張海濤，王 磊，劉偉靜，于康威，張 前，袁素平，劉麗麗

頸椎后縱韌帶骨化癥是機(jī)體頸椎后縱韌帶出現(xiàn)異位骨化，并且對(duì)神經(jīng)產(chǎn)生壓迫從而產(chǎn)生了一系列的臨床癥狀[1]。現(xiàn)在頸椎后縱韌帶骨化癥發(fā)病機(jī)制還未得到明確[2]。近幾年研究表明，微RNA（microRNA，miRNA）在頸椎后縱韌帶骨化癥的發(fā)生過程中有著相當(dāng)重要的作用，其能夠與mRNA 3"端的非翻譯區(qū)相結(jié)合[3]。還有研究表明miRNA-146a與后縱韌帶細(xì)胞成骨分化有關(guān)，但是其具體的作用機(jī)制還不明確[4]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）作為一種促纖維因子，其能夠?qū)?xì)胞的成骨化進(jìn)行促進(jìn)，SMAD2（mothers against decapentaplegic homolog 2 gene）是其下游基因，其能夠?qū)g帶干細(xì)胞的遷移和轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生影響[5]。TGF-β/SMAD2信號(hào)通路能夠?qū)虻霓D(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)控，而且轉(zhuǎn)錄后的mRNA能夠?qū)GF-β/SMAD2信號(hào)通路的其他相關(guān)基因進(jìn)行調(diào)控[6]。筆者通過對(duì)miR-146a在頸椎后縱韌帶細(xì)胞成骨化過程中的功能和機(jī)制進(jìn)行研究，探討miRNA-146a表達(dá)對(duì)頸椎后縱韌帶骨化癥進(jìn)展的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 臨床材料

選擇2020年5月至12月在陸軍第八十二集團(tuán)軍醫(yī)院骨外科進(jìn)行手術(shù)治療的頸椎后縱韌帶骨化癥患者8例（觀察組），其中男性5例，女性3例；年齡28～37歲，平均年齡33.83歲（標(biāo)準(zhǔn)差3.29歲）。在進(jìn)行頸椎前路減壓手術(shù)時(shí)，收集患者的未骨化的后縱韌帶部分。

在同一時(shí)期選擇接受治療的頸椎外傷患者4例（對(duì)照組），其中男性2例，女性2例；年齡27～36歲，平均年齡34.03歲（標(biāo)準(zhǔn)差4.29歲）。在手術(shù)中以相同的手法收集患者的后縱韌帶部分。

所有患者及家屬對(duì)此項(xiàng)研究知情，并簽署知情同意書；該研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過。

1.1.2 主要試劑與儀器

10%胎牛血清（大連美倫生物科技有限公司，中國(guó)）；1%雙抗的杜爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)液（Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM）（Gibco，美國(guó)）；TRIzol（Invitrogen，美國(guó)）；SYBR Green（Roche，美國(guó)）；轉(zhuǎn)染試劑（Promega，美國(guó)）；RNA oligo（上海吉瑪公司，中國(guó)）；茜素紅染色劑（SclenCell，美國(guó)）；堿性磷酸酶染色試劑盒（上海斯丹賽生物技術(shù)有限公司，中國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 后縱韌帶細(xì)胞的分離、培養(yǎng)

應(yīng)用胎牛血清對(duì)收集的韌帶組織進(jìn)行清洗，將其剪碎后進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，從而獲得所需要的后縱韌帶細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)液為10 %胎牛血清和1 %雙抗的DMEM。對(duì)收集的細(xì)胞進(jìn)行再培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)選擇2～3代細(xì)胞進(jìn)行。

