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        MicroRNA-146a通過(guò)靶向調(diào)控TGF-β/SMAD對(duì)后縱韌帶細(xì)胞成骨分化的影響

        2022-12-04 12:07:16張海濤劉偉靜于康威袁素平劉麗麗
        關(guān)鍵詞:骨化培養(yǎng)液頸椎

        張海濤,王 磊,劉偉靜,于康威,張 前,袁素平,劉麗麗

        頸椎后縱韌帶骨化癥是機(jī)體頸椎后縱韌帶出現(xiàn)異位骨化,并且對(duì)神經(jīng)產(chǎn)生壓迫從而產(chǎn)生了一系列的臨床癥狀[1]。現(xiàn)在頸椎后縱韌帶骨化癥發(fā)病機(jī)制還未得到明確[2]。近幾年研究表明,微RNA(microRNA,miRNA)在頸椎后縱韌帶骨化癥的發(fā)生過(guò)程中有著相當(dāng)重要的作用,其能夠與mRNA 3"端的非翻譯區(qū)相結(jié)合[3]。還有研究表明miRNA-146a與后縱韌帶細(xì)胞成骨分化有關(guān),但是其具體的作用機(jī)制還不明確[4]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)作為一種促纖維因子,其能夠?qū)?xì)胞的成骨化進(jìn)行促進(jìn),SMAD2(mothers against decapentaplegic homolog 2 gene)是其下游基因,其能夠?qū)g帶干細(xì)胞的遷移和轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生影響[5]。TGF-β/SMAD2信號(hào)通路能夠?qū)虻霓D(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)控,而且轉(zhuǎn)錄后的mRNA能夠?qū)GF-β/SMAD2信號(hào)通路的其他相關(guān)基因進(jìn)行調(diào)控[6]。筆者通過(guò)對(duì)miR-146a在頸椎后縱韌帶細(xì)胞成骨化過(guò)程中的功能和機(jī)制進(jìn)行研究,探討miRNA-146a表達(dá)對(duì)頸椎后縱韌帶骨化癥進(jìn)展的影響。

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)材料

        1.1.1 臨床材料

        選擇2020年5月至12月在陸軍第八十二集團(tuán)軍醫(yī)院骨外科進(jìn)行手術(shù)治療的頸椎后縱韌帶骨化癥患者8例(觀察組),其中男性5例,女性3例;年齡28~37歲,平均年齡33.83歲(標(biāo)準(zhǔn)差3.29歲)。在進(jìn)行頸椎前路減壓手術(shù)時(shí),收集患者的未骨化的后縱韌帶部分。

        在同一時(shí)期選擇接受治療的頸椎外傷患者4例(對(duì)照組),其中男性2例,女性2例;年齡27~36歲,平均年齡34.03歲(標(biāo)準(zhǔn)差4.29歲)。在手術(shù)中以相同的手法收集患者的后縱韌帶部分。

        所有患者及家屬對(duì)此項(xiàng)研究知情,并簽署知情同意書;該研究經(jīng)過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)。

        1.1.2 主要試劑與儀器

        10%胎牛血清(大連美倫生物科技有限公司,中國(guó));1%雙抗的杜爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)液(Dulbecco’s modified Eagle medium,DMEM)(Gibco,美國(guó));TRIzol(Invitrogen,美國(guó));SYBR Green(Roche,美國(guó));轉(zhuǎn)染試劑(Promega,美國(guó));RNA oligo(上海吉瑪公司,中國(guó));茜素紅染色劑(SclenCell,美國(guó));堿性磷酸酶染色試劑盒(上海斯丹賽生物技術(shù)有限公司,中國(guó))。

        1.2 方法

        1.2.1 后縱韌帶細(xì)胞的分離、培養(yǎng)

        應(yīng)用胎牛血清對(duì)收集的韌帶組織進(jìn)行清洗,將其剪碎后進(jìn)行貼壁培養(yǎng),從而獲得所需要的后縱韌帶細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)液為10 %胎牛血清和1 %雙抗的DMEM。對(duì)收集的細(xì)胞進(jìn)行再培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)選擇2~3代細(xì)胞進(jìn)行。

