董建設(shè)， 趙俊峰， 張林超， 陳瑞廷， 于小明

(河南省中醫(yī)院泌尿外科，河南 鄭州 450000)

前列腺癌是生殖系統(tǒng)和泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，也是老年男性的主要健康問題[1-2]。由于早期篩查和癌癥治療方案的重要進(jìn)展，過去40年間前列腺癌患者的總生存率和5年生存率有所提高[3]。但是，一旦疾病發(fā)展為去勢(shì)抵抗性前列腺癌，預(yù)后將急劇惡化[4-5]。因此，進(jìn)一步闡明前列腺癌進(jìn)展的分子機(jī)制對(duì)于尋找有效的治療方法具有重要意義。毛蘭素是從石斛中提取的聯(lián)芐類化合物，研究表明，毛蘭素可抑制肺癌A549細(xì)胞活力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6]；還可有效抑制葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞C918、MUM-2B的增殖，阻滯細(xì)胞周期，促進(jìn)葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞凋亡[7]；能夠抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，阻滯細(xì)胞周期[8]。根據(jù)報(bào)道，長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)LINC01354在甲狀腺癌中異常表達(dá)[9]，可作為肺腺癌特異性診斷和預(yù)后的獨(dú)立生物標(biāo)志物[10]。LINC01354在非小細(xì)胞肺癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)，敲低其表達(dá)可抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖和侵襲[11]。資料顯示，miR-515-5p在前列腺癌組織和細(xì)胞中低表達(dá)，抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[12]。但毛蘭素和LINC01354對(duì)前列腺癌細(xì)胞糖酵解、增殖、遷移和侵襲的影響，以及LINC01354與miR-515-5p的靶向關(guān)系，且毛蘭素是否通過調(diào)控lncRNALINC01354/miR-515-5p影響前列腺癌細(xì)胞糖酵解、增殖、遷移和侵襲目前還尚未可知。因此，本研究以前列腺癌細(xì)胞DU145為對(duì)象，評(píng)價(jià)毛蘭素在細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和糖酵解中的功能，旨在闡明其潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 人前列腺癌細(xì)胞株DU145購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞研究所。

1.2 試劑與藥物 毛蘭素(純度≥99.7%，批號(hào)111874-201603)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；噻唑藍(lán)(MTT)、RIPA緩沖液購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；LINC01354過表達(dá)/小干擾RNA(pcDNA-LINC01354/si-LINC01354)、各自陰性對(duì)照(pcDNA/si-NC)、miR-515-5p模擬物、模擬物陰性對(duì)照miR-NC購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；葡萄糖測(cè)定試劑盒購(gòu)自美國(guó)BioVision公司；乳酸測(cè)定試劑盒、雙辛可寧酸蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Transwell小室(8 μm孔徑)、基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences公司；增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光液購(gòu)自美國(guó)EMD Millipore公司；TRIzol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；PrimeScript RT-PCR、SYBR Green Master Mix購(gòu)自日本TaKaRa公司；熒光素酶載體、熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Promega公司；細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1)、p21、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteases，MMP)-2、MMP-9、GAPDH一抗和辣根過氧化物酶結(jié)合的IgG二抗均購(gòu)自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 DU145細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2潮濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。毛蘭素使用二甲基亞砜(DMSO，終濃度0.1%)助溶，并用DMEM培養(yǎng)基稀釋至相應(yīng)劑量[6]。細(xì)胞分為對(duì)照組(0.1% DMSO)，毛蘭素低、中、高劑量組(20、40、80 nmol/L毛蘭素)，pcDNA組(轉(zhuǎn)染pcDNA)，pcDNA-LINC01354組(轉(zhuǎn)染pcDNA-LINC01354)，si-NC組(轉(zhuǎn)染si-NC)，si-LINC01354組(轉(zhuǎn)染si-LINC01354)，毛蘭素+pcDNA組(轉(zhuǎn)染pcDNA并給予80 nmol/L毛蘭素)，毛蘭素+pcDNA-LINC01354組(轉(zhuǎn)染pcDNA-LINC01354并給予80 nmol/L毛蘭素)，毛蘭素作用時(shí)間均為48 h。將DU145細(xì)胞以每孔2×105個(gè)的密度接種至6孔板，根據(jù)說明書操作步驟，通過Lipofectamine 2000與轉(zhuǎn)染復(fù)合物一起孵育24 h，進(jìn)行轉(zhuǎn)染，再通過RT-qPCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 葡萄糖消耗和乳酸水平檢測(cè) DU145細(xì)胞在無葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)16 h，然后在常氧條件下與高葡萄糖DMEM培養(yǎng)基再孵育24 h，去除培養(yǎng)基，使用基于熒光的葡萄糖測(cè)定試劑盒檢測(cè)DU145細(xì)胞內(nèi)葡萄糖水平，使用基于乳酸氧化酶的比色測(cè)定法在540 nm波長(zhǎng)處讀取吸光度，并計(jì)算乳酸水平[13]。