1.2.2 細(xì)胞RNA的提取與實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

采用實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）進(jìn)行檢測(cè)。應(yīng)用兩組的第3代細(xì)胞，提前1 d更換新鮮的培養(yǎng)液，確定細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好。應(yīng)用TRIzol對(duì)RNA進(jìn)行提取，應(yīng)用酶標(biāo)儀對(duì)RNA的純度和濃度進(jìn)行檢測(cè)。RNA的總量小于5μg，調(diào)節(jié)各RNA總量相同，應(yīng) 用ReverTra Ace qPCR RT Kit進(jìn)行cDNA逆轉(zhuǎn)錄合成，熒光染料為SYBR Green；應(yīng)用RT-PCR對(duì)兩組細(xì)胞中miR-146a的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內(nèi)參。各樣本的目的基因的相對(duì)表達(dá)量應(yīng)用StepOneTMSoftware V2.1進(jìn)行計(jì)算。每個(gè)樣本重復(fù)3次，每組設(shè)置2副孔。

上海杰里生物技術(shù)公司提供PCR引物。GAPDH：下游引物序列，5"-CCAGCCCCAGCGTCAAAGGTG-3"，上游引物序列，5"-CGCGGGCTCCAGAACATCAT-3"。miR-146a，下游引物5"-GCTGAAGAACTGAATTTCAGAGGTC-3"，上游引物，5"-CCGATGTGTATCCTCAGC-3"。TGF-β下游引物5"-CCACCTGCAAGACCATCGAC-3"，上游引物，5"-CCACCTGCAAGACCATCGAC-3"。SMAD2下游引物5"-GTCGTAGCAAACCACCAAG-3"，上游引物5"-GGTATGAAATGGCAAATCG-3"。

1.2.3 抑制或者過表達(dá)miR-146a對(duì)成骨細(xì)胞表型的檢測(cè)

選擇觀察組第2代細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)前1 d更換新鮮培養(yǎng)液以保證細(xì)胞的活力。將細(xì)胞接種在24孔板中，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h待細(xì)胞貼壁。將細(xì)胞分為miR-146a過表達(dá)組、miR-146a抑制組和對(duì)照組。

對(duì)照組轉(zhuǎn)染試劑和RNA oligo稀釋液，抑制組RNA oligo抑制miR-146a的功能，過表達(dá)組RNA oligo應(yīng)用于miR-146a的過表達(dá)。轉(zhuǎn)染試劑每孔加入0.5μL，RNA oligo的質(zhì)量濃度為100 nmol/L，進(jìn)行10 min室溫孵育，然后在各組樣品細(xì)胞中加入轉(zhuǎn)染混合液。進(jìn)行6 h的轉(zhuǎn)染后，培養(yǎng)液更換為骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，每3 d換1次液；在培養(yǎng)14 d后，采用堿性磷酸酶染色試劑盒應(yīng)用于細(xì)胞染色，然后在340 nm下應(yīng)用酶標(biāo)儀進(jìn)行光密度測(cè)量。培養(yǎng)21 d后，將茜素紅染色劑用于細(xì)胞染色；在550 nm下應(yīng)用酶標(biāo)儀對(duì)光密度進(jìn)行測(cè)量，應(yīng)用RT-PCR對(duì)各組細(xì)胞的骨相關(guān)基因中TGF-β和SMAD2 mRNA的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。應(yīng)用Western blot對(duì)細(xì)胞中TGF-β和SMAD2蛋白表達(dá)進(jìn)行測(cè)量（用相對(duì)表達(dá)量表示），應(yīng)用β-actin作為內(nèi)標(biāo)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)分析均使用SPSS 19.0軟件。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用t檢驗(yàn)確認(rèn)各組數(shù)據(jù)之間的差異性，當(dāng)計(jì)數(shù)資料以百分率表示時(shí)使用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者韌帶細(xì)胞中miR-146a表達(dá)水平比較

對(duì)兩組韌帶細(xì)胞的miR-146a表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，觀察組細(xì)胞miR-146a的表達(dá)量（8.83±0.62）要高于對(duì)照組（1.02±0.13），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=21.35，P<0.05）。

