羅瑞熙， 趙立鳳， 李帥帥

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025)

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一種具有多向分化潛能的干細(xì)胞，具有免疫調(diào)節(jié)、組織損傷修復(fù)的功能[1]，有一定的臨床應(yīng)用前景[2]。課題組前期研究顯示，MSCs可以減輕高脂飼料誘導(dǎo)的大鼠脂代謝紊亂及早期主動脈內(nèi)膜增厚現(xiàn)象；還可以通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑減輕人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)脂毒性損傷[3]。當(dāng)MSCs長期處于高脂、高糖、炎性、缺氧等微環(huán)境下，會損傷細(xì)胞存活率和功能，進(jìn)而降低MSCs的治療效果[4]。

目前，中藥復(fù)方及單體成分對MSCs功能的改善逐步成為研究熱點[5]。姜黃素是從姜科姜黃屬植物姜黃、郁金、莪術(shù)的干燥根莖中提取的一種天然有效成分[6]，具有抗炎、抗氧化、調(diào)脂、抗病毒、抗感染、抗腫瘤、抗凝、抗肝纖維化等藥理活性，而且毒性低，不良反應(yīng)小[7]。研究表明，姜黃素可通過調(diào)節(jié)Akt/ERK通路改善線粒體功能來減輕H2O2誘導(dǎo)的大鼠MSCs氧化應(yīng)激損傷[8]；通過調(diào)節(jié)TERT通路促進(jìn)大鼠MSCs增殖，延緩MSCs衰老[9]，但是否可通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑減輕高脂環(huán)境下MSCs脂毒性損傷尚不明確。因此，本研究擬建立棕櫚酸誘導(dǎo)的MSCs脂毒性損傷模型，以內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激為切入點，探討姜黃素對MSCs脂毒性損傷的調(diào)節(jié)作用，同時觀察其干預(yù)是否有助于提高M(jìn)SCs對HUVECs的保護(hù)作用，為相關(guān)臨床應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 細(xì)胞 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)和人原代臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)購自美國ScienCell公司。

1.2 試劑與藥物 姜黃素(美國Selleck公司，貨號S1848，純度99.83%)。DMEM低糖培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Gibco公司，批號12320032、10091148)；ECM內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(美國ScienCell公司，貨號1001)；棕櫚酸[愛必信(上海)生物科技有限公司，貨號abs47001260]；AccutaseTM細(xì)胞消化液(美國eBioscience公司，批號00-4555-56)；CCK-8細(xì)胞活性檢測試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所，貨號CK04)；油紅O染色試劑盒、4%組織細(xì)胞固定液、牛血清白蛋白BSA、RIPA細(xì)胞高效裂解液、10×TBST緩沖液(北京索萊寶科技有限公司，貨號G1262、P1110、A8850、R0010、T1081)；甘油三酯(TG)檢測試劑盒(美國Abnova公司，貨號K622-100)；TRIzolTMReagent(美國Ambion公司，批號15596026)；5×qRT SuperMix、2×SYBR Green qPCR Master Mix、C/EBP 同源蛋白(C/EBP-homologous protein，CHOP)抗體(美國Bimake公司，貨號JW20、B21202、A5462)；BCA蛋白定量試劑盒、10% PAGE凝膠快速制備試劑盒、蛋白酶抑制劑混合液、蛋白上樣緩沖液、三色預(yù)染蛋白Marker、0.22 μm PVDF膜、快速轉(zhuǎn)膜緩沖液(上海雅酶生物科技有限公司，貨號ZJ102、PG112、GRF101、LT103、WJ103、WJ001、PS101S)；脫脂奶粉(北京博奧拓達(dá)科技有限公司，批號232100)；免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(binding immunoglobulin protein，BiP)抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，貨號11587-1-AP)；β-actin抗體(武漢愛博泰克生物科技有限公司，貨號AC026)；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，貨號ZB-2301)；超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(美國Thermo公司，貨號32209)。甲醇、異丙醇、無水乙醇均為分析純(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)。

