喬朝輝，陳亮

武漢大學生命科學學院，武漢430072

生物體的發(fā)育過程中，組織特異性基因在不同細胞中表達以建立不同類型的組織與器官，這一過程需要細胞對基因表達進行精確調(diào)控?；蜣D(zhuǎn)錄是基因表達的第一步，也是細胞分化和響應環(huán)境信號的關鍵調(diào)控步驟。真核生物RNA聚合酶Ⅱ（RNA polymerase，RNAPⅡ）從結(jié)合至基因轉(zhuǎn)錄起始位點（transcriptional start site，TSS）到轉(zhuǎn)錄結(jié)束經(jīng)歷了轉(zhuǎn)錄起始、轉(zhuǎn)錄起始位點下游近端區(qū)域的暫停/釋放、在基因體的連續(xù)前進與轉(zhuǎn)錄、離開轉(zhuǎn)錄終止位點后在下游結(jié)束轉(zhuǎn)錄并脫離基因組DNA等過程［1-3］。這些不同的轉(zhuǎn)錄過程涉及不同的調(diào)控機制，從而實現(xiàn)對轉(zhuǎn)錄的精確調(diào)控。真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究主要集中在預轉(zhuǎn)錄起始復合物（preinitiation complex，PIC）的形成和RNAPⅡ在啟動子近端暫停/釋放階段。如果暫停的RNAPⅡ成功進入到轉(zhuǎn)錄延伸階段，即有可能產(chǎn)生有功能的全長mRNA。因此深入了解RNAPⅡ啟動子近端暫停/釋放的調(diào)控過程至關重要。本文總結(jié)了RNAPⅡ啟動子近端暫停/釋放的具體分子調(diào)控過程，重點綜述了RNAPⅡ啟動子近端暫停/釋放對生物體的發(fā)育調(diào)控及其與其他基因表達調(diào)控機制的偶聯(lián)，并對RNAPⅡ啟動子近端暫停/釋放的研究進行了展望，以期為基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控提供新的研究方向。

1 RNAPⅡ啟動子近端暫停/釋放的調(diào)控機制

轉(zhuǎn)錄起始后，RNAPⅡ在轉(zhuǎn)錄起始點和通用轉(zhuǎn)錄因子TFⅡA［RNAPⅡ的轉(zhuǎn)錄因子（transcription factor for RNAPⅡ），單獨的因子以A、B等加以區(qū)分］、TFⅡB、TFⅡD、TFⅡE、TFⅡF、TFⅡH及轉(zhuǎn)錄中介體復合物等共同組裝成PIC啟動轉(zhuǎn)錄，在新生RNA長度達到9～10個核苷酸后，RNAPⅡ的C末端結(jié)構(gòu)域（C-terminal domain，CTD）Ser5位點發(fā)生磷酸化修飾，RNAPⅡ進入啟動子下游，并在轉(zhuǎn)錄20～60個核苷酸后暫停［4］。RNAPⅡ這種暫停狀態(tài)的維持和釋放受到多種RNA聚合酶輔助因子和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控［2］。

1.1 RNAPⅡ啟動子近端暫停的維持

RNAPⅡ啟動子近端暫停發(fā)生在TSS下游，受RNAPⅡ活性位點內(nèi)的DNA和RNA序列的影響，并主要通過負延伸因子（negative elongation factor，NELF）、DRB敏感性誘導因子（DRB sensitivity inducing factor，DSIF）共同作用來維持［5］。DSIF由SPT4和SPT5兩個亞基組成。NELF由4個亞基（NELF-A、NELF-B、NELF-C或NELF-D）和NELFE）組成。在PIC進入TSS下游的暫停區(qū)域后，DSIF首先結(jié)合到PIC上并替代TFⅡB、TFⅡE、TFⅡF和轉(zhuǎn)錄中介體復合物，并進一步募集NELF。結(jié)構(gòu)生物學研究表明，結(jié)合在RNAPⅡ上的NELF亞基NELF-A、NELF-E能夠與SPT5直接發(fā)生接觸并使RNAPⅡ中的核酸處于部分易位的狀態(tài)，阻止新的核苷酸結(jié)合［6］。另外，降解NELF并不能釋放RNAPⅡ，而是導致其在下游繼續(xù)暫停并可能提前終止，說明NELF對RNAPⅡ在正確位置暫停的維持發(fā)揮重要作用［7］。NELF和DSIF與RNAPⅡ的結(jié)合穩(wěn)定了暫停的RNAPⅡ構(gòu)象，抑制了TFⅡS和RNAPⅡ相關因子1復合物（RNAPⅡassociated factor complex，PAF1C）的結(jié)合，從而阻止了轉(zhuǎn)錄延伸復合物的組裝。但是NELF和DSIF與RNAPⅡ結(jié)合導致啟動子近端暫停的具體機制尚不完全清楚。

