張 毅，姚士軍，劉朝旭

骨肉瘤（osteosarcoma，OS）是一種在青少年中常見的惡性骨腫瘤，是導致青少年腫瘤死亡及截肢率的主要疾病之一[1]。近年來隨著臨床治療的方法不斷獲得更新、優(yōu)化、改進，OS患者的預后有了明顯的改善并同時提高了其生存質量。但對于存在同時或異時性遠處轉移的OS患者其5年生存率極差[2~4]。而目前OS發(fā)生轉移的潛在分子機制仍尚不明確，同時其發(fā)生、發(fā)展及轉移的相關標志物也未獲得較好的驗證。因此，尋找OS新型有效的分子標志物及基于該標志物構建治療的新靶點，將對判斷OS預后和治療提供一種全新的策略。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

利用UCSC Xena（https://xena.ucsc.edu/）網(wǎng)站下載癌癥基因組圖譜-產(chǎn)生有效治療方法研究項目（The Cancer Genome Atlas，Therapeutically Applicable Research To Generate Effective Treatments，TCGA-TARGET）OS患者轉錄組基因表達數(shù)據(jù)譜和臨床相關信息（檢索起止：建庫至2021年5月31日）。剔除數(shù)據(jù)庫中生存情況及病理分期不明患者，最終納入84例OS患者，其中男性37例，女性47例；平均年齡14.99歲（標準差7.80歲）。原發(fā)腫瘤位置：腳/足76例；手/手臂6例；骨盆2例。初始診斷即存在遠處轉移患者21例。從ONCOMINE數(shù)據(jù)庫（https://www.oncomine.org）選出4個數(shù)據(jù)集，用于外部驗證。

1.2 方法

1.2.1 基于加權共表達基因網(wǎng)絡篩選核心模塊

加權共表達基因網(wǎng)絡（weighted gene co-expression network analysis，WGCNA）是一種對數(shù)據(jù)集中每個樣本的全部數(shù)據(jù)，包括基因表達數(shù)據(jù)、臨床信息數(shù)據(jù)等，進行整合分析的一種生物信息學分析方法。其主要是通過將每個樣本的數(shù)據(jù)進行均值歸一化后構建無序網(wǎng)絡并進行關聯(lián)分析，同時當其應用于臨床樣本的測序數(shù)據(jù)中，可以將臨床信息與基因表達進行關聯(lián)，目前已被廣泛應用于生物體內(nèi)識別和篩選復雜疾病的標志物[5]。簡單的概述該方法：首先利用R軟件（4.0.1版本）中的“WGCNA”分析包構建該模型[6，7]；構建模型中的相關矩陣，計算所有基因的鄰接關系，確定軟閾值大??；基于軟閾值的大小，對基因之間的無序鄰接關系進行截斷，并最終將其轉化為拓撲重疊矩陣（topological overlap matrix，TOM），用以度量基因之間的網(wǎng)絡連通性[8，9]。并基于TOM的差異程度進行層次聚類，從而將基因表達差異程度相似的基因納入同一個基因模塊（module eigengenes，ME）中[6，7]。

1.2.2 特征模塊和核心基因篩選

為明確實驗研究所構建的WGCNA模型哪個模塊為對整體樣本貢獻度最大，通過Pearson相關分析計算每個模塊與每個樣本之間的關聯(lián)系數(shù)，并通過取絕對值后累加獲得關聯(lián)系數(shù)最大模塊，深藍（midnight blue）模塊。利用STRING網(wǎng)站（https://string-db.org/）對深藍模塊中所有基因進行蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）分析，并利用Cytoscape軟件中的復雜分子關聯(lián)分析（molecular complex detection，MCODE）插件進一步分析。同時利用最小絕對收縮和選擇算子（least absolute shrinkage and selection operator，LASSO）回歸分析篩選深藍模塊中核心基因?；谏鲜?種方法最終獲得了3個基因核糖體RNA加工8基因（ribosomal RNA processing 8 gene，RRP8）、核糖體RNA加工9基因（ribosomal RNA processing 9 gene，RRP9）、線粒體核糖體蛋白48基因（mitochondrial ribosomal protein L48 gene，MRPL48），用以后續(xù)驗證。

