胡雪芬，張錦航，李二虎

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，武漢 430072)

腐乳是中國傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品之一，因具有奶酪般的絲滑口感而被稱為“東方奶酪”[1]。腐乳在發(fā)酵過程中，微生物產(chǎn)生的蛋白酶系將大豆蛋白水解為小分子可溶性短肽和游離氨基酸[2-4]，不僅有利于人體對豆制品的消化吸收，而且促進了腐乳風(fēng)味的形成，帶來豐富的味覺層次。當腐乳中酪氨酸的含量達到過飽和時，腐乳表面會出現(xiàn)白色結(jié)晶，即俗稱的“白點”[5]。

白點的主要成分為酪氨酸和苯丙氨酸[6-7]，廣泛存在于一些鹽腌的高蛋白食品中，如鹽腌貝類、牡蠣、鰭魚、豬肉、奶酪和東方特色的大豆發(fā)酵制品(醬油、豆瓣醬、腐乳以及豆豉等)，白點帶來的顆粒感和苦澀感會顯著降低腐乳的品質(zhì)[8-12]。

酪氨酸的溶解度低，極易形成結(jié)晶，相關(guān)研究表明，酪氨酸的形成與酪氨酸羧肽酶的活性密切相關(guān)。目前抑制腐乳中白點產(chǎn)生的主要途徑是增加酪氨酸的溶解度或減少酪氨酸的產(chǎn)生[13-14]。研究表明，酒精度[15]、溫度[16]和鹽含量對蛋白酶活性均有顯著的抑制作用，影響腐乳發(fā)酵過程中大分子物質(zhì)的水解。Qiu等[17]研究發(fā)現(xiàn)，在腐乳發(fā)酵過程中，乙醇的添加會降低腐乳中脫羧酶的活性，從而抑制酪氨酸的生成。乙醇在腐乳前發(fā)酵階段也會對乙酰膽堿酯酶的活性產(chǎn)生一定抑制作用[18]。鹽含量的高低會影響腐乳中酶的活性，從而影響腐乳的成熟時間。因此，可以通過優(yōu)化這些因素來抑制酪氨酸羧肽酶的活性，從而減少酪氨酸的生成。本文通過單因素試驗結(jié)合響應(yīng)面試驗的方法探究溫度、鹽濃度、酒精含量3個因素對酪氨酸含量的影響，并結(jié)合感官評價來綜合評估出最佳后酵條件，為腐乳中白點的抑制及腐乳品質(zhì)的提高提供了參考。

1 材料和方法

1.1 材料

老豆腐：購于武漢明利和豐股份有限公司；毛霉菌粉：購于成都曲賦生物科技有限公司。

1.2 試劑

L-酪氨酸、4-氨基安替比林、氯化銨、鹽酸、高碘酸鈉(純度99.5%)：國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.3 主要儀器與設(shè)備

SPX-250B生化培養(yǎng)箱 天津市泰斯特儀器有限公司；UV-1700紫外可見分光光度計 日本島津公司；DTT-A1000 電子天平 美國康州HZ電子有限公司。

1.4 方法

1.4.1 腐乳的制備

將購置的老豆腐切成2 cm×2 cm×1 cm規(guī)格大小的白坯，擺盤。將1.6 g的毛霉菌用1 L 25 ℃的溫水浸泡20 min，用4層紗布過濾，取過濾后的菌液噴灑豆腐表面，每5 kg白坯接種的毛霉菌量不少于8 g。將接菌后的白坯用布密封，置于20 ℃、87%濕度的環(huán)境下發(fā)酵2 d。取布后晾涼，搓毛，使腐乳毛坯表面形成致密皮膜，保護腐乳的完整性。搓毛完成后得到腐乳毛坯，裝盤腌制。腌制方法：首先稱取固量的鹽，先在盤底撒上一層鹽，接著將毛坯均勻放在盤中，再在毛坯表面均勻撒鹽并置于室溫下干腌2 d；干腌結(jié)束后，在盤中加入不同濃度的鹽水濕腌2 d，并在毛坯上蓋壓一定重量的板子，目的是將毛坯中的水分腌出；濕腌結(jié)束后，濾去盆中多余水分，即得鹽坯。腌制完成后將鹽坯裝罐，罐容積固定為225 mL，每罐裝入12塊鹽坯并加入一定體積的湯料，加蓋后進行后期發(fā)酵。