越來越多的蛋白被發(fā)現(xiàn)在維持RNAPⅡ啟動子近端暫停中發(fā)揮作用，如Gdown1蛋白通過結(jié)合RNAPⅡ阻斷其與TFⅡF的結(jié)合，從而穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄暫停［8］。GAGA因子是序列特異性的DNA結(jié)合因子，能夠?qū)ELF募集至啟動子附近促進NELF和RNAPⅡ結(jié)合［9］。PAF1C參與啟動子近端暫停，但其作用存在爭議。有報道認為，PAF1C通過抑制超級延伸復合物（super elongation complex，SEC）與基因的互作來加強暫停［10］。但也有研究表明，PAF1C可通過將P-TEFb引入暫停延伸復合物來刺激暫停釋放［11］。TFⅡD也是建立RNAPⅡ啟動子近端暫停所必需的，其TAF1和TAF2亞基的耗竭導致RNAPⅡ啟動子近端的釋放和轉(zhuǎn)錄重新啟動。另外RNAPⅡ與PIC，特別是TFⅡD的相互作用可以導致其暫停，這說明NELF和DSIF并非RNAPⅡ啟動子近端暫停所必需的［12］。

1.2 RNAPⅡ從啟動子近端暫停中釋放的調(diào)控

處于轉(zhuǎn)錄暫停階段的RNAPⅡ在進入基因體之前會發(fā)生一系列分子事件，完成轉(zhuǎn)錄起始復合物到轉(zhuǎn)錄延伸復合物的轉(zhuǎn)變。參與RNAPⅡ釋放的蛋白主要包括正轉(zhuǎn)錄延伸因子b（positive transcription elongation factor b，P-TEFb）、CDK8-中介體、溴結(jié)構(gòu)域蛋白4（bromodomain-containing protein 4，BRD4）等。在哺乳動物細胞中，P-TEFb是由催化亞基細胞周期依賴性激酶9（cyclin dependent kinase 9，CDK9）和調(diào)節(jié)亞基細胞周期蛋白T1/2（cyclin T1/2）組成的異源二聚體，主要與7SK核內(nèi)小核糖核蛋白（7SK small nuclear ribonucleoprotein，7SK snRNP）轉(zhuǎn)錄抑制復合物在啟動子近端區(qū)域和增強子處結(jié)合，從而處于非活性狀態(tài)［13］。目前研究已表明存在多種機制促進P-TEFb的釋放及激活，如在應激情況下，蛋白磷酸酶PP2B和PP1α信號通路激活，P-TEFb從7SK snRNP中釋放。激活的PP1α信號通路與Ⅰ類組蛋白脫乙酰酶HDAC1/2/3（class I histone deacetylase 1/2/3，）共同作用，實現(xiàn)H3S10ph的去磷酸化，釋放染色質(zhì)結(jié)合的BRD4、BRD4和SEC實現(xiàn)PTEFb從7SK snRNP中的解離和激活，促進RNAPⅡ的釋放［14］。研究表明SR-剪接因子SRSF2和DEAD-box RNA解旋酶DDX21等涉及這個過程［15-16］，BRD4也 能 獨 立 于P-TEFb促 進 轉(zhuǎn) 錄 延伸［17］。活性狀態(tài)的P-TEFb能夠?qū)崿F(xiàn)對RNAPⅡ的CTD結(jié)構(gòu)域Ser2與NELF及DSIF的磷酸化，促進RNAPⅡ釋放并進入轉(zhuǎn)錄延伸。磷酸化后的NELF解離并允許NTPs加入RNAPⅡ，而DSIF被磷酸化后則對轉(zhuǎn)錄延伸起促進作用。另外RNAPⅡ的CTD結(jié)構(gòu)域Ser2的磷酸化能夠募集其他延伸因子組裝SEC［18］。