2.2 miR-146a抑制和過表達(dá)對(duì)后縱韌帶細(xì)胞骨化的影響

miR-146a抑制組茜素紅染色水平和堿性磷酸酶水平低于對(duì)照組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；miR-146a過表達(dá)組茜素紅染色水平和堿性磷酸酶水平高于對(duì)照組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見表1、圖1。

圖1 miR-146a過表達(dá)和抑制細(xì)胞骨化茜素紅染色對(duì)比圖（×200）Fig.1 Comparison of alizarin red staining of miR-146a overexpression and inhibition of ossification in cells(×200)

表1 miR-146a抑制和過表達(dá)對(duì)細(xì)胞骨化指標(biāo)水平影響比較Tab.1 Comparison of miR-146a inhibition and overexpression effect on cell ossification levels

2.3 miR-146a抑制和過表達(dá)對(duì)后縱韌帶細(xì)胞TGF-β和SMAD2 mRNA表達(dá)的影響

miR-146a抑制組TGF-β和SMAD2 mRNA表達(dá)水平低于對(duì)照組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。miR-146a過表達(dá)組TGF-β和SMAD2 mRNA的表達(dá)高于對(duì)照組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見表2。

表2 miR-146a抑制和過表達(dá)對(duì)后縱韌帶細(xì)胞TGF-β和SMAD2 mRNA水平影響比較Tab.2 Comparison of miR-146a inhibition and overexpression effect on TGF-βand SMAD2 mRNA levels in posterior longitudinal ligament cells

2.4 miR-146a抑制和過表達(dá)對(duì)后縱韌帶細(xì)胞TGFβ和SMAD2蛋白表達(dá)影響比較

miR-146a抑制組TGF-β和SMAD2蛋白表達(dá)水平低于對(duì)照組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；miR-146a過表達(dá)組TGF-β和SMAD2蛋白表達(dá)高于對(duì)照組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見表3、圖2。

圖2 miR-146a抑制和過表達(dá)對(duì)后縱韌帶細(xì)胞中TGF-β和SMAD2蛋白表達(dá)影響電泳圖Fig.2 Electrophoretograms of miR-146a inhibition and overexpression effect on TGF-βand SMAD2 protein expression in posterior longitudinal ligament cells

表3 miR-146a抑制和過表達(dá)對(duì)后縱韌帶細(xì)胞中TGF-β和SMAD2蛋白表達(dá)比較Tab.3 Comparison of miR-146a inhibition and overexpression on TGF-βand SMAD2 protein expression in posterior longitudinal ligament cells

3 討論

頸椎后縱韌帶成骨化是臨床上較為常見的一種脊柱疾病，其具體的發(fā)病機(jī)制還有待研究[7]。一般認(rèn)為該疾病的發(fā)生是多種因素影響的結(jié)果，具體的發(fā)病因素可以分為局部因素和系統(tǒng)因素，其中局部因素主要包括椎體不穩(wěn)和椎間盤退行性變，而系統(tǒng)因素主要包括基因變異、激素功能異常、糖鈣代謝異常和飲食及年齡等[8]。

在頸椎后縱韌帶成骨化綜合征發(fā)生的過程中，存在于后縱韌帶內(nèi)部的間質(zhì)細(xì)胞能夠與各種生長(zhǎng)因子發(fā)生反應(yīng)，進(jìn)而形成鈣化，分化為類成骨細(xì)胞，隨著新生血管的產(chǎn)生其會(huì)慢慢轉(zhuǎn)化為板層骨[9]。研究顯示，通過對(duì)miRNA-146a進(jìn)行調(diào)控對(duì)于后縱細(xì)胞成骨化有一定的治療作用，但是其具體的治療機(jī)制還有待研究[10]。TGF-β能夠刺激骨化的進(jìn)程，而SMAD2是TGF-β的下游蛋白，其能對(duì)韌帶干細(xì)胞的遷移和生長(zhǎng)產(chǎn)生影響[11]。此外，頸椎后縱韌帶成骨化在鈣代謝異常、肥胖癥、甲狀腺功能衰退及非胰島素依賴型糖尿病患者中具有較高的發(fā)病率，其還受到降鈣素、前列腺素-2及甲狀旁腺素等相關(guān)激素的調(diào)控[12]。