1.4.2 酪氨酸溶解度的測定

采用酪氨酸與4-氨基安替比林的顯色反應(yīng)測定食品中酪氨酸的含量[19]。

腐乳中酪氨酸含量的測定：取待測腐乳成品，用濾紙吸干表面水分，均勻研磨成糊狀，準確稱取5 g，加入6 mL 1 mol/L鹽酸于20 mL刻度試管中，靜置反應(yīng)1 h，微波加熱30 s，過濾，蒸餾水定容于50 mL容量瓶中。取5 mL待測液于50 mL容量瓶中，依次加入5 mL 5.0×10-2mol/L 4-氨基安替比林，2.5 mL NH4OH-NH4Cl緩沖溶液(pH 9.40)，2.5 mL 0.1 mol/L高碘酸鈉溶液，二次水定容至50 mL。顯色25 min后，于25 ℃在480 nm波長下測定腐乳樣品的吸光度值,重復(fù)3次。

標準曲線的繪制：準確稱取0.1000 g酪氨酸，用1 mol/L HCl溶液稀釋后定容至100 mL，再吸取10 mL稀釋液，用0.1 mol/L HCl溶液定容至100 mL，使其終濃度為100 g/mL。分別吸取0，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0 mL酪氨酸溶液，每管依次加入5 mL 5.0×10-2mol/L4-氨基安替比林，2.5 mL NH4OH-NH4Cl緩沖溶液(pH 9.40)，2.5 mL 0.1 mol/L高碘酸鈉溶液，用蒸餾水定容至50 mL，反應(yīng)25 min后，于25 ℃在480 nm處測定吸光度值，并繪制酪氨酸標準曲線。

1.4.3 感官評定

感官評價表及評價方法參考沈子林等[20]對腐乳感官評價的方法，并稍作修改，對腐乳的規(guī)格、色澤、香氣、滋味、質(zhì)地進行綜合評定，其中滿分為最佳，0分為最不理想。腐乳的感官評價表見表1。

表1 腐乳感官評價表Table 1 The sensory evaluation table of sufu

評價人員：由有相關(guān)食品評價經(jīng)驗的實驗室工作人員組成，共8名，年齡分布在20～30歲之間，男女比例1∶1。評價人員必須身體健康，有正常靈敏的視覺、嗅覺、味覺；評價人員必須具有一定的品評技能，經(jīng)過集中訓(xùn)練后取得品評資格。

品評室：感官評價室應(yīng)該陳設(shè)簡單，光線充足，不存放其他氣味的物品，以免干擾腐乳味覺評價。

具體評定步驟：從瓶中取腐乳樣品放置于白色小碟上，聞香氣；用小刀輕刮腐乳表面，觀察有無白點；將腐乳切開，觀察腐乳內(nèi)外部的顏色和切面光澤程度；用筷子前端輕刮腐乳，觀察其軟硬程度和黏附性；夾取少量腐乳入口，品嘗其味道和質(zhì)地細膩程度。品后漱口，評價人員對同一樣品重復(fù)評價3次后取平均值。

1.4.4 后酵條件優(yōu)化單因素試驗

1.4.4.1 鹽濃度

取腐乳毛坯，腌制鹽濃度分別為4%、6%、8%、10%、12%，置于5個玻璃罐中，然后加入13%酒精含量的湯料，裝罐后在25 ℃下后發(fā)酵30 d，測定第30天腐乳的酪氨酸含量及感官評分，每個鹽濃度分別做3個平行。

1.4.4.2 酒精含量

取腐乳毛坯，腌制鹽濃度為8%，放置于5個玻璃罐中，分別加入含量為5%、9%、13%、17%、21%食用酒精的湯料，裝罐后在25 ℃下后發(fā)酵30 d，測定第30天腐乳的酪氨酸含量及感官評分，每個酒精含量分別做3個平行。

1.4.4.3 后酵溫度

取腐乳毛坯，腌制鹽濃度為8%，加入13%食用酒精含量的湯料進行裝罐，然后分別于15，20，25，30，35 ℃下后發(fā)酵30 d，測定發(fā)酵完成的腐乳的酪氨酸含量及感官評分，每個后酵溫度分別做3個平行。

表2 腐乳后酵的單因素試驗Table 2 Single factor experiment of post fermentation of sufu

1.4.5 響應(yīng)面試驗

根據(jù)1.4.4單因素試驗的結(jié)果，選取鹽濃度(%)、酒精含量(%)、后酵溫度(℃)為試驗因素，由于后酵60 d的試驗結(jié)果更顯著，因此以第60天的酪氨酸含量(mg/100 g)為響應(yīng)值設(shè)計試驗，試驗因素及水平見表3。

表3 響應(yīng)面設(shè)計因素水平及編碼Table 3 Factors, levels and codes of response surface design

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 鹽濃度對酪氨酸含量及感官評分的影響

腐乳鹽濃度為腌制時的用鹽量與毛坯重量的比值，控制腐乳湯汁中酒精含量為13%及腐乳后酵溫度為25 ℃，測得不同鹽濃度腐乳中酪氨酸含量及感官評分，結(jié)果見圖1。

