王 榮， 楊元嬌， 郭雅迪， 張 晶

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林 長春 130118)

薤白來源于百合科蔥屬多年生草本植物小根蒜AlliummacrostemonBge.或藠頭AlliumchinenseG.Don的干燥鱗莖，主產(chǎn)東北、河北、江蘇等地[1]，應(yīng)用于胸痹的治療。薤白中含有甾體皂苷、揮發(fā)油、多糖等成分，具有抑制血小板聚集、抗腫瘤、抗氧化等作用[2]。新鮮薤白含水量較大，放置后易腐爛變質(zhì)，因此需要及時加工處理。薤白蒸透或置沸水中燙透，曬干，在對薤白的研究中亦有直接烘干或凍干等加工方法。由于中藥成分組成的復(fù)雜性，中藥的質(zhì)量不但受其品種、產(chǎn)地、采收季節(jié)等因素的影響，與加工方法是否適當也有很大的關(guān)系[3]。近年來，有學(xué)者提出在化學(xué)含量測定的基礎(chǔ)上，開展生物活性測定，可以綜合評價并控制中藥的質(zhì)量[4]。中藥的療效與其抗氧化作用密切相關(guān)，而薤白具有一定的抗氧化活性，有望開發(fā)成一種良好的天然抗氧化劑。以新鮮薤白鱗莖為原料，采用凍干、直接烘干和煮后烘干3種加工方法處理，探討不同加工方法對薤白化學(xué)成分和抗氧化活性的影響，以期為薤白的藥材質(zhì)量控制和藥理活性研究提供參考。

1 材料

新鮮薤白于2019年10月中旬采挖于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)，經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院張晶教授鑒定為百合科植物薤白AlliummacrostemonBunge,剪掉須根和莖葉，鱗莖快速沖洗掉泥沙，瀝干，備用。

薯蕷皂苷元對照品(純度≥98%，北京世紀奧科生物科技有限公司，批號BWB50228)；L-精氨酸對照品(純度≥98%，上海哈靈生物科技有限公司，批號HLZB-339)；蘆丁對照品(純度≥98%，合肥博美生物科技有限責任公司，批號BZP0103)。無水葡萄糖對照品(純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司，批號B21882)；1，1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)、2,2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)及其他試劑均為分析純。

XB120A電子分析天平(瑞士Precisa公司)；KQ5200DB數(shù)控超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；DHG-9070A電熱恒溫鼓風干燥箱(上海申賢恒溫設(shè)備廠)；SC-3614低速離心機(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)；Telstar*LyoQuest凍干機(北京昊諾斯科技有限公司)；SPECTRO star Nano全波長掃描式酶標儀(德國BMG Labtech公司)。

2 方法

2.1 加工方法

2.1.1 凍干法 將凈制品置于-20 ℃冰箱中預(yù)冷5 h后，在-40 ℃下冷凍干燥48 h，粉碎，過40目篩，密封保存。

2.1.2 烘干法 將凈制品在50 ℃下恒溫干燥，粉碎，過40目篩，密封保存。

2.1.3 煮后烘干法 將凈制品用沸水煮至透心，撈出瀝干水分，在50 ℃下干燥，粉碎，過40目篩，密封保存。

2.2 皂苷含量測定 稱取藥材3.000 g，75%乙醇回流提取3次，每次1 h，合并濾液，濃縮至無醇味，正丁醇萃取3次，合并萃取液，減壓蒸干，加水定容至50 mL，即得供試品溶液。吸取適量，測定皂苷含量。

參照文獻[5]報道方法，精密吸取1 mg/mL薯蕷皂苷元氯仿溶液0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 mL，置于10 mL量瓶中，加入5%香草醛冰醋酸溶液0.2 mL、高氯酸0.8 mL，70 ℃水浴振搖20 min，冷卻后用冰醋酸稀釋至刻度，搖勻，在451 nm波長處測定吸光度，得方程為A=18.046X+0.040 8(R2=0.999 0)，在0.005～0.025 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3 多糖含量測定 稱取藥材3.000 g，石油醚脫脂，殘渣揮至無醚味，加蒸餾水，在80 ℃下浸提3次，每次2 h，合并濾液，減壓濃縮至20 mL，濃縮液采用Sevage法除去蛋白，即得供試品溶液。吸取1 mL，測定多糖含量。