1.2.3 GO功能學、KEGG通路分析和GSEA分析

為了解深藍模塊涉及的功能學和通路，對深藍模塊中所有基因進行基因本體論（gene ontology，GO）和京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）分析，用以篩選與其相關的功能和通路。為了解核心基因在OS患者中的潛在功能，利用TCGA-TARGET OS患者數(shù)據(jù)集進行基因組富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）。將P<0.05和富集評分（enrichment score，ES）>0.3作為截止標準。

1.3 統(tǒng)計學方法

t檢驗用來分析兩組樣本之間是否存在差異。利用X-tile軟件，基于最小P值和最大Log-rankχ2值進行分析計算基因的最佳取值點[10]。受試者工作特性（receiver operator characteristic，ROC）曲線被用于評估核心靶基因表達高低預測OS轉移能力。利用卡普蘭-邁耶曲線（Kaplan-Meier，K-M）分析基因高低表達對OS患者預后的影響。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 構建共表達模塊

基于WGCNA方法，對TCGA-TARGET數(shù)據(jù)集中所包含的轉錄組基因基于其每個基因的相對表達量進行模塊富集分析（圖1）。最終共獲得了67個相應的ME（圖2），依據(jù)各模塊在各個樣本上皮爾森系數(shù)絕對值相加為最高者認定為響應系數(shù)最高模塊，最后篩選獲取了深藍模塊，深藍模塊共含有214個基因。

圖1 84例OS患者的轉錄基因WGCNA模式圖Fig.1 Transcriptional WGCNA pattern of 84 OS patients

圖2 67個ME相關分析圖Fig.2 Correlation analysis diagram of 67 ME

2.2 深藍模塊相關功能分析及核心分子的篩選

依據(jù)深藍模塊中相關基因篩選表達響應基因參與的信號通路關聯(lián)（圖3A、B）。研究結果提示，主要與凋亡進程、mRNA修飾、胰島素釋放等相關。利用PPI分析和MOCDE插件篩選位于調(diào)控核心位置的基因（圖4），并進一步采用了LASSO分析（圖5），篩選出12個與預后相關的靶基因：蛋白酶體20S亞基7基因（proteasome 20S subunit alpha 7 gene，PSMA7）、RRP9、1型路障動力輕鏈蛋白基因（dynein light chain roadblock-type 1 gene，DYNLRB1）、自噬相關4D半胱氨酸肽酶基因 （autophagy related 4D cysteine peptidase gene，ATG4D）、RRP8、蘑 菇 家 族 成 員2基 因（shroom family member 2 gene，SHROOM2）、序列相似家族86個成員C1基因（family with sequence similarity 86 member C1 gene，F(xiàn)AM86C1）、RAS致癌基因家族成員24基因（member RAS oncogene family 24 gene，RAB24）、雌激素相關受體α基因（estrogen related receptor alpha gene，ESRRA）、MRPL48、假尿苷合酶1基因（pseudouridine synthase 1 gene，PUS1）和脂肪非典型鈣黏蛋白4基因 （FAT atypical cadherin 4 gene，F(xiàn)AT4）。將上述3種方法所篩選結果綜合分析，獲得RRP9、RRP8和MRPL48。

圖3 深藍模塊GO分析（A）和KEGG分析（B）Fig.3 GO analysis(A)and KEGG(B)analysis of midnight blue module

圖4 深藍模塊中相關基因PPI分析Fig.4 PPI analysis of related genes in midnight blue module

圖5 深藍模塊中相關基因LASSO篩選分析圖Fig.5 LASSO screening analysis diagram of related genes in midnight blue module

2.3 RRP8、RRP9和MRPL48驗證預后及轉移相關表達

為驗證RRP8、RRP9和MRPL48預測患者預后，應用X-tile軟件選取RRP8、RRP9和MRPL48最佳截點。以RRP8表達量為1.55、RRP9表達量為3.63和MRPL48表達量為2.29為截點將獲得最佳結果，高表達RRP8和RRP9的患者有較好的無病生存期（P=0.085、0.002；圖6A、B）；低表達MRPL48的患者有較好的無病生存期（P<0.001；圖6C）。高表達RRP8和RRP9的患者有較好的總生存期（P=0.071、0.017；圖6D、E）；低表達MRPL48的患者有較好的總生存期（P=0.001；圖6F）。