RNAPⅡ從啟動子近端釋放還有其他多種蛋白的參與。TFⅡS幫助啟動子近端RNAPⅡ釋放并使其處于快速響應狀態(tài)［19］。TFⅡD也能將P-TEFb募集至SEC，使RNAPⅡ進入延伸狀態(tài)［20］。這與TFⅡD維持RNAPⅡ暫停的結(jié)論相反，但其具體機制有待進一步解析。轉(zhuǎn)錄因子MYC也被證明可促進RNAPⅡ在啟動子近端的釋放［21］。抑制CDK8-中介體增加RNAPⅡ暫停，提示其在啟動子近端暫停的調(diào)控中發(fā)揮作用［22］。研究表明中介體通過與BRD4互作招募P-TEFb［23］。TRIM28之前被認為可穩(wěn)定RNAPⅡ在蛋白質(zhì)編碼基因中的停頓，近年來的研究則發(fā)現(xiàn)其有雙向特性：在非誘導狀態(tài)下抑制轉(zhuǎn)錄，而在轉(zhuǎn)錄激活中起正調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄延伸的作用［24-25］。免疫共沉淀實驗證明，NF-κB、CⅡTA和AIRE等轉(zhuǎn)錄因子能夠直接與P-TEFb發(fā)生互作，并被認為在P-TEFb募集中發(fā)揮作用［26-28］。啟動子近端暫停和眾多調(diào)控蛋白之間的互作正逐漸被了解，但這些因子在RNAPⅡ-DSIF-NELF復合物中的具體功能仍有待更深入的研究。

2 RNAPⅡ啟動子近端暫停/釋放在機體發(fā)育中的作用

RNAPⅡ啟動子近端暫停/釋放在物種間較為保守，細胞與動物模型研究特別是早期以果蠅模型為代表的發(fā)育研究在RNAPⅡ暫停的現(xiàn)象與功能解析方面做出了重要貢獻。RNAPⅡ在啟動子下游暫停的現(xiàn)象最初在果蠅HSP70基因中發(fā)現(xiàn)，如TFⅡS、NELF和DSIF等多個蛋白在RNAPⅡ啟動子近端暫停中的作用在果蠅中得到證實［29］。果蠅胚胎ChIP-chip分析結(jié)果表明，有至少12%的基因在轉(zhuǎn)錄起始點附近出現(xiàn)了RNAPⅡ積累，而在發(fā)育不同階段RNAPⅡ的累積/暫?？赡茉诓煌虻腡SS處呈現(xiàn)動 態(tài) 變化［30］。ChIP-seq數(shù)據(jù)顯示，RNAPⅡ被募集至發(fā)育基因的啟動子處并處于暫停狀態(tài)以備激活表達，而成體組織特異性基因的RNAPⅡ暫停程度較小，并且傾向于由含有TATA box的啟動子驅(qū)動［31］。