        1.2.2 細(xì)胞RNA的提取與實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

        采用實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)進(jìn)行檢測(cè)。應(yīng)用兩組的第3代細(xì)胞,提前1 d更換新鮮的培養(yǎng)液,確定細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好。應(yīng)用TRIzol對(duì)RNA進(jìn)行提取,應(yīng)用酶標(biāo)儀對(duì)RNA的純度和濃度進(jìn)行檢測(cè)。RNA的總量小于5μg,調(diào)節(jié)各RNA總量相同,應(yīng) 用ReverTra Ace qPCR RT Kit進(jìn)行cDNA逆轉(zhuǎn)錄合成,熒光染料為SYBR Green;應(yīng)用RT-PCR對(duì)兩組細(xì)胞中miR-146a的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè),甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)作為內(nèi)參。各樣本的目的基因的相對(duì)表達(dá)量應(yīng)用StepOneTMSoftware V2.1進(jìn)行計(jì)算。每個(gè)樣本重復(fù)3次,每組設(shè)置2副孔。

        上海杰里生物技術(shù)公司提供PCR引物。GAPDH:下游引物序列,5"-CCAGCCCCAGCGTCAAAGGTG-3",上游引物序列,5"-CGCGGGCTCCAGAACATCAT-3"。miR-146a,下游引物5"-GCTGAAGAACTGAATTTCAGAGGTC-3",上游引物,5"-CCGATGTGTATCCTCAGC-3"。TGF-β下游引物5"-CCACCTGCAAGACCATCGAC-3",上游引物,5"-CCACCTGCAAGACCATCGAC-3"。SMAD2下游引物5"-GTCGTAGCAAACCACCAAG-3",上游引物5"-GGTATGAAATGGCAAATCG-3"。

        1.2.3 抑制或者過(guò)表達(dá)miR-146a對(duì)成骨細(xì)胞表型的檢測(cè)

        選擇觀察組第2代細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)前1 d更換新鮮培養(yǎng)液以保證細(xì)胞的活力。將細(xì)胞接種在24孔板中,培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h待細(xì)胞貼壁。將細(xì)胞分為miR-146a過(guò)表達(dá)組、miR-146a抑制組和對(duì)照組。

        對(duì)照組轉(zhuǎn)染試劑和RNA oligo稀釋液,抑制組RNA oligo抑制miR-146a的功能,過(guò)表達(dá)組RNA oligo應(yīng)用于miR-146a的過(guò)表達(dá)。轉(zhuǎn)染試劑每孔加入0.5μL,RNA oligo的質(zhì)量濃度為100 nmol/L,進(jìn)行10 min室溫孵育,然后在各組樣品細(xì)胞中加入轉(zhuǎn)染混合液。進(jìn)行6 h的轉(zhuǎn)染后,培養(yǎng)液更換為骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng),每3 d換1次液;在培養(yǎng)14 d后,采用堿性磷酸酶染色試劑盒應(yīng)用于細(xì)胞染色,然后在340 nm下應(yīng)用酶標(biāo)儀進(jìn)行光密度測(cè)量。培養(yǎng)21 d后,將茜素紅染色劑用于細(xì)胞染色;在550 nm下應(yīng)用酶標(biāo)儀對(duì)光密度進(jìn)行測(cè)量,應(yīng)用RT-PCR對(duì)各組細(xì)胞的骨相關(guān)基因中TGF-β和SMAD2 mRNA的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。應(yīng)用Western blot對(duì)細(xì)胞中TGF-β和SMAD2蛋白表達(dá)進(jìn)行測(cè)量(用相對(duì)表達(dá)量表示),應(yīng)用β-actin作為內(nèi)標(biāo)。

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        所有數(shù)據(jù)分析均使用SPSS 19.0軟件。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,使用t檢驗(yàn)確認(rèn)各組數(shù)據(jù)之間的差異性,當(dāng)計(jì)數(shù)資料以百分率表示時(shí)使用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.01為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 兩組患者韌帶細(xì)胞中miR-146a表達(dá)水平比較

        對(duì)兩組韌帶細(xì)胞的miR-146a表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè),觀察組細(xì)胞miR-146a的表達(dá)量(8.83±0.62)要高于對(duì)照組(1.02±0.13),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=21.35,P<0.05)。

