于鯤，薛佳琪，王進寬，余永濤*

1.寧夏大學農學院，銀川750021；

2.固原市原州區(qū)張易鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)工作站，寧夏 固原756022

絲狀真菌（filamentous fungi）統(tǒng)稱為霉菌，廣泛分布于自然界中，因其種類豐富、來源廣泛、易于工業(yè)化等特點而在多個領域得到廣泛應用。曲霉屬（Aspergillus）和木霉屬（Trichoderma）等絲狀真菌具有良好的蛋白質合成和分泌能力，常被用于各種同源性或異源性蛋白質表達的生產(chǎn)，如利用黑曲霉（Aspergillus niger）通過人工生物合成來生產(chǎn)纖維素酶、菊粉酶［1］；用米曲霉（Aspergillus oryzae）生產(chǎn)人乳鐵蛋白、小牛凝乳素等。部分絲狀真菌還可用于合成有重要生物活性作用的次級代謝產(chǎn)物，如青霉素、洛伐他汀等。在環(huán)境保護方面，絲狀真菌可用來處理廢水、生產(chǎn)生物燃料、降解低密度聚乙烯［2］等。同時，絲狀真菌與人類的生產(chǎn)生活密切相關，一些絲狀真菌是人或動植物的病原真菌，如鐮刀菌屬（Fusariumspp.）和曲霉屬部分真菌可引起真菌性角膜炎［3］，煙曲霉（Aspergillus fumigatus）［4］可引起人類真菌性皮膚??；稻 瘟 病 菌（Magnaporthe oryzae）［5］、灰 霉 菌（Botrytis cinerea）［6］等 可 引 起 農 作 物 的 真 菌 性病害。

通過研究絲狀真菌生物合成相關基因的功能，并應用生物技術手段對其進行遺傳選育或改造，可以顯著提升絲狀真菌合成生物活性物質的能力，從而達到利用絲狀真菌進行工業(yè)化生產(chǎn)和應用的目的［7］?；谕粗亟M原理的基因敲除等技術，如Split-marker、λRed等已廣泛應用于絲狀真菌基因功能的研究［8］。但由于同源重組效率低、脫靶率高、需要對大量轉化子進行篩選、工作量巨大等因素，近年來已逐漸被基因編輯等技術所替代［9］。近年來，科研人員陸續(xù)開發(fā)了多種用于基因編輯的特異性核酸內切酶技術，如鋅指核酸酶（zinc finger nuclease，ZFN）、類轉錄因子樣效應核酸 酶（transcription activator-like effector nuclease，TALEN）、CRISPR/Cas9等技術，與ZFN技術［10］和TALEN技術［11］相比，CRISPR/Cas9技術具有操作簡單、靶向性好、安全性高等優(yōu)點，已經(jīng)成為絲狀真菌基因編輯的首選技術。本文綜述了CRISPR/Cas9技術的起源與基本原理，sgRNA的合成策略，Cas9蛋白、CRISPR/Cas9系統(tǒng)的遞送、實現(xiàn)基因編輯的方式和存在的問題，以期為該技術在絲狀真菌中的應用提供理論依據(jù)。

1 CRISPR/Cas9技術的起源與基本原理

1987年日本微生物學家Ishino等［12］首次在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了成簇而規(guī)律地間隔短回文重復序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）。2002年Jansen等［13］發(fā)現(xiàn)了與CRISPR序列相鄰的Cas基因，并且在細菌（＞40%）以及古細菌（＞90%）中都存在這一系統(tǒng)，同時證實這一系統(tǒng)與細菌免疫有關。隨著研究的深入，該系統(tǒng)的各組成成分及功能逐漸被揭示。2013年該系統(tǒng)首次被應用于基因編輯，隨后該系統(tǒng)被廣泛應用于植物［14］、動物以及微生物［15］的基因編輯中。2015年Liu等［16］首次將CRISPR/Cas9技術運用于絲狀真菌模式生物—里氏木霉（Trichoderma reesei）中，之后在多種絲狀真菌的基因改造中得到廣泛應用。

目前，被廣泛應用的Ⅱ型CRISPR/Cas9系統(tǒng)來自于化膿性鏈球菌，該系統(tǒng)主要由兩部分組成：一個組成部分是通過堿基互補配對方式對目的基因編輯區(qū)域進行定位的向導RNA（small guide RNA，sgRNA）；另一組成部分是通過PAM序列（5'-NGG-3'）與靶向DNA結合且具有核酸內切酶功能的Cas9蛋白。sgRNA引導Cas9蛋白與靶向序列結合后實現(xiàn)對DNA雙鏈的切割［17］。DNA雙鏈斷裂后，細胞內啟動非同源末端連接或同源重組修復機制來重新連接斷裂雙鏈，在此過程中實現(xiàn)基因的敲除或替換。