生物體的發(fā)育過程需要通過RNAPⅡ啟動子近端暫停使細胞群體以精確和同步的方式對細胞外信號作出快速反應，由此作為組織器官生成的基礎，驅(qū)動細胞類型的多樣化。在果蠅早期胚胎發(fā)育的中囊胚轉(zhuǎn)換（mid-blastula transition，MBT）階段，RNAPⅡ啟動子近端暫停介導的轉(zhuǎn)錄同步激活有助于實現(xiàn)精確的轉(zhuǎn)錄時空調(diào)控和發(fā)育中復雜遺傳程序的有序展開［32-33］。在特定時空的發(fā)育信號激活下，相關區(qū)域特定基因上暫停的RNAPⅡ隨即進入釋放狀態(tài)，實現(xiàn)同步轉(zhuǎn)錄，如在由DPP激活的背外胚層形成和由Snail激活的中胚層形成過程中，廣泛存在的RNAPⅡ啟動子近端暫停能夠?qū)崿F(xiàn)對應部位基因的快速同步啟動，從而實現(xiàn)背腹側(cè)體軸的形成［30］。而SPT5突變會導致果蠅體軸發(fā)育缺陷［34］。NELF通過阻止發(fā)育基因的異常表達，并可能通過與其他在胚胎干細胞維持中起關鍵作用的轉(zhuǎn)錄抑制蛋白相互作用來抑制轉(zhuǎn)錄，幫助維持胚胎干細胞的未分化狀態(tài)。果蠅胚胎發(fā)育早期的NELF缺失導致胚胎轉(zhuǎn)錄激活失敗，并在MBT和原腸胚形成前死亡［35］。研究表明，NELF突變的小鼠胚胎干細胞對分化信號的反應減弱［36］，NELF突變的小鼠胚胎也無法發(fā)育到妊娠中期［37］；同時機體可以通過調(diào)節(jié)NELF蛋白豐度來控制細胞分化。NELF的過表達嚴重阻斷造血干細胞的分化，其缺失則會導致粒細胞分化程序的過早激活［38］。另外研究表明，斑馬魚中SPT5的缺失導致其在發(fā)育第4天死亡［39］，說明對RNAPⅡ啟動子近端暫停/釋放的負調(diào)控而非正調(diào)節(jié)對于機體發(fā)育至關重要。以上結(jié)果表明，RNAPⅡ啟動子近端暫停在細胞命運決定乃至機體發(fā)育中發(fā)揮重要調(diào)控作用。

3 RNAPⅡ啟動子近端暫停與其他基因表達調(diào)控機制的偶聯(lián)

3.1 染色質(zhì)可及性和表觀修飾

RNAPⅡ啟動子近端暫停影響核小體修飾并調(diào)控染色質(zhì)的可及性。在暫停RNAPⅡ的CTD結(jié)構(gòu)域的Ser5實現(xiàn)磷酸化修飾之后，SET被募集至RNAPⅡ并完成H3K4 me3修飾，這又會促進H3K9乙?；?，并通過SEC的募集來促進轉(zhuǎn)錄延伸［40］。此外組蛋白去乙?；窼IRT6可以去除H3K9ac標記，穩(wěn)定暫停的RNAPⅡ復合物，并通過調(diào)控P-TEFb和SEC組裝降低靶基因表達［41］。在果蠅細胞中通過Trichostatin A對組蛋白進行去乙?；揎椧矔е翿NAPⅡ啟動子近端的釋放［42］。以上結(jié)果說明暫停復合物與其他染色質(zhì)相關因子及組蛋白修飾之間存在復雜關聯(lián)，證明RNAPⅡ啟動子近端暫停是一種環(huán)境依賴的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控途徑。

果蠅胚胎發(fā)育過程中，許多啟動子處的核小體結(jié)合較強，隨時間推移逐漸開放并獲得高度停頓的RNAPⅡ，使基因處于易于對細胞外的信號做出反應的狀態(tài)［30］。當細胞未收到激活信號時，轉(zhuǎn)錄抑制因子通常會使RNAPⅡ暫停的基因保持沉默。Polycomb蛋白復合物（polycomb group，PcG）常結(jié)合于發(fā)育控制基因上，以時空調(diào)控方式對核小體進行H3K27 me3修飾，防止發(fā)育基因錯誤表達。在果蠅發(fā)育中，同時被暫停的RNAPⅡ占據(jù)和PcG蛋白抑制的基因常處于表達的動態(tài)調(diào)控過程，激活和抑制之間的動態(tài)平衡使基因處于可誘導狀態(tài)。