1.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 DU145細(xì)胞以每孔5×103個(gè)的密度接種至96孔板，按“1.3”項(xiàng)下分組并孵育48 h，每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，繼續(xù)孵育3～4 h，去除上清液，加入200 μL DMSO振蕩20 min，使用Epoch微孔板分光光度計(jì)在490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)光密度(OD)值，并計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。

1.6 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力 將無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋的DU145細(xì)胞以每孔4×104個(gè)的密度接種至Transwell小室上室，并將含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基加入到下室，培養(yǎng)24 h，用棉簽除去膜上側(cè)的細(xì)胞，膜下側(cè)的細(xì)胞在室溫下用4%多聚甲醛固定30 min，并在室溫下用0.1%結(jié)晶紫染色30 min，侵襲實(shí)驗(yàn)則需在Transwell小室的上室包被基質(zhì)膠。使用光學(xué)顯微鏡獲取圖像，計(jì)數(shù)遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.7 Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中cyclin D1、p21、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá) 收集各組細(xì)胞，使用含蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA緩沖液，置于冰上裂解40 min，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，使用雙辛可寧酸蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒檢測(cè)蛋白濃度并定量。將蛋白與上樣緩沖液混合煮沸10 min進(jìn)行變性，取40 μg蛋白樣品通過10% SDS-PAGE膠電泳分離，然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，室溫下封閉2 h，加入一抗cyclin D1、p21、MMP-2、MMP-9(1∶1 000)在4 ℃下孵育過夜，加入辣根過氧化物酶結(jié)合的IgG二抗(1∶5 000)37 ℃孵育2 h，采用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光液曝光顯影，以GAPDH為內(nèi)參，分析cyclin D1、p21、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)。

1.8 RT-qPCR法檢測(cè)細(xì)胞LINC01354和miR-515-5pmRNA表達(dá) 收集各組細(xì)胞，使用TRIzol試劑從細(xì)胞中分離總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA并定量2 μg。LINC01354正向引物序列5′-GCAATGGTTTGGGCAACTGTAT-3′，反向引物序列5′-GAAAAAGCAAGCTGCCATGAGA-3′；miR-515-5p正向引物序列5′-CGGGTTCTCCAAAAGAAAGCA-3′，反向引物序列5′-CAGCCACAAAAGAGCACAAT-3′；GAPDH正向引物序列5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′，反向引物序列5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′；U6正向引物序列5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物序列5′-AACGCTTCA CGAATTTGCGT-3′。使用GAPDH和U6對(duì)lncRNA和miRNA的表達(dá)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，以2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)。

1.9 熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè) 應(yīng)用在線軟件LncBase Predicted v.2鑒定出miR-515-5p作為L(zhǎng)INC01354的潛在靶標(biāo)。將含有miR-515-5p假定結(jié)合位點(diǎn)的LINC01354野生型3’非編碼區(qū)(3’UTR)及其突變體擴(kuò)增并克隆到psiCHECK-2熒光素酶啟動(dòng)子載體中，產(chǎn)生WT-LINC01354或MUT-LINC01354質(zhì)粒。然后使用Lipofectamine 2000試劑將WT-LINC01354或MUT-LINC01354與miR-515-5p模擬物或miR-NC共轉(zhuǎn)染DU145細(xì)胞，48 h后收集細(xì)胞，并根據(jù)說明書使用熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定系統(tǒng)評(píng)估熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 毛蘭素對(duì)DU145細(xì)胞糖酵解的影響 如表1所示，與對(duì)照組比較，毛蘭素各劑量組細(xì)胞葡萄糖消耗和乳酸水平均減少(P<0.05)，且呈劑量依賴性(P<0.05)。

