)間為90 d時(shí)品質(zhì)最佳。

圖2 發(fā)酵溫度對(duì)氨基態(tài)氮含量和感官評(píng)分的影響Fig.2 The effect of fermentation temperature on amino nitrogen content and sensory score

由圖2可知，發(fā)酵溫度為30 ℃時(shí)感官評(píng)分和氨基態(tài)氮含量最高，29 ℃和31 ℃次之，溫度過低，低鹽黑豆醬油的微生物代謝緩慢，影響風(fēng)味物質(zhì)的形成，溫度過高又會(huì)抑制微生物的代謝活動(dòng)，導(dǎo)致風(fēng)味物質(zhì)濃度降低，發(fā)酵溫度為30 ℃時(shí)品質(zhì)最佳。

圖3 魯氏接合酵母菌對(duì)氨基態(tài)氮含量和感官評(píng)分的影響Fig.3 The effect of Saccharomyces rouxii on the content of amino nitrogen and sensory score

圖4 嗜鹽四聯(lián)球菌對(duì)氨基態(tài)氮含量和感官評(píng)分的影響Fig.4 The effect of Tetragenococcus halophilus on the content of amino nitrogen and sensory score

由圖3和圖4可知，隨著兩種菌接種量的增加，感官評(píng)分和氨基態(tài)氮含量均呈先上升后下降的趨勢(shì)，魯氏接合酵母菌接種量為1.9%時(shí)，其感官評(píng)分為95.16，氨基態(tài)氮含量為(8.21±0.32) mg/mL，嗜鹽四聯(lián)球菌接種量為1.2%時(shí)，其感官評(píng)分為96.12，氨基態(tài)氮含量為(8.42±0.18) mg/mL，發(fā)酵菌種的添加對(duì)低鹽黑豆醬油中微生物代謝有較大影響，在發(fā)酵過程中能有效分解黑豆蛋白質(zhì)，產(chǎn)生氨基酸等小分子化合物，直接影響低鹽黑豆醬油滋味，也是判斷發(fā)酵程度的重要指標(biāo)，綜合分析，魯氏接合酵母菌接種量為1.9%時(shí)品質(zhì)最佳，嗜鹽四聯(lián)球菌接種量為1.2%時(shí)品質(zhì)最佳。

2.1.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果分析

表3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Response surface design and results

表4 回歸方程方差分析Table 4 Analysis of variance of regression equation

續(xù) 表

由表3可知單因素試驗(yàn)最佳結(jié)果，復(fù)合發(fā)酵法制備低鹽黑豆醬油的最佳工藝條件為發(fā)酵時(shí)間90 d、發(fā)酵溫度30 ℃、魯氏接合酵母菌接種量1.9%、嗜鹽四聯(lián)球菌接種量1.2%。采用Design-Expert 13軟件進(jìn)行處理分析。根據(jù)方差分析結(jié)果除去不顯著項(xiàng)得到模型的二次多項(xiàng)回歸方程為Y=-9819.8875+26.20167A+440.325B+1793.91667C+670.83333D-0.045AB-1AC+0.6AD-17.5BC+2BD+40CD-0.131667A2-6.76667B2-315.41667C2-352.91667D2。

由表4可知，模型的P值小于0.0001，差異極顯著，失擬項(xiàng)的P值為0.2216，差異不顯著，表明模型是極顯著的。因素A、B、AB、AC、AD、BC、BD、CD對(duì)結(jié)果影響不顯著(P>0.05)；因素D對(duì)結(jié)果影響顯著(P<0.05)；因素C、A2、B2、C2、D2對(duì)結(jié)果影響極顯著(P<0.01)；RAdj2為92.74%，說明模型中殘差相互獨(dú)立，擬合度良好，試驗(yàn)誤差小，可以用于復(fù)合發(fā)酵法制備低鹽黑豆醬油的最佳工藝條件優(yōu)化與預(yù)測(cè)。