3.2 RNA剪切和提前終止

啟動子近端的轉(zhuǎn)錄提前終止是機體常見的基因調(diào)控方式。整合因子復合體（integrator complex）在啟動子近端發(fā)生轉(zhuǎn)錄提前終止發(fā)揮重要作用。一方面，整合因子復合體與NELF和DSIF相互作用，介導啟動子下游新生RNA的切割及降解；另一方面，整合因子復合體通過招募絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶2A復合物驅(qū)動暫停RNAPⅡ的CTD去磷酸化，從而抵消CDK9活性和相關暫停釋放［43］。盡管關于整合因子復合體介導的啟動子近端轉(zhuǎn)錄提前終止的具體機制尚不明確，但這些發(fā)現(xiàn)表明任何給定基因的轉(zhuǎn)錄都可以通過相反的激酶和磷酸酶活性進行微調(diào)，并分別驅(qū)動RNAPⅡ啟動子近端釋放或提前終止。

3.3 RNAPⅡ啟動子近端暫停與R環(huán)之間的聯(lián)系

RNAPⅡ啟動子近端暫停能夠促進新生RNA與模板DNA互補配對形成R環(huán)，而當RNAPⅡ的CTD區(qū)域發(fā)生ser2的磷酸化修飾后，RNAPⅡ進入延伸狀態(tài)并導致R環(huán)水平下降，此外，易于發(fā)生RNAPⅡ暫停的啟動子區(qū)域富含GC，而非編碼鏈上的GC，特別是G富集序列易形成G-四聯(lián)體（Gquadruplex）結(jié)構(gòu)從而進一步穩(wěn)定R環(huán)［44］。全基因組研究也證實，R環(huán)富集于RNAPⅡ暫停且富含GC的TSS區(qū)［45］。另外NELF-B突變介導的RNAPⅡ暫停的衰減可以降低R環(huán)的積累［46］。SRSF2能夠從7SK復合物中釋放p-TEFb，SRSF2的活性喪失導致暫停釋放受損并進一步促進R環(huán)的形成［47］。在果蠅組織中R環(huán)富集于TSS區(qū)域，并在衰老過程中的下調(diào)基因上廣泛富集，而破壞R環(huán)的動態(tài)平衡則會增加神經(jīng)退行性病變的風險［48］。在果蠅胚胎發(fā)育中，PcG能夠通過誘導HOX基因處R環(huán)的形成來阻止轉(zhuǎn)錄延伸向下進行，從而達到調(diào)控發(fā)育的目的［49］，暗示RNAPⅡ啟動子近端暫停和R環(huán)調(diào)控存在聯(lián)系。以上研究表明，RNAPⅡ啟動子近端暫停與其他基因表達調(diào)控機制偶聯(lián)形成復雜的調(diào)控網(wǎng)絡，共同調(diào)控基因表達及發(fā)育過程。

4 展望

RNAPⅡ啟動子近端暫停/釋放是基因表達調(diào)控的關鍵步驟，充分了解參與暫停釋放調(diào)控的蛋白因子和調(diào)控機制十分具有挑戰(zhàn)性。已有研究為RNAPⅡ啟動子近端暫停/釋放的分子機制解析提供了一個總體框架。新的調(diào)控因子不斷被發(fā)現(xiàn)，各因子調(diào)控基因的特異性以及相互協(xié)作機制逐漸被研究清楚。但是目前對RNAPⅡ啟動子近端暫停/釋放的研究主要是通過敲除或過表達調(diào)控因子實現(xiàn)，而特異性靶向RNAPⅡ暫停因子進行敲除或過表達需要數(shù)小時至數(shù)天，研究結(jié)果很有可能混淆了該基因敲除/過表達后的次級效應。因此使用靶向蛋白快速降解系統(tǒng)研究候選蛋白的調(diào)控作用十分必要。在復雜的機體調(diào)控過程中，RNAPⅡ啟動子近端暫停與其他轉(zhuǎn)錄調(diào)控步驟相互依賴，與其他染色質(zhì)相關因子和組蛋白修飾互作調(diào)控，從而形成復雜的調(diào)控網(wǎng)絡，而該網(wǎng)絡的系統(tǒng)性解析對研究者提出了更高要求，RNAPⅡ啟動子近端暫停與其他基因表達調(diào)控機制的偶聯(lián)也需要進一步深入研究。系統(tǒng)解析發(fā)育及其他生物過程中，R環(huán)與RNAPⅡ的動態(tài)偶聯(lián)機制也將為全面揭示RNAPⅡ啟動子近端暫停/釋放的生理意義提供新的研究方向。