1.3 儀器 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Sanvall公司)；超凈工作臺(美國Nuaire公司)；全自動多功能酶標(biāo)儀、熒光分光光度計(美國Thermo公司)；低溫離心機(德國Beckman公司)；Transwell共培養(yǎng)小室、超純水系統(tǒng)(美國Milipore公司)；高壓滅菌鍋(德國Systec公司)；倒置相差顯微鏡(德國Leica公司)；PCR擴增儀、熒光定量PCR儀、蛋白凝膠電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；超低溫冰箱(日本三洋公司)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) MSCs用含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM低糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，HUVECs用ECM內(nèi)皮專用培養(yǎng)基培養(yǎng)，均置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育。待細(xì)胞生長至80%融合度時進(jìn)行傳代，取對數(shù)生長期者用于實驗。在共培養(yǎng)實驗下，MSCs種于Traswell小室上層，HUVECs種于6孔板培養(yǎng)皿底部，兩者初始細(xì)胞比例為1∶5，共培養(yǎng)培養(yǎng)基采用ECM，除部分RT-qPCR相關(guān)實驗外，共培養(yǎng)時間為24 h。

2.2 分組及給藥 MSCs細(xì)胞分為4組，分別為正常組、姜黃素組、棕櫚酸(200 μmol/L)組、棕櫚酸(200 μmol/L)+姜黃素(5 μmol/L)組，加藥干預(yù)以探究黃素干預(yù)對MSCs脂毒性損傷及生物功能的影響；HUVECs細(xì)胞分為4組，分別為正常組、棕櫚酸(50 μmol/L)組、棕櫚酸(50 μmol/L)+MSCs(200 μmol/L棕櫚酸預(yù)處理24 h)組、棕櫚酸(50 μmol/L)+MSCs(200 μmol/L棕櫚酸+5 μmol/L姜黃素預(yù)處理24 h)組，MSCs與HUVECs共培養(yǎng)以探究姜黃素預(yù)處理對MSCs提高HUVECs活性的影響。

2.3 細(xì)胞活性檢測 細(xì)胞以每孔8 000個的密度接種于96孔板，按“2.1”“2.2”項下方法分組、培養(yǎng)和給藥，培養(yǎng)24 h后吸棄培養(yǎng)基，PBS清洗1次，加入100 μL CCK8工作液，在37 ℃下孵育2～6 h后, 采用酶標(biāo)儀在450 nm波長處檢測光密度(OD)值，計算細(xì)胞相對活性。

2.4 油紅O染色 細(xì)胞接種于6孔板，按“2.1”“2.2”項下方法分組、培養(yǎng)、給藥，培養(yǎng)24 h后吸棄培養(yǎng)基，PBS清洗1次，10%中性甲醛固定10 min，吸棄中性甲醛固定液，PBS清洗3次，取油紅O工作液1 mL加入6孔板中，室溫染色30 min，吸棄染液，60%異丙醇漂洗后PBS清洗3次，蘇木素復(fù)染后PBS清洗3次，在倒置顯微鏡下觀察并拍照采集圖像。

2.5 細(xì)胞TG水平檢測 細(xì)胞接種于6孔板，按“2.1”“2.2”項下方法分組、培養(yǎng)、給藥，培養(yǎng)24 h后將各組細(xì)胞數(shù)矯正為一致，每孔加入100 μL脂質(zhì)提取緩沖液，蓋上孔板蓋并用封口膜密封，置于90～100 ℃烘箱中孵育30 min，當(dāng)液體呈現(xiàn)渾濁時將孔板取出，并降溫至室溫，振蕩1 min混勻液體，吸取50 μL加到96孔板上，每孔加入2 μL脂肪酶溶液，室溫靜置10 min，按照每孔2 μL探針、2 μL酶混合液、46 μL稀釋緩沖液的比例配制反應(yīng)液，并加入相應(yīng)孔中，室溫避光孵育30 min，采用酶標(biāo)儀在570 nm波長處檢測OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各組細(xì)胞TG水平。

2.6 RT-qPCR法檢測BiP、CHOP、XBP1 mRNA表達(dá) 細(xì)胞接種于6孔板，按“2.1”“2.2”項下方法分組、培養(yǎng)、給藥，培養(yǎng)12 h后收集細(xì)胞，TRIzol法提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用Bio-Rad熒光定量PCR儀進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 1 min，共39個循環(huán)；熔解曲線反應(yīng)條件為65～95 ℃ 10 s (每0.5 ℃梯度檢測)。結(jié)果采用2-ΔΔCT相對定量法分析。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列見表1。