2.1.3 響應(yīng)曲面圖分析與結(jié)果優(yōu)化

根據(jù)回歸方程的分析結(jié)果，考察復(fù)合發(fā)酵法制備低鹽黑豆醬油工藝條件的發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、魯氏接合酵母菌接種量、嗜鹽四聯(lián)球菌接種量4個(gè)因素的交互作用對(duì)配方的影響，具體見圖5～圖10。通過Design-Expert 13得回歸模型提取復(fù)合發(fā)酵法制備低鹽黑豆醬油的最佳配方方案：發(fā)酵時(shí)間90 d、發(fā)酵溫度30 ℃、魯氏接合酵母菌接種量1.964%、嗜鹽四聯(lián)球菌接種量1.2%，模型預(yù)測(cè)所得的感官評(píng)分為96.1；考慮到試驗(yàn)條件，將復(fù)合發(fā)酵法制備低鹽黑豆醬油最佳配方方案修正為發(fā)酵時(shí)間90 d、發(fā)酵溫度30 ℃、魯氏接合酵母菌接種量1.9%、嗜鹽四聯(lián)球菌接種量1.2%。為了進(jìn)一步檢驗(yàn)預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性，在修正后的最佳配方條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，平均感官評(píng)分為95.88，與模型預(yù)測(cè)所得的感官評(píng)分相對(duì)誤差為0.0127，與預(yù)測(cè)值具有良好的吻合性，可以用于實(shí)際生產(chǎn)。

圖5 A與B交互影響響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface diagram of interaction between A and B

圖6 A與C交互影響響應(yīng)面Fig.6 Response surface diagram of interaction between A and C

圖7 A與D交互影響響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface diagram of interaction between A and D

圖8 B與C交互影響響應(yīng)面圖Fig.8 Response surface diagram of interaction between B and C

圖9 B與D交互影響響應(yīng)面圖Fig.9 Response surface diagram of interaction between B and D

圖10 C與D交互影響響應(yīng)面圖Fig.10 Response surface diagram of interaction between C and D

2.2 復(fù)合發(fā)酵法與傳統(tǒng)發(fā)酵法制備的低鹽黑豆醬油品質(zhì)比較

2.2.1 氯化鈉、可溶性無鹽固形物含量及感官評(píng)分比較

醬油中氯化鈉濃度對(duì)酶的代謝影響較大，濃度過高會(huì)制約酶的分解，濃度過低又不能有效抑制雜菌的生長，一般濃度在6～8 mg/mL適宜[15]。對(duì)比分析復(fù)合發(fā)酵法和傳統(tǒng)發(fā)酵法制備的低鹽黑豆醬油，氯化鈉含量分別為6.89 mg/mL和7.21 mg/mL，差異不顯著，均在合理范圍內(nèi)，兩種方法在制備過程中均按相同比例混合，受發(fā)酵時(shí)間及溫度等因素影響，水分蒸發(fā)，直接影響成品中氯化鈉濃度?？扇苄詿o鹽固形物主要是原料的分解物，其含量越高說明成品品質(zhì)越好。由圖11可知，復(fù)合發(fā)酵法制備的低鹽黑豆醬油無鹽固形物含量為20.12 mg/mL，高于傳統(tǒng)發(fā)酵法16.9%，達(dá)到特級(jí)醬油標(biāo)準(zhǔn)20 mg/mL。感官評(píng)價(jià)結(jié)果為消費(fèi)者最直接的感受，評(píng)分增加了5.5%，說明復(fù)合發(fā)酵法工藝優(yōu)化有效提升了低鹽黑豆醬油的發(fā)酵品質(zhì)。

圖11 兩種發(fā)酵方法的氯化鈉、可溶性無鹽固形物含量及感官評(píng)分Fig.11 Sodium chloride, soluble salt-free solid content and sensory score of black bean soy sauce prepared by the two fermentation methods

2.2.2 游離氨基酸含量比較分析

游離氨基酸是低鹽黑豆醬油鮮味的主要來源，是評(píng)價(jià)其品質(zhì)的主要指標(biāo)，復(fù)合發(fā)酵法與傳統(tǒng)發(fā)酵法制備的低鹽黑豆醬油游離氨基酸含量見表5。

表5 兩種發(fā)酵法的游離氨基酸含量Table 5 Free amino acid content of black bean soy sauce prepared by the two fermentation methods mg/dL