miRNA是基因表達(dá)調(diào)控的重要組成，其通常由20～24個(gè)核苷酸組成，在機(jī)體的免疫應(yīng)答、腫瘤發(fā)生和生長(zhǎng)發(fā)育等方面具有較為廣泛的應(yīng)用，而且其具有時(shí)空特異性[13]。miRNA發(fā)生作用常與靶基因結(jié)合位點(diǎn)的序列相關(guān)，而此序列常常僅包括6～8個(gè)堿基序列，所以單個(gè)miRNA可能會(huì)對(duì)多個(gè)mRNA產(chǎn)生作用，而且一個(gè)mRNA可能會(huì)受到多個(gè)miRNA的調(diào)控，所以一些miRNA的缺失可能不會(huì)影響機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育，但是可能會(huì)引發(fā)一些疾病。miRNA特殊的作用方式，導(dǎo)致很多慢性疾病的發(fā)生均與其有關(guān)。近幾年miRNA對(duì)骨分化的影響受到大家的關(guān)注。有研究表明miR-150-3p能夠通過對(duì)β-catenin產(chǎn)生作用來對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化產(chǎn)生影響；miR-23b能夠?qū)MAD3產(chǎn)生影響進(jìn)而對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的成骨化進(jìn)行抑制[14]。

對(duì)于頸椎后縱韌帶成骨化患者后縱韌帶細(xì)胞的培養(yǎng)，大量研究表明，通過組織塊貼壁培養(yǎng)能夠獲得形態(tài)學(xué)表現(xiàn)較好的頸椎后縱韌帶細(xì)胞，而且體外培養(yǎng)此細(xì)胞發(fā)現(xiàn)其具有較好的成骨性[15]。筆者所在課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在頸椎后縱韌帶成骨化患者的后縱韌帶組織中miR-146a的表達(dá)與頸椎外傷患者存在差異。筆者研究便通過對(duì)相應(yīng)患者的后縱韌帶細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)觀察組細(xì)胞的miR-146a的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組。筆者研究還發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-146a能夠?qū)罂v韌帶細(xì)胞骨化水平進(jìn)行增強(qiáng)，且會(huì)增加細(xì)胞鈣質(zhì)的沉積及堿性磷酸酶的活性，當(dāng)對(duì)miR-146a活性進(jìn)行抑制后，細(xì)胞的成骨化也相對(duì)受到了抑制。這表明miR-146a對(duì)于頸椎后縱韌帶細(xì)胞成骨化過程有著調(diào)控作用，其在頸椎后縱韌帶成骨化患者的高表達(dá)促使了后縱韌帶骨化的進(jìn)程。

RT-PCR結(jié)果顯示，miR-146a過表達(dá)組后縱韌帶細(xì)胞的TGF-β和SMAD2 mRNA表達(dá)明顯增加，而且miR-146a抑制組TGF-β和SMAD2 mRNA表達(dá)明顯降低，這表明miR-146a是通過對(duì)TGF-β和SMAD2進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)而促使后縱韌帶細(xì)胞成骨化。

盡管筆者研究已經(jīng)初步對(duì)miR-146a的下游調(diào)控機(jī)制進(jìn)行明確，但是為何在頸椎后縱韌帶成骨綜合征患者中的miR-146a水平會(huì)出現(xiàn)特異性升高的原因還不明確，其具體的功能也還有待進(jìn)一步的研究。筆者研究對(duì)miR-146a進(jìn)行分析，從細(xì)胞層面揭示了miRNA在頸椎后縱韌帶細(xì)胞成骨分化的重要意義。當(dāng)然，也期望更多的研究能夠揭示miRNA在頸椎后縱韌帶細(xì)胞成骨化疾病中的作用。