2 絲狀真菌中sgRNA的表達策略

sgRNA作為CRISPR/Cas9系統(tǒng)的重要組成部分，其能否正確表達是基因編輯成功的關鍵因素，而合適的啟動子才能高效驅動sgRNA的表達來實現(xiàn)基因編輯，因此選擇合適的啟動子對sgRNA的表達至關重要。gRNA在真核細胞內的表達通常分為RNA聚合酶Ⅲ啟動子驅動和RNA聚合酶Ⅱ啟動子驅動兩種表達策略。

2.1 由RNA聚合酶Ⅲ啟動子驅動sgRNA表達

sgRNA轉錄完成后不需要在5'端和3'端分別添加帽子結構以及polyA尾巴，所以由RNA聚合酶Ⅲ啟動子驅動gRNA的表達更為合適。U6 sn-RNA基因在真核生物中高度保守，而U6啟動子作為廣泛存在的組成型啟動子在多種真核生物CRISPR/Cas9系統(tǒng)中被用于驅動sgRNA的表達。Arazoe等［18］成功將稻瘟病菌的內源性U6啟動子應用于sgRNA的表達，通過CRISPR/Cas9技術成功實現(xiàn)了SDH基因的替換。之后，U6啟動子還被用于嗜熱毀絲菌［19］、里氏木霉［20］、米曲霉［21］、黑曲霉［22］等絲狀真菌sgRNA地表達和基因編輯。此外，tRNA啟動子也被成功用于sgRNA的表達。Song等［23］在黑曲霉中測試了37個tRNA啟動子，發(fā)現(xiàn)其中36個具有良好的驅動sgRNA表達的功能。但tRNA啟動子驅動的RNA表達具有自我剪切功能，在某些情況下并不能正確地表達sgRNA，基于tRNA啟動子的基因編輯效率一直存在爭議。研究表明，5S rRNA作為細胞的基本成分，具有高度保守且含量豐富的特點，Zheng等［24］根據(jù)這一特點構建了基于5S rRNA基因內部啟動子的新型sgRNA表達策略，并在5S rRNA序列和sgRNA序列之間插入一個88 bp的丁型肝炎病毒（hepatitis dvirus，HDV）核酶來避免5S rRNA對sgRNA結構和功能的影響。在黑曲霉中，基于5S rRNA啟動子的基因編輯效率（96%）明顯高于基于U6啟動子的基因編輯效率（15%～23%）。Shi等［25］在藤倉鐮孢菌（Fusarium fujikuroi）中的研究結果也表明，基于內源性5S rRNA啟動子的基因編輯效率明顯高于其他啟動子。Wang等［26］在草酸青霉（Penicillium oxalicum）和里氏木霉的基因編輯實驗中發(fā)現(xiàn)，來自黑曲霉的5S rRNA啟動子可以高效地驅動草酸青霉中的基因編輯，但幾乎不能驅動里氏木霉中的基因編輯，而天然的5S rRNA啟動子更適合在里氏木霉基因編輯中驅動sgRNA表達。以上研究表明，RNA聚合酶Ⅲ啟動子對于sgRNA序列的驅動具有獨特優(yōu)勢，且越來越多的RNA聚合酶Ⅲ啟動子被用于絲狀真菌的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，這使得絲狀真菌基因編輯系統(tǒng)的建立逐漸變得容易。但不同的RNA聚合酶Ⅲ啟動子在不同絲狀真菌中的驅動效果具有極大差異，因此選擇合適的內源啟動子尤為重要。

2.2 由RNA聚合酶Ⅱ啟動子驅動sgRNA表達

盡管目前已有多種由RNA聚合酶Ⅲ啟動子驅動gRNA表達的策略，但由于RNA聚合酶Ⅲ類啟動子本身存在一些局限性，如表達看家基因、開發(fā)尚不完善等［27］，無法適應所有CRISPR/Cas9系統(tǒng)，因此人們開始關注RNA聚合酶Ⅱ啟動子。RNA聚合酶Ⅱ啟動子主要參與mRNA的轉錄，其會在轉錄產(chǎn)物的5'端和3'端分別添加帽子結構和Poly A尾。所以在使用RNA聚合酶Ⅱ啟動子驅動sgRNA的表達時，需要在sgRNA序列的兩側分別添加錘頭狀核酶（hammerhead，HH）和HDV核酶，對轉錄產(chǎn)物進行自體剪切，從而產(chǎn)生結構和功能正常的sgRNA［28］。N?dvig等［29］根據(jù)這一特點，應用構巢曲霉RNA聚合酶Ⅱ啟動子gpdA和trpC終止子建立了由RNA聚合酶Ⅱ啟動子驅動錘頭狀核酶和丁型肝炎病毒核酶介導的sgRNA表達策略，并成功應用于多種絲狀真菌。此外，RNA聚合酶Ⅱ啟動子tef1也被用于sgRNA的表達中［30］。RNA聚 合 酶Ⅱ啟 動 子 的 應 用 豐 富 了sgRNA序列表達驅動的可選擇性。