圖6 RRP8、RRP9和MRPL48在TCGA-TARGET數(shù)據(jù)集中OS患者K-M曲線分析Fig.6 K-M analysis curves of RRP8,RRP9 and MRPL48 of OS patient in TCGA-TARGET datasets

實驗利用ONCOMINE數(shù)據(jù)庫對RRP8、RRP9和MRPL48基因進行Meta分析（圖7）。在納入的4個數(shù)據(jù)集中，RRP8和RRP9在癌組織中表達較癌旁組織低（P=0.060和P=0.172）；MRPL48在癌組織中較癌旁組織高表達（P=0.035）。進一步分析RRP8、RRP9和MRPL48在轉移病人中表達情況（圖8），結果提示在轉移組中RRP8、RRP9和MRPL48均呈現(xiàn)高表達（RRP8：轉移組1.66±0.33vs非轉移組1.62±0.26；P=0.512。RRP9：轉移組3.88±0.99vs非轉移組3.84±0.52；P=0.811。MRPL48：轉移組2.56±0.52vs非轉移組2.31±0.43；P=0.029）。

圖7 RRP8、RRP9和MRPL48在ONCOMINE數(shù)據(jù)集中OS患者癌組織和癌旁組織中表達Fig.7 Expression analysis of RRP8,RRP9 and MRPL48 betweeen cancer tissues and adjuvant cancer tissues in OS patients of ONCOMINE datasets

圖8 RRP8、RRP9和MRPL48在OS轉移和非轉移患者中表達比較柱狀圖Fig.8 Comparison of expression analysis of RRP8,RRP9 and MRPL48 between metastasis and non-metastasis OS patient

為進一步了解實驗所篩選的3個基因對于預測OS轉移能力，進一步利用ROC曲線分析（圖9）。結果提示，RRP8、RRP9和MRPL48三者對于預測OS轉移其曲線下面積（area under curve，AUC）分別為：RRP8AUC=0.504，P=0.955；RRP9AUC=0.509，P=0.913；MRPL48AUC=0.663，P=0.025。上述結果進一步提示了MRPL48可以較好地預測OS患者是否發(fā)生轉移。

圖9 ROC曲線檢測RRP8、RRP9和MRPL48預測OS轉移能力Fig.9 Curves of RRP8,RRP9 and MRPL48 predicted metastasis in OS patients by ROC

2.4 GSEA功能學分析

如前述，在實驗篩選所獲得的基因中，MRPL48在預測OS患者預后和轉移均表達了較強的作用。為了解MRPL48涉及的功能調(diào)控，利用TCGA-TARGET數(shù)據(jù)庫并采用GSEA分析其所涉及的下游通路。MRPL48主要涉及了細胞黏附機制和堿基切除等（圖10）。

圖10 MRPL48在預測OS患者預后和轉移的GSEAFig.10 GSEA diagrams of MRPL48 predicted prognosis and Metastasis in OS patients

3 討論

盡管目前手術、化學治療和放射治療等多種治療方案已被證實對OS有較好的療效且已廣泛應用于OS的治療當中，但由于部分患者出現(xiàn)同時性或異時性遠處轉移，其5年生存率極低。因此，如何更為精準地識別初診患者是否具有高危轉移風險是臨床中亟待解決的問題。筆者利用TCGA-TARGET數(shù)據(jù)庫中84例OS患者的轉錄組測序數(shù)據(jù)和對應的臨床樣本的臨床數(shù)據(jù)，利用基于無序網(wǎng)絡的WGCNA算法并結合LASSO、PPI分析、MOCDE分析篩選獲得了MRPL48，并通過內(nèi)部驗證MRPL48能夠較好地預測OS患者的預后及轉移情況。同時筆者利用了外部的ONCOMINE數(shù)據(jù)庫驗證了MRPL48在OS癌組織和癌旁組織中的表達。結果提示MRPL48在OS的患者中可能扮演癌基因的角色。