表1 引物序列

2.7 Western blot法檢測BiP、CHOP蛋白表達(dá) 細(xì)胞接種于6孔板，按“2.1”“2.2”項下方法分組、培養(yǎng)、給藥，收集細(xì)胞，加入含1% PMSF的RIPA細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，BCA蛋白濃度試劑盒檢測蛋白濃度后在-80 ℃下保存?zhèn)溆?。蛋白?jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h，加入一抗4 ℃孵育過夜，PBST洗膜3次，每次5 min，加入二抗(1∶5 000)，37 ℃搖床上孵育1 h，PBST洗膜3次，每次5 min，ECL顯影發(fā)光液輕微沖洗，置于凝膠成像儀中進(jìn)行曝光，采用Image J pro軟件進(jìn)行灰度分析，以β-actin為內(nèi)參，計算蛋白相對表達(dá)。

3 結(jié)果

3.1 姜黃素減輕棕櫚酸誘導(dǎo)的MSCs活性損傷 姜黃素在5 μmol/L濃度以下對MSCs無毒性作用，見表2。棕櫚酸刺激MSCs 24 h后，對細(xì)胞的毒性作用呈劑量依賴性，見表3，故選取200 μmol/L棕櫚酸刺激24 h建立MSCs脂毒性損傷模型。如表4所示，棕櫚酸刺激后MSCs細(xì)胞活性降低約22%，而5 μmol/L姜黃素干預(yù)后細(xì)胞活性恢復(fù)至94%，提示姜黃素可改善棕櫚酸對MSCs細(xì)胞活性的抑制作用。

表2 姜黃素對MSCs細(xì)胞活性的影響

表3 棕櫚酸對MSCs細(xì)胞活性的影響

表4 姜黃素對棕櫚酸誘導(dǎo)的MSCs損傷細(xì)胞活性的影響

3.2 姜黃素減輕棕櫚酸誘導(dǎo)的MSCs脂質(zhì)沉積 脂質(zhì)沉積是棕櫚酸誘導(dǎo)MSCs脂毒性損傷的主要表現(xiàn)之一。如表5、圖1所示，正常組和姜黃素組均無明顯脂滴沉積；棕櫚酸刺激24 h能誘導(dǎo)MSCs脂質(zhì)沉積增加，升高TG水平(P<0.05)；姜黃素干預(yù)后能減少細(xì)胞脂質(zhì)沉積，降低TG水平(P<0.05)，提示姜黃素可減少棕櫚酸誘導(dǎo)的MSCs胞內(nèi)脂質(zhì)沉積。

表5 姜黃素對棕櫚酸誘導(dǎo)的MSCs細(xì)胞TG水平的影響

圖1 各組細(xì)胞脂質(zhì)沉積(×200)

3.3 姜黃素減輕棕櫚酸誘導(dǎo)的MSCs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 如表6所示，棕櫚酸刺激MSCs 12 h后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因BiP、CHOP、XBP1 mRNA表達(dá)均升高(P<0.05)，而5 μmol/L姜黃素干預(yù)后BiP、CHOP、XBP1 mRNA表達(dá)降低(P<0.05)。如圖2、表7所示，與正常組比較，棕櫚酸組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激早期標(biāo)志蛋白BiP和晚期標(biāo)志蛋白CHOP表達(dá)均升高(P<0.05)；與棕櫚酸組比較，姜黃素干預(yù)后BiP、CHOP蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。如圖3、表8所示，姜黃素單用對BiP、CHOP蛋白表達(dá)無明顯影響(P>0.05)。以上結(jié)果提示，姜黃素可減輕棕櫚酸誘導(dǎo)的MSCs 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。

表6 姜黃素對棕櫚酸誘導(dǎo)的MSCs細(xì)胞BiP、CHOP、XBP1 mRNA表達(dá)的影響

圖2 各組細(xì)胞BiP、CHOP的蛋白表達(dá)

圖3 姜黃素干預(yù)后MSCs細(xì)胞BiP、CHOP蛋白表達(dá)

3.4 姜黃素預(yù)處理提高M(jìn)SCs對HUVECs脂毒性損傷的保護(hù)作用 如表9所示，與正常組比較，棕櫚酸誘導(dǎo)HUVECs 24 h后細(xì)胞活性降低約50%；與棕櫚酸組比較，MSCs(棕櫚酸預(yù)處理)組HUVECs活性提高至67%左右，而MSCs(棕櫚酸+姜黃素預(yù)處理)組HUVECs活性進(jìn)一步提高至89%左右，提示姜黃素對MSCs的脂毒性損傷保護(hù)作用有助于提高其對HUVECs脂毒性損傷的保護(hù)。