        2.2 miR-146a抑制和過(guò)表達(dá)對(duì)后縱韌帶細(xì)胞骨化的影響

        miR-146a抑制組茜素紅染色水平和堿性磷酸酶水平低于對(duì)照組,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);miR-146a過(guò)表達(dá)組茜素紅染色水平和堿性磷酸酶水平高于對(duì)照組,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1、圖1。

        圖1 miR-146a過(guò)表達(dá)和抑制細(xì)胞骨化茜素紅染色對(duì)比圖(×200)Fig.1 Comparison of alizarin red staining of miR-146a overexpression and inhibition of ossification in cells(×200)

        表1 miR-146a抑制和過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞骨化指標(biāo)水平影響比較Tab.1 Comparison of miR-146a inhibition and overexpression effect on cell ossification levels

        2.3 miR-146a抑制和過(guò)表達(dá)對(duì)后縱韌帶細(xì)胞TGF-β和SMAD2 mRNA表達(dá)的影響

        miR-146a抑制組TGF-β和SMAD2 mRNA表達(dá)水平低于對(duì)照組,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。miR-146a過(guò)表達(dá)組TGF-β和SMAD2 mRNA的表達(dá)高于對(duì)照組,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表2。

        表2 miR-146a抑制和過(guò)表達(dá)對(duì)后縱韌帶細(xì)胞TGF-β和SMAD2 mRNA水平影響比較Tab.2 Comparison of miR-146a inhibition and overexpression effect on TGF-βand SMAD2 mRNA levels in posterior longitudinal ligament cells

        2.4 miR-146a抑制和過(guò)表達(dá)對(duì)后縱韌帶細(xì)胞TGFβ和SMAD2蛋白表達(dá)影響比較

        miR-146a抑制組TGF-β和SMAD2蛋白表達(dá)水平低于對(duì)照組,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);miR-146a過(guò)表達(dá)組TGF-β和SMAD2蛋白表達(dá)高于對(duì)照組,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表3、圖2。

        圖2 miR-146a抑制和過(guò)表達(dá)對(duì)后縱韌帶細(xì)胞中TGF-β和SMAD2蛋白表達(dá)影響電泳圖Fig.2 Electrophoretograms of miR-146a inhibition and overexpression effect on TGF-βand SMAD2 protein expression in posterior longitudinal ligament cells

        表3 miR-146a抑制和過(guò)表達(dá)對(duì)后縱韌帶細(xì)胞中TGF-β和SMAD2蛋白表達(dá)比較Tab.3 Comparison of miR-146a inhibition and overexpression on TGF-βand SMAD2 protein expression in posterior longitudinal ligament cells

        3 討論

        頸椎后縱韌帶成骨化是臨床上較為常見的一種脊柱疾病,其具體的發(fā)病機(jī)制還有待研究[7]。一般認(rèn)為該疾病的發(fā)生是多種因素影響的結(jié)果,具體的發(fā)病因素可以分為局部因素和系統(tǒng)因素,其中局部因素主要包括椎體不穩(wěn)和椎間盤退行性變,而系統(tǒng)因素主要包括基因變異、激素功能異常、糖鈣代謝異常和飲食及年齡等[8]。

        在頸椎后縱韌帶成骨化綜合征發(fā)生的過(guò)程中,存在于后縱韌帶內(nèi)部的間質(zhì)細(xì)胞能夠與各種生長(zhǎng)因子發(fā)生反應(yīng),進(jìn)而形成鈣化,分化為類成骨細(xì)胞,隨著新生血管的產(chǎn)生其會(huì)慢慢轉(zhuǎn)化為板層骨[9]。研究顯示,通過(guò)對(duì)miRNA-146a進(jìn)行調(diào)控對(duì)于后縱細(xì)胞成骨化有一定的治療作用,但是其具體的治療機(jī)制還有待研究[10]。TGF-β能夠刺激骨化的進(jìn)程,而SMAD2是TGF-β的下游蛋白,其能對(duì)韌帶干細(xì)胞的遷移和生長(zhǎng)產(chǎn)生影響[11]。此外,頸椎后縱韌帶成骨化在鈣代謝異常、肥胖癥、甲狀腺功能衰退及非胰島素依賴型糖尿病患者中具有較高的發(fā)病率,其還受到降鈣素、前列腺素-2及甲狀旁腺素等相關(guān)激素的調(diào)控[12]。