參照文獻[6]報道方法，精密吸取0.1 mg/mL葡萄糖對照品溶液0.2、0.4、0.5、0.7、0.8、1.0 mL，置于試管中，加水補至1 mL，加入5%苯酚溶液1.0 mL、濃硫酸5 mL，搖勻后靜止10 min，置于沸水中20 min，靜置10 min，在490 nm波長處測定吸光度，得方程為A=5.538X+0.082 2(R2=0.999 1)，在0.02～0.10 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4 氨基酸含量測定 稱取藥材3.000 g，浸入20 mL甲醇中過夜，超聲提取30 min，重復(fù)2次，合并濾液，加入5 mL 3%鹽酸酸化15 min，濾過，濾液蒸干，加水定容至25 mL，即得供試品溶液。吸取1 mL，以L-精氨酸占1.000 g樣品比例計算含量。

參照文獻[7]報道方法，精密量取0.2 mg/mLL-精氨酸對照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL，置于10 mL量瓶中，加水補至1 mL，加入磷酸鹽緩沖液、2%茚三酮乙醇溶液各0.1 mL，加水定容至刻度，置于沸水中15 min，取出，冷卻至室溫，在570 nm波長處測定吸光度，得方程為A=6.468 5X+0.021 6(R2=0.999 1)，在0.02～0.14 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 揮發(fā)油含量測定 稱取藥材10.000 g，水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，石油醚收集，揮盡溶劑，即得揮發(fā)油，測定其含量。

2.6 總黃酮含量測定 稱取藥材3.000 g，加70%乙醇回流提取3次，每次1 h，合并濾液，減壓濃縮，定容至25 mL，即得供試品溶液，在570 nm波長處測定吸光度，總黃酮含量以1.000 g藥材中所含蘆丁質(zhì)量表示，得方程為A=10.076X+0.032(R2=0.999 0)，在0.008～0.048 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.7 總生物堿含量測定 稱取藥材3.000 g，95%乙醇回流提取，回收溶劑，加1% HCl酸化，濾過，酸水液加氨水堿化至pH 9～10，等量氯仿萃取，回收溶劑，即得總生物堿，采用酸堿滴定法測定其含量?？偵飰A用適量乙醇溶解后精密加入H2SO4滴定液(0.01 mol/L)、水各15 mL，甲基紅指示劑2滴，NaOH滴定液(0.02 mol/L)滴定至黃色，測定其消耗堿液體積，結(jié)果用空白試驗校正(以腺苷為基準)。

2.8 體外抗氧化活性測定 稱取3種加工品各10.000 g，石油醚(60～90 ℃)水浴回流3次，每次1 h，得醚提取液[8]，一部分殘渣加75%乙醇回流提取3次，每次1 h，濾液蒸至無醇味，正丁醇萃取3次，合并萃取液[9]；另一部分殘渣加蒸餾水，在80 ℃下浸提3次，每次2 h，合并濾液，得水提液[10]，將3種提取液減壓濃縮、凍干，制成不同質(zhì)量濃度(1、2、4、6、8 、10 mg/mL)，以維生素C為對照品，測定其體外抗氧化活性，每個樣品平行3次。

2.9 DPPH自由基清除能力測定 吸取0.4 mmol/L DPPH乙醇溶液150 μL至96孔板中，加入“2.8”項下提取液各50 μL搖勻，室溫避光反應(yīng)30 min，在517 nm波長處測定吸光度，計算清除率[11]。

2.10 ABTS自由基清除能力測定 204 mg ABTS以水定容至50 mL，35.14 mg K2S2O8以水定容至50 mL，合并，搖勻，室溫避光反應(yīng)16 h，乙醇稀釋ABTS溶液，使其在734 nm處的吸光度為0.7。吸取“2.8”項下提取液各80 μL，加入ABTS溶液140 μL，室溫避光反應(yīng)30 min，在734 nm波長處測吸光度[12]。

2.11 羥基自由基清除能力測定 取10 mmol/L水楊酸乙醇溶液、10 mmol/L FeSO4溶液、“2.8”項下提取液各50 μL，置于96孔板中，混勻，在37 ℃下恒溫反應(yīng)30 min，加入50 μL 100 mmol/L H2O2溶液，終止反應(yīng)，在510 nm波長處測定吸光度，計算清除率[13]。

3 結(jié)果

3.1 各成分含量測定 表1顯示，烘干品中皂苷含量最高，凍干品中多糖、揮發(fā)油含量最高；煮后烘干品中皂苷、多糖、氨基酸含量低于鮮品(P<0.01)；各樣品中總黃酮、生物堿含量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 不同加工品中各成分含量