由表5可知，傳統(tǒng)方法制備的低鹽黑豆醬油中游離氨基酸總量為45.41 mg/dL，其中鮮味氨基酸含量為11.7 mg/dL，占總量的25.75%，甜味氨基酸含量為4.36 mg/dL，占總量的9.6%；接種了魯氏接合酵母菌和嗜鹽四聯(lián)球菌的低鹽黑豆醬油中鮮味氨基酸含量為15.56 mg/dL，相比傳統(tǒng)發(fā)酵法增加了32.99%，甜味氨基酸含量為5.6 mg/dL，相比傳統(tǒng)發(fā)酵法增加了28.44%；綜合分析，低鹽黑豆醬油在發(fā)酵過程中添加菌種后，游離氨基酸總量有了顯著提升，特別是直接影響低鹽黑豆醬油鮮甜味的氨基酸含量增加顯著，能更好地改善復(fù)合發(fā)酵法制備的低鹽黑豆醬油品質(zhì)。

2.2.3 有機(jī)酸含量比較分析

表6 有機(jī)酸含量Table 6 Organic acid content mg/dL

醬油中的有機(jī)酸能有效改善醬油的滋味，其含量差異對(duì)醬油的口感和質(zhì)量有直接的影響[16]。由表6可知，復(fù)合發(fā)酵法優(yōu)化工藝制備的低鹽黑豆醬油共有檸檬酸、酒石酸、丙酸、蘋果酸、乳酸和乙酸6種有機(jī)酸，總量比傳統(tǒng)發(fā)酵法制備的低鹽黑豆醬油高15.55%。其中具體改善醬油風(fēng)味和能有效防腐抑菌的蘋果酸、乳酸、乙酸和丙酸等含量高于傳統(tǒng)低鹽黑豆醬油54.51%，說明工藝優(yōu)化與魯氏接合酵母菌和嗜鹽四聯(lián)球菌接種對(duì)其品質(zhì)改良具有積極的意義。

2.2.4 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)比較分析

表7 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類Table 7 Types of volatile flavor substances 種

通過對(duì)兩種方法制備的低鹽黑豆醬油樣品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的檢測(cè)與分析，由表7可知，傳統(tǒng)發(fā)酵法制備的低鹽黑豆醬油與復(fù)合發(fā)酵法制備的低鹽黑豆醬油所檢測(cè)到的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類差異較大，復(fù)合發(fā)酵法揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)總量達(dá)69種，比傳統(tǒng)發(fā)酵法多20種，說明通過工藝優(yōu)化，添加魯氏接合酵母菌和嗜鹽四聯(lián)球菌能有效提升醬油中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類，更有利于醬油的滋味調(diào)和。

3 結(jié)論

添加魯氏接合酵母菌和嗜鹽四聯(lián)球菌的復(fù)合發(fā)酵法，在改善低鹽黑豆醬油品質(zhì)方面具有積極的作用。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Design-Expert 13軟件建立以感官評(píng)分為指標(biāo)的二次多項(xiàng)式回歸模型，用響應(yīng)面法優(yōu)化得最佳工藝：發(fā)酵時(shí)間為90 d，發(fā)酵溫度為30 ℃，魯氏接合酵母菌接種量為1.9%，嗜鹽四聯(lián)球菌接種量為1.2%，按該工藝條件生產(chǎn)的低鹽黑豆醬油品質(zhì)最佳，感官評(píng)分為95.88，氨基態(tài)氮含量為8.45 mg/mL。并對(duì)最佳工藝條件生產(chǎn)的低鹽黑豆醬油與傳統(tǒng)發(fā)酵法制備的低鹽黑豆醬油在品質(zhì)上進(jìn)行了對(duì)比分析，研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)合發(fā)酵法制備的低鹽黑豆醬油在氯化鈉含量、可溶性無鹽固形物含量及感官評(píng)分上均優(yōu)于傳統(tǒng)發(fā)酵法制備的低鹽黑豆醬油，達(dá)到特級(jí)醬油標(biāo)準(zhǔn)；在生產(chǎn)過程中添加菌種的低鹽黑豆醬油游離氨基酸總量有了顯著提升，特別是直接影響低鹽黑豆醬油鮮甜味的氨基酸含量增加顯著，有機(jī)酸總量比傳統(tǒng)發(fā)酵法制備的低鹽黑豆醬油高15.55%，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)總量達(dá)69種，比傳統(tǒng)發(fā)酵法多20種，說明其能更好地改善低鹽醬油的品質(zhì)。本研究為相關(guān)企業(yè)生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。