        miRNA是基因表達(dá)調(diào)控的重要組成,其通常由20~24個(gè)核苷酸組成,在機(jī)體的免疫應(yīng)答、腫瘤發(fā)生和生長(zhǎng)發(fā)育等方面具有較為廣泛的應(yīng)用,而且其具有時(shí)空特異性[13]。miRNA發(fā)生作用常與靶基因結(jié)合位點(diǎn)的序列相關(guān),而此序列常常僅包括6~8個(gè)堿基序列,所以單個(gè)miRNA可能會(huì)對(duì)多個(gè)mRNA產(chǎn)生作用,而且一個(gè)mRNA可能會(huì)受到多個(gè)miRNA的調(diào)控,所以一些miRNA的缺失可能不會(huì)影響機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育,但是可能會(huì)引發(fā)一些疾病。miRNA特殊的作用方式,導(dǎo)致很多慢性疾病的發(fā)生均與其有關(guān)。近幾年miRNA對(duì)骨分化的影響受到大家的關(guān)注。有研究表明miR-150-3p能夠通過(guò)對(duì)β-catenin產(chǎn)生作用來(lái)對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化產(chǎn)生影響;miR-23b能夠?qū)MAD3產(chǎn)生影響進(jìn)而對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的成骨化進(jìn)行抑制[14]。

        對(duì)于頸椎后縱韌帶成骨化患者后縱韌帶細(xì)胞的培養(yǎng),大量研究表明,通過(guò)組織塊貼壁培養(yǎng)能夠獲得形態(tài)學(xué)表現(xiàn)較好的頸椎后縱韌帶細(xì)胞,而且體外培養(yǎng)此細(xì)胞發(fā)現(xiàn)其具有較好的成骨性[15]。筆者所在課題組前期研究發(fā)現(xiàn),在頸椎后縱韌帶成骨化患者的后縱韌帶組織中miR-146a的表達(dá)與頸椎外傷患者存在差異。筆者研究便通過(guò)對(duì)相應(yīng)患者的后縱韌帶細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)觀察組細(xì)胞的miR-146a的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組。筆者研究還發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)miR-146a能夠?qū)罂v韌帶細(xì)胞骨化水平進(jìn)行增強(qiáng),且會(huì)增加細(xì)胞鈣質(zhì)的沉積及堿性磷酸酶的活性,當(dāng)對(duì)miR-146a活性進(jìn)行抑制后,細(xì)胞的成骨化也相對(duì)受到了抑制。這表明miR-146a對(duì)于頸椎后縱韌帶細(xì)胞成骨化過(guò)程有著調(diào)控作用,其在頸椎后縱韌帶成骨化患者的高表達(dá)促使了后縱韌帶骨化的進(jìn)程。

        RT-PCR結(jié)果顯示,miR-146a過(guò)表達(dá)組后縱韌帶細(xì)胞的TGF-β和SMAD2 mRNA表達(dá)明顯增加,而且miR-146a抑制組TGF-β和SMAD2 mRNA表達(dá)明顯降低,這表明miR-146a是通過(guò)對(duì)TGF-β和SMAD2進(jìn)行調(diào)控,進(jìn)而促使后縱韌帶細(xì)胞成骨化。

        盡管筆者研究已經(jīng)初步對(duì)miR-146a的下游調(diào)控機(jī)制進(jìn)行明確,但是為何在頸椎后縱韌帶成骨綜合征患者中的miR-146a水平會(huì)出現(xiàn)特異性升高的原因還不明確,其具體的功能也還有待進(jìn)一步的研究。筆者研究對(duì)miR-146a進(jìn)行分析,從細(xì)胞層面揭示了miRNA在頸椎后縱韌帶細(xì)胞成骨分化的重要意義。當(dāng)然,也期望更多的研究能夠揭示miRNA在頸椎后縱韌帶細(xì)胞成骨化疾病中的作用。

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