表1 毛蘭素對(duì)DU145細(xì)胞糖酵解的影響

2.2 毛蘭素對(duì)DU145細(xì)胞增殖的影響 如圖1、表2所示，與對(duì)照組比較，毛蘭素各劑量組細(xì)胞增殖抑制率和p21蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，cyclin D1蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，且呈劑量依賴性(P<0.05)。

圖1 細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白表達(dá)

表2 毛蘭素對(duì)DU145細(xì)胞增殖的影響

2.3 毛蘭素對(duì)DU145細(xì)胞遷移和侵襲的影響 如圖2、表3所示，與對(duì)照組比較，毛蘭素各劑量組遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)減少(P<0.05)，MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，且呈劑量依賴性(P<0.05)。

注：A為遷移和侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)，B為DU145細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)(×200)。

表3 毛蘭素對(duì)DU145細(xì)胞遷移和侵襲的影響

2.4 毛蘭素對(duì)DU145細(xì)胞LINC01354、miR-515-5pmRNA表達(dá)的影響 如表4所示，與對(duì)照組比較，毛蘭素各劑量組細(xì)胞內(nèi)LINC01354表達(dá)降低(P<0.05)，miR-515-5pmRNA表達(dá)升高(P<0.05)，且呈劑量依賴性(P<0.05)。

表4 毛蘭素對(duì)DU145細(xì)胞中LINC01354、miR-515-5p mRNA表達(dá)的影響

2.5LINC01354靶向調(diào)控miR-515-5p表達(dá) 如圖3、表5所示，LINC01354與miR-515-5p含有互補(bǔ)的核苷酸序列。與miR-NC組比較，miR-515-5p組抑制WT-LINC01354的熒光素酶活性(P<0.05)；miR-NC組與miR-515-5p組MUT-LINC01354的熒光素酶活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。如表6所示，pcDNA-LINC01354組miR-515-5p表達(dá)低于pcDNA組(P<0.05)；si-LINC01354組miR-515-5p表達(dá)高于si-NC組(P<0.05)。

圖3 LINC01354序列中含有與miR-515-5p互補(bǔ)的核苷酸序列

表5 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

表6 LINC01354調(diào)控miR-515-5p表達(dá)

2.6 抑制LINC01354表達(dá)對(duì)DU145細(xì)胞糖酵解、增殖、遷移和侵襲的影響 如圖4、表7～8所示，與si-NC組比較，si-LINC01354組細(xì)胞LINC01354 mRNA表達(dá)和cyclin D1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，miR-515-5pmRNA表達(dá)和p21蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，葡萄糖消耗和乳酸水平降低(P<0.05)，細(xì)胞增殖抑制率升高(P<0.05)，遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)減少(P<0.05)。

注：A為細(xì)胞增殖、遷移侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)，B為細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)(×200)。

2.7LINC01354過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了毛蘭素對(duì)DU145細(xì)胞糖酵解、增殖、遷移和侵襲的作用 如圖5、表9～10所示，與毛蘭素+pcDNA組比較，毛蘭素+pcDNA-LINC01354組細(xì)胞LINC01354 mRNA表達(dá)和cyclin D1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，miR-515-5pmRNA表達(dá)和p21蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，葡萄糖消耗和乳酸水平升高(P<0.05)，細(xì)胞增殖抑制率降低(P<0.05)，遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)增加(P<0.05)。

表7 抑制LINC01354表達(dá)對(duì)DU145細(xì)胞糖酵解、增殖、遷移和侵襲的影響

表8 抑制LINC01354表達(dá)對(duì)DU145細(xì)胞增殖、遷移和侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

注：A為細(xì)胞增殖、遷移侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)，B為細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)(×200)。