表7 姜黃素對棕櫚酸誘導(dǎo)的MSCs細(xì)胞BiP、CHOP蛋白表達(dá)的影響

表8 姜黃素對MSCs細(xì)胞BiP、CHOP蛋白表達(dá)的影響

4 討論

近年來，許多研究報道中藥可通過改善MSCs細(xì)胞活性及功能從而提高M(jìn)SCs治療效果[10-11]。中藥對MSCs損傷的保護(hù)作用已被廣泛報道[12]，其中姜黃素因其抗炎、抗氧化、調(diào)脂等特性成為了近期研究熱點之一。姜黃素可通過減輕MSCs衰老從而提高M(jìn)SCs生物活性[9]；Ruzicka等[13]報道了姜黃素和MSCs對脊髓炎癥損傷具有協(xié)同干預(yù)作用；Attari 等[14]研究表明姜黃素可以提高M(jìn)SCs活性，然而對神經(jīng)干細(xì)胞活性并無影響作用。因此，本研究探索了姜黃素是否對棕櫚酸誘導(dǎo)的MSCs細(xì)胞活性損傷具有保護(hù)作用，結(jié)果提示姜黃素可提高M(jìn)SCs細(xì)胞活性。然而，在過量的游離脂肪酸刺激MSCs引起的脂毒性損傷過程中，其損傷機制與炎性損傷明顯不同，因此本研究進(jìn)一步對姜黃素是通過何種途徑干預(yù)MSCs脂毒性損傷進(jìn)行了探索。

表9 姜黃素預(yù)處理MSCs細(xì)胞對其干預(yù)棕櫚酸誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞活性的影響

脂毒性損傷一般指異常的脂質(zhì)累積而誘發(fā)的細(xì)胞損傷。目前認(rèn)為，飽和脂肪酸誘發(fā)細(xì)胞脂毒性損傷的主要機制包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑、ROS途徑、溶酶體途徑、c-JUN激酶途徑、過量神經(jīng)酰胺生成等[15]，其中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷是最近研究被認(rèn)為最重要的途徑之一。BiP是主要的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶，協(xié)助蛋白質(zhì)折疊及裝配，降解錯誤折疊的蛋白，維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)和控制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激傳感器的激活，是細(xì)胞維持正常功能的重要調(diào)節(jié)蛋白。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)未折疊蛋白增加時，BiP變?yōu)橛坞x狀態(tài)，早期BiP的解離有助于恢復(fù)蛋白質(zhì)的正確構(gòu)象，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激早期的標(biāo)志蛋白之一[16]。CHOP是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特異的促凋亡因子，通過基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控啟動下游凋亡通路。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單用姜黃素濃度在5 μmol/L以下時并未對BiP和CHOP蛋白表達(dá)有明顯的影響；而棕櫚酸能升高二者的表達(dá)，提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生；姜黃素干預(yù)能抑制棕櫚酸引起的BiP和CHOP表達(dá)升高，提示姜黃素對棕櫚酸引起的MSCs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有抑制作用。因此推測姜黃素對MSCs脂毒性損傷的改善可能是通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑實現(xiàn)的。

為了探究姜黃素對MSCs脂毒性損傷的改善是否有助于提高其干預(yù)效果，建立了體外HUVECs脂毒性損傷模型，并通過Traswell小室共培養(yǎng)系統(tǒng)將經(jīng)過棕櫚酸或棕櫚酸+姜黃素預(yù)處理24 h后的MSCs與HUVECs進(jìn)行共培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過棕櫚酸+姜黃素預(yù)處理的MSCs相對于棕櫚酸單獨預(yù)處理的MSCs能更好地提高HUVECs細(xì)胞活性(分別為67%、89%)，提示姜黃素對MSCs脂毒性損傷的改善有助于提高其干預(yù)效果。Liu等[17]研究顯示姜黃素預(yù)處理脂肪來源的MSCs有助于提高其抗凋亡和促血管生成能力，從而提高M(jìn)SCs的心肌修復(fù)能力。Wang等[18]發(fā)現(xiàn)姜黃素預(yù)處理MSCs可以提高其促小鼠皮膚傷口愈合能力，而此種促進(jìn)作用與PGC-1α/SIRT3通路有關(guān)。因此推測姜黃素預(yù)處理MSCs可提高其對多種疾病模型的干預(yù)效果，其分子機制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，姜黃素可以恢復(fù)棕櫚酸引起的MSCs細(xì)胞活性下降，減輕脂質(zhì)沉積，緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而減輕MSCs脂毒性損傷；同時，此保護(hù)作用可提高M(jìn)SCs對HUVECs脂毒性損傷的干預(yù)效果。