圖1 不同鹽濃度腐乳后酵過程中酪氨酸含量和感官評分Fig.1 Tyrosine content and sensory scores of sufu with different salt concentrations during post fermentation

由圖1可知，在4%～8%鹽濃度范圍內(nèi)酪氨酸含量最低，感官評分最高。當鹽濃度大于8%時，酪氨酸含量和感官評分都顯著降低。因此，選擇鹽濃度在4%～8%的腐乳進行下一步試驗。

2.1.2 酒精含量對腐乳酪氨酸含量及感官評分的影響

在鹽濃度為8%及后酵溫度為25 ℃的條件下，湯汁酒精含量對腐乳酪氨酸含量及感官評分的影響見圖2。

圖2 不同酒精含量腐乳后酵過程中酪氨酸含量和感官評分Fig.2 Tyrosine content and sensory scores of sufu with different alcohol content during post fermentation

由圖2可知，隨著腐乳湯汁中酒精含量的升高，酪氨酸的含量逐漸降低，說明酒精能夠抑制腐乳后酵過程中酪氨酸的生成。這主要是由于酒精能抑制微生物的酶系作用，可以抑制羧肽酶活性，減少酪蛋白的過度酶解。同時，酒精可以結(jié)合腐乳發(fā)酵過程中產(chǎn)生的有機酸等物質(zhì)，生成酯類等芳香物質(zhì)，形成腐乳獨特的風(fēng)味[21]。但酒精含量過高會產(chǎn)生明顯的酒味，影響腐乳的感官品質(zhì)，消費者接受度低。當酒精含量大于13%之后，腐乳的感官評分逐漸降低，因此，選擇酒精含量在9%～13%左右的腐乳湯汁進行下一步試驗。

2.1.3 后酵溫度對酪氨酸含量及感官評分的影響

在腐乳鹽濃度8%及湯汁中酒精含量13%的條件下，測得不同溫度下后酵腐乳中酪氨酸含量及感官評分，結(jié)果見圖3。

圖3 不同后酵溫度下腐乳的酪氨酸含量和感官評分Fig.3 Tyrosine content and sensory scores of sufu under different post-fermentation temperatures

由圖3可知，隨著腐乳后酵溫度的升高，腐乳中酪氨酸的含量及感官評分均呈先增加后減少的趨勢。后酵溫度在20～30 ℃之間，酪氨酸的含量較高。這是因為毛霉菌絲最適的產(chǎn)酶溫度為26～28 ℃，在此階段會生成大量的蛋白酶分解蛋白質(zhì)，從而使酪氨酸的含量增加[22]。后酵溫度過低，腐乳塊的口感相對較硬，不利于腐乳達到成熟條件；后酵溫度過高，腐乳塊較軟，易破碎，影響口感。所以，選擇15～25 ℃的后酵溫度進行試驗。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗設(shè)計及結(jié)果分析

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以鹽濃度(A)、酒精含量(B)、后酵溫度(C)為自變量，以腐乳中的酪氨酸含量(Y)為因變量設(shè)計三因素三水平共17組試驗，其中有12個析因點和5個中心點。響應(yīng)面設(shè)計及數(shù)據(jù)見表4。

表4 腐乳后酵條件的響應(yīng)面試驗設(shè)計及數(shù)據(jù)結(jié)果Table 4 Response surface experiment design and data results of post-fermentation conditions of sufu

以鹽濃度(A)、酒精含量(B)、后酵溫度(C)為自變量，以腐乳中的酪氨酸含量(Y)為因變量，建立回歸模型?；貧w方程：Y=69.63-5.47A-4.99B+3.44C+3.46AB-1.71AC-2.72BC+4.64A2+2.86B2+5.38C2。

為了檢驗方程的有效性，對結(jié)果進行方差分析，見表5。

表5 酪氨酸含量回歸模型方差分析結(jié)果Table 5 Analysis results of variance of tyrosine content regression model

由表5可知，本試驗建立的模型極顯著(P<0.01)，因變量與自變量之間的線性關(guān)系也極顯著(R2=0.9678)。該模型調(diào)整復(fù)相關(guān)系數(shù)RAdj2=0.9264，說明該模型能夠解釋92.64%的響應(yīng)值的變化，擬合程度很好。模型失擬項表示模型預(yù)測值與實際值不擬合的概率，模型失擬項的P值為0.6805>0.05，不顯著，說明該模型的選擇和建立是合理的。