3 討論

目前，毛蘭素的多種藥理作用已被闡明，包括抗氧化和抗腫瘤活性[14]。數(shù)項(xiàng)研究證明，毛蘭素在多種不同的人類癌細(xì)胞中均具有突出的抗癌活性，其中包括乳腺癌細(xì)胞系T47D，人類肝癌Bel7402和黑色素瘤A375細(xì)胞、人類早幼粒細(xì)胞白血病HL-60細(xì)胞、人骨肉瘤細(xì)胞[15]、宮頸癌HeLa細(xì)胞[16]和鼻咽癌細(xì)胞系(NPC-039和NPC-BM)[17]等。毛蘭素能通過誘導(dǎo)細(xì)胞死亡和抑制肺癌細(xì)胞中的細(xì)胞遷移而發(fā)揮抗肺癌活性[18]；毛蘭素還能降低肝癌細(xì)胞的生存能力，抑制其增殖和遷移，誘導(dǎo)G2/M期阻滯，增強(qiáng)癌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的增加和線粒體膜電位的降低，并調(diào)節(jié)肝癌HepG2和SMMC-7721細(xì)胞中抗凋亡和促凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)[19]。然而毛蘭素在前列腺癌中的功能與機(jī)制仍有待探索。腫瘤細(xì)胞中的各種代謝途徑(包括糖酵解和核酸，蛋白質(zhì)或脂質(zhì)的生物合成)被改變，代表了抗癌治療的有希望的靶點(diǎn)[20]。本研究方向，各劑量毛蘭素均能降低DU145細(xì)胞的葡萄糖消耗、乳酸水平、遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)，提高細(xì)胞增殖抑制率，并呈劑量依賴性，表明毛蘭素具有抑制前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和糖酵解的作用。此外，各劑量毛蘭素均降低了cyclin D1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)，提高了p21蛋白表達(dá)，并呈劑量依賴性，進(jìn)一步證明了毛蘭素抗前列腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的能力。

lncRNA是一組可以在染色質(zhì)修飾，轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)節(jié)基因表達(dá)的非蛋白質(zhì)RNA[21]。迄今為止，已報(bào)道許多與前列腺癌相關(guān)的lncRNA的異常表達(dá)，并通過靶向相應(yīng)的基因來影響前列腺癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移或凋亡[22]。

表9 LINC01354過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了毛蘭素對(duì)DU145細(xì)胞糖酵解、增殖、遷移和侵襲的作用

表10 LINC01354過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了毛蘭素對(duì)DU145細(xì)胞增殖、遷移和侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的作用

LINC01354是lncRNAs的成員，在骨肉瘤組織和細(xì)胞中過表達(dá)，上調(diào)其表達(dá)可促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的侵襲[23]；也在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，干擾其表達(dá)可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和遷移[24]。盡管如此，LINC01354在前列腺癌中的具體作用尚未得到充分解釋。本研究首次發(fā)現(xiàn)，毛蘭素對(duì)前列腺癌細(xì)胞中LINC01354的表達(dá)具有抑制作用。在抑制LINC01354表達(dá)后，前列腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，cyclin D1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)均降低，且葡萄糖消耗和乳酸水平減少，p21蛋白表達(dá)升高，表明LINC01354參與前列腺癌的發(fā)生發(fā)展，抑制其表達(dá)有助于抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和糖酵解。此外，LINC01354過表達(dá)后，毛蘭素抑制前列腺癌細(xì)胞葡萄糖消耗和乳酸水平，增殖、遷移和侵襲，cyclin D1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)的作用均被逆轉(zhuǎn)，其促進(jìn)p21蛋白表達(dá)的作用也被逆轉(zhuǎn)。表明毛蘭素可能通過下調(diào)前列腺癌細(xì)胞中LINC01354的表達(dá)，發(fā)揮腫瘤抑制功能。

miRNA是長(zhǎng)度在20至22個(gè)核苷酸之間的非編碼RNA分子，在進(jìn)化中高度保守，主要通過調(diào)控下游基因來調(diào)節(jié)重要的細(xì)胞過程[25]。lncRNA被證明通過結(jié)合miRNA來調(diào)節(jié)腫瘤的進(jìn)程[26]，如LINC00673可以通過充當(dāng)miR-515-5p的海綿來促進(jìn)乳腺癌進(jìn)展[27]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-515-5p在乳腺癌組織和細(xì)胞中下調(diào)表達(dá)，參與乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲調(diào)控[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，毛蘭素以劑量依賴性地促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞中miR-515-5p的表達(dá)。此外，上調(diào)細(xì)胞中LINC01354表達(dá)時(shí)，miR-515-5p表達(dá)被抑制；下調(diào)LINC01354表達(dá)時(shí)，miR-515-5p表達(dá)被促進(jìn)。研究還發(fā)現(xiàn)，LINC01354過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了毛蘭素促進(jìn)miR-515-5p表達(dá)的作用，表明毛蘭素通過LINC01354/miR-515-5p發(fā)揮抗前列腺癌作用。

綜上所述，毛蘭素能夠通過調(diào)節(jié)LINC01354/miR-515-5p表達(dá)抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和糖酵解。因此，毛蘭素是一種很有前途的抗癌化合物。