近年來，隨著基因芯片、測序等多種高通量檢測手段的高速發(fā)展給人們探索不同疾病的發(fā)病機制、分子標志物等做出了巨大的貢獻?；诓粩喟l(fā)展的高通量檢測手段，目前在多種腫瘤中，已發(fā)現(xiàn)了較多應用前景較為廣闊的分子標志物；同時基于對疾病的發(fā)病機制探索，也有針對個體突變分子的成熟靶向藥物上市，并獲得了較好的臨床結果。因此基于高通量檢測手段將對人們探索OS患者有效分子標志物及其潛在治療靶點產(chǎn)生重要的影響。同時近年來隨著針對基因表達情況的算法不斷改進及優(yōu)化，進一步促進人們更好地探索疾病的機制及分子標志物。筆者研究基于公共數(shù)據(jù)庫中所含有的OS基因芯片數(shù)據(jù)并結合其所對應的臨床數(shù)據(jù)，利用了目前被廣泛使用的WGCNA算法[11，12]，該算法通過系統(tǒng)的繪制個體生物網(wǎng)絡互作圖[7，9]，可以有效地避免傳統(tǒng)篩選方法：差異基因篩選算法所導致的遺漏調(diào)控過程中的核心分子。同時該算法有效地將患者臨床資料和基因表達數(shù)據(jù)進行了有機的關聯(lián)和結合，使得人們的研究有效地從基礎研究進入了臨床前應用中[13，14]。筆者研究利用WGCNA算法對TCGA-TARGET數(shù)據(jù)庫中OS患者轉錄組數(shù)據(jù)深入分析，篩選獲得3個核心基因：RRP8，RRP9，MRPL48。進一步通過生存分析驗證筆者所篩選的核心基因是否能準確地預測OS患者的預后情況，結果提示：RRP9和MRPL48能較好地預測OS患者的無病生存和總生存率，但RRP8不能獲得較好的結果。對于OS患者，當發(fā)生了遠處轉移后，其預后極差。因此，筆者進一步分析上述3個基因在OS轉移和非轉移患者中的表達情況，其中只有MRPL48在轉移患者和非轉移患者中呈現(xiàn)表達差異。同時在預測患者是否發(fā)生轉移時，MRPL48基因表現(xiàn)出較好的結果。而RRP8和RRP9均未表現(xiàn)出較好的預測能力。同時，筆者在外部的ONCOMINE數(shù)據(jù)庫中檢測RRP8、RRP9和MRPL48三者在OS癌組織和癌旁組織中表達情況，結果提示在OS患者中，MRPL48在癌組織的表達量高于癌旁組織。上述結果均進一步證明了MRPL48可以作為預測OS預后和轉移的有效分子標志物。

MRPL48屬于線粒體核糖體蛋白家族，目前針對MRPL48在腫瘤中所發(fā)揮作用的報道較少。Hu TT等[15]報道顯示，通過CRISPR-Cas9技術敲減MRPL48可以顯著增加結直腸癌細胞對西妥昔單抗的敏感性。Fernandez-Ranvier GG等[16]報 道 顯 示，MRPL48可 以做為腎上腺皮質癌的抑癌基因。如上述，筆者發(fā)現(xiàn)MRPL48在腫瘤研究中存在著分歧，在部分腫瘤中其發(fā)揮了癌基因的作用，在部分腫瘤中發(fā)揮了抑癌基因的作用。因此進一步在不同腫瘤中探索其所產(chǎn)生的作用將對研究其在腫瘤中發(fā)揮不同作用的機制產(chǎn)生較大的幫助。筆者研究結果發(fā)現(xiàn)，MRPL48在OS患者中，高表達MRPL48與更差的預后相關，同時在癌組織中MRPL48高表達，上述結果提示MRPL48在OS中扮演癌基因的角色，并涉及OS患者預后及轉移。同時筆者研究進一步通過GSEA分析探索了MRPL48可能涉及的下游功能，結果提示MRPL48可能通過調(diào)控細胞黏附調(diào)控了OS的發(fā)生、發(fā)展及轉移。

總之，筆者研究通過TCGA-TARGET數(shù)據(jù)庫中OS轉錄組數(shù)據(jù)及其相對應的臨床資料，利用WGCNA算 法 和LASSO、PPI、MOCDE方 法 篩 選 并 驗 證MRPL48高表達與OS患者較差預后相關。MRPL48在OS患者中的癌組織較癌旁組織中表達高，其在轉移患者中較非轉移患者表達也更高。MRPL48有可能成為OS新的預后和轉移指標，有助于OS患者個性化治療及臨床預后判斷。