由回歸方程系數(shù)顯著性檢驗可知，該模型的一次項A、B、C對酪氨酸含量(Y)的影響極顯著(P<0.01)；二次項A2、C2對酪氨酸含量的影響極顯著(P<0.01)，B2對酪氨酸含量的影響顯著(P<0.05)；交互項AB、BC的影響顯著(P<0.05)，AC的影響不顯著(P>0.05)。由此可知，除AC項外，各因素對腐乳后酵60 d中酪氨酸含量(Y)的影響都十分顯著。

根據(jù)響應(yīng)面試驗得到響應(yīng)曲面，特定的響應(yīng)面(Y酪氨酸含量)與對應(yīng)的因變量A(鹽濃度)、B(酒精含量)、C(后酵溫度)共同建立出一個三維空間在二維平面上的等高線圖，根據(jù)回歸方程繪制響應(yīng)面直觀圖。曲面越陡峭、傾斜度越高說明各因素之間的交互作用對響應(yīng)值的影響越大；同一等高線上的每個點表示的數(shù)值相同，而等高線的疏密程度及呈現(xiàn)的形狀可以反映各因素之間交互作用的顯著性。各因素之間的相互作用以及各因素對響應(yīng)值酪氨酸含量的影響見圖4～圖6。

圖4 鹽濃度與酒精含量對酪氨酸含量的影響Fig.4 Effect of salt concentration and alcohol content on tyrosine content

由圖4可知，當后酵溫度不變時，隨著鹽濃度和湯汁中酒精含量的升高，酪氨酸的含量均呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢。由此說明，適當提高鹽濃度及酒精含量均能顯著抑制后酵過程中酪氨酸的生成，但同時也應(yīng)考慮到鹽濃度和湯汁中酒精含量對感官評分的影響。

圖5 鹽濃度與后酵溫度對酪氨酸含量的影響Fig.5 Effect of salt concentration and post-fermentation temperature on tyrosine content

由圖5可知，當鹽濃度保持不變時，隨著后酵溫度的升高，酪氨酸含量呈先降低后升高的趨勢；當后酵溫度不變時，隨著鹽濃度的升高，酪氨酸含量呈降低趨勢。

圖6 酒精含量與后酵溫度對酪氨酸含量的影響Fig.6 Effect of alcohol content and post-fermentation temperature on tyrosine content

由圖6可知，當后酵溫度不變時，酪氨酸含量隨著腐乳湯汁中酒精含量的升高而逐漸降低；當腐乳湯汁中酒精含量不變時，酪氨酸含量隨著后酵溫度的升高呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢。

鹽濃度、湯汁中酒精含量以及后酵溫度對腐乳中酪氨酸含量均有顯著影響，但相比于鹽濃度和酒精含量的變化，后酵溫度的變化對酪氨酸含量的影響相對較小。根據(jù)模型分析得出優(yōu)化腐乳后酵條件的最佳工藝參數(shù)為鹽濃度6.64%、酒精含量11.36%、后酵溫度19.45 ℃，在此條件下后酵60 d的腐乳中酪氨酸含量為67.0 mg/100 g。

2.3 最佳工藝條件試驗驗證

為了檢驗試驗結(jié)果與真實情況是否一致，對上述響應(yīng)面優(yōu)化腐乳后酵條件進行試驗驗證?？紤]到實際操作的便利，將最佳工藝條件修正為腐乳鹽濃度6.5%、腐乳湯汁中酒精含量11%、后酵溫度20 ℃。使用試驗得出的最佳工藝參數(shù)進行3次平行試驗，求其平均值，得到實際的酪氨酸含量為66.7 mg/100 g。

3 結(jié)論

本研究通過單因素試驗結(jié)合響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果分析得出，鹽濃度、酒精含量及后酵溫度對酪氨酸含量和感官評分的影響極顯著(P<0.01)，鹽濃度與酒精含量以及后酵溫度與酒精含量的交互作用影響顯著(P<0.05)，而鹽濃度和后酵溫度的交互作用不顯著(P>0.05)。腐乳后酵條件最佳工藝參數(shù)為鹽濃度6.64%、酒精含量11.36%、后酵溫度19.45 ℃，在此條件下腐乳后酵60 d時的酪氨酸含量為67.0 mg/100 g?；诖斯に嚄l件，后酵60 d的腐乳中酪氨酸含量最低。

腐乳中白點問題存在已久，長期以來未得到解決，以往的研究多專注于腐乳的前酵過程，通過添加酸、馴化菌種等方式減少腐乳中白點的產(chǎn)生，這些方式往往會給腐乳風(fēng)味帶來不利的影響。本試驗專注于優(yōu)化腐乳的后酵條件，有效地降低了腐乳中的酪氨酸含量，抑制了白點的產(chǎn)生，提升了腐乳的感官品質(zhì)。