表2顯示，3種提取物中含量較高的成分分別為揮發(fā)油、皂苷、多糖，皂苷含量在烘干品中最高，其次在凍干品中；揮發(fā)油、多糖含量均在凍干品中最高，其次在烘干品中；煮后烘干品中各成分含量均最低。

表2 不同提取物中各成分含量

3.2 DPPH自由基清除活性 圖1顯示，水提物具有較強的清除DPPH自由基活性，并呈量效關(guān)系，其中凍干品清除能力最強，在10 mg/mL時清除率為67.59%，其次為烘干品，煮后烘干品最弱。

3.3 ABTS自由基清除活性 圖2顯示，醇提物、水提物清除ABTS自由基的能力較強，并呈量效關(guān)系，其中醇提物中烘干品清除ABTS自由基的能力最強，在10 mg/mL時清除率為93.06%，其次是凍干品；水提物中凍干品清除ABTS自由基的能力最強，在10 mg/mL時清除率為78.78%；2種提取物中煮后烘干品清除ABTS自由基的能力最弱。

3.4 羥基自由基清除活性 圖3顯示，醚提物對OH自由基的清除率較高，并呈劑量依賴性，其中凍干品清除能力最強，在10 mg/mL時清除率為61.63%，其次為烘干品，煮后烘干品最弱；醇提物、水提物對OH自由基的清除能力較弱，活性遠低于維生素C。

圖1 3種提取物對DPPH自由基的清除活性

圖2 3種提取物對ABTS自由基的清除活性

圖3 3種提取物對OH自由基的清除活性

3.5 IC50值 表3顯示，醇提物對ABTS自由基的清除能力較強，水提物對DPPH、ABTS自由基的清除能力較強，醚提物對OH自由基的清除能力較強，而且后2種提取物中凍干品清除能力最強，其次是烘干品，煮后烘干品最弱。

表3 3種加工品對各自由基的IC50值

4 討論

不同加工方法對薤白化學(xué)成分的含量有顯著影響，其中烘干樣品中皂苷含量最高，凍干樣品中多糖、揮發(fā)油含量較高，且揮發(fā)油含量與鮮品之間無差異。冷凍干燥對于皂苷類成分的保留沒有作用，與關(guān)峰等[14]研究一致，其原因可能與冷凍干燥的技術(shù)特點和具體工藝有關(guān)，低溫并未使組織中的酶失活，皂苷水解使得皂苷含量減少而糖含量增加。烘干法中高溫能將內(nèi)源酶滅活或有一定的抑制作用，使得藥材自身的呼吸減弱，從而減少皂苷水解[15-16]。加工過程中溫度對揮發(fā)油類成分有一定的影響，溫度過高會導(dǎo)致藥材中揮發(fā)油成分的流失或轉(zhuǎn)化[17-18]。皂苷、多糖和氨基酸均具有一定的水溶性，因此水煮后這些成分損失較嚴重。50 ℃恒溫干燥能更好地保留皂苷類成分，冷凍干燥對于多糖、揮發(fā)油類成分的保留更具優(yōu)勢，因此可根據(jù)應(yīng)用目的合理選擇最佳加工方法。

薤白不同提取物的抗氧化活性對不同類型的自由基表現(xiàn)出選擇性作用。其中醇提物的正丁醇萃取部位對ABTS自由基清除能力較強，水提物對DPPH自由基和ABTS自由基的清除能力較強，醚提物對OH自由基的清除能力較強，其差異可能與不同提取物中起到抗氧化作用的成分組成及其結(jié)構(gòu)與性質(zhì)有一定關(guān)系[19]。醚提物、醇提物和水提物的抗氧化活性大小分別與揮發(fā)油、皂苷和多糖的含量呈現(xiàn)一定的相關(guān)性。薤白皂苷[20]、多糖[10]均具有一定的抗氧化活性，有機硫化物因硫氫鍵的斷裂，或與不同的環(huán)狀結(jié)構(gòu)、烯丙基等基團結(jié)合，會產(chǎn)生多種抗氧化活性物質(zhì)[21]，具有較強的羥自由基清除能力及總還原能力[22-23]，而含硫化合物為薤白揮發(fā)油中主要化學(xué)成分。因此推測皂苷、多糖和揮發(fā)油可能是薤白起抗氧化作用的重要活性成分。