2.3 體外轉錄sgRNA

除以上兩種表達策略外，在有些真菌的基因編輯中部分研究者還會采用體外轉錄sgRNA的策略，通常先合成一段由T7啟動子調控的sgRNA表達序列，然后使用體外轉錄試劑盒生成sgRNA［31］。獲得的sgRNA可以與體外表達并純化后的Cas9蛋白共同構成核糖核蛋白（ribonucleoprotein，RNP）后再進行宿主轉化，該方法在宿主的基因編輯過程中沒有出現(xiàn)質粒，所以也被稱為無質粒CRISPR/Cas9系統(tǒng)［32］。與質粒轉化系統(tǒng)相比，體外合成sgRNA可以進行切割效率驗證，方便選擇高效的sgRNA進行研究，同時也會降低將外源基因轉化到基因組的可能性。目前RNP介導的無質粒CRISPR/Cas9系統(tǒng)已被應用于尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）［33］、煙曲霉［32］、卷枝毛霉（Mucor circinelloides）［34］等多種絲狀真菌的基因編輯中。RNA的體外表達在進行基因編輯時可以引入選擇標記，這降低了外源基因引入的風險，但也會增大轉化子篩選的難度，且gRNA在轉化時存在被降解的風險。以上結果表明，不同的絲狀真菌因其菌體結構、代謝機制和生理生化等方面的差異，應選用不同的sgRNA表達策略進行研究。

3 用于絲狀真菌的Cas9蛋白改造與表達

3.1 Cas9蛋白的序列優(yōu)化以及核定位信號的添加

具有核酸內切酶功能的Cas9蛋白是CRISPR/Cas9系統(tǒng)的重要組成部分，目前被廣泛應用的CRISPR/Cas9系統(tǒng)來自于原核生物化膿鏈球菌。不同的物種在編碼蛋白質時具有密碼子偏好性，當CRISPR/Cas9系統(tǒng)被用于不同物種的基因編輯時，需要對編碼Cas9蛋白的基因序列進行密碼子優(yōu)化，因此應根據(jù)不同物種需求，在絲狀真菌基因編輯的研究過程中對氨基酸密碼子優(yōu)化［29］。CRISPR/Cas9系統(tǒng)分離自細菌中，天然Cas9蛋白不具備核定位信號，所以CRISPR/Cas9系統(tǒng)被應用于真核生物時，需要在Cas9蛋白兩端添加核定位信號（nuclear localization signal，NLS）用來引導Cas9蛋白進入細胞核。來自于猿猴空泡病毒（Simian vacuolating virus40，SV40）的核定位序列（PKKKRKV）被證明可以廣泛應用于不同物種［29］。但SV40 NLS并不適用于所有的絲狀真菌，F(xiàn)eng等［35］和Wang等［33］的研究表明，經(jīng)典的核定位序列無法在大豆疫霉（Phytophthora megasperma）和尖孢鐮刀菌中完成入核引導，最終他們將內源性核定位序列融合到Cas9蛋白的N端用以引導sgRNA進入細胞核。Shi等［25］在藤倉鐮孢菌的研究中同樣證明經(jīng)典核定位序列不能被應用，而選擇了VELNLS和HTBNLS完成基因編輯。以上研究表明，添加適當?shù)暮硕ㄎ恍蛄惺荂as9蛋白順利進入細胞核行使功能的關鍵因素，在經(jīng)典核定位序列不能完成入核引導時應盡量尋找該物種的內源性核定位序列或同屬親緣關系較近的物種中已知的核定位序列。

3.2 Cas9蛋白表達策略

與sgRNA相似，Cas9蛋白是否能表達與啟動子的類型密切相關，啟動子調控能力的強弱直接影響外源性Cas9蛋白的表達。生物體中的RNA聚合酶Ⅱ啟動子主要分為組成型啟動子和誘導型啟動子。在大多數(shù)研究中會選擇組成型啟動子來驅動Cas9蛋白在絲狀真菌中的表達，原因為組成型啟動子驅動基因表達不受空間和時間因素的影響，在組織細胞中可以穩(wěn)定持續(xù)表達。絲狀真菌CRISPR/Cas9系統(tǒng)常用的組成型啟動子主要是gpdA啟動子［21，30，36］、tef1啟動子、trpC啟動子。通常，誘導型啟動子在受到特定條件刺激后才會驅動基因的表達，所以Cas9在誘導型啟動子的驅動下表達使CRISPR/Cas9系統(tǒng)成為絲狀真菌基因組編輯的時空控制器。此外有研究中使用了由淀粉誘導的amyB啟動子［37］、溫度誘導的hsp70啟動子［38］等。Liu等［39］將cbh1啟動子應用于Cas9的表達。以上研究表明，在實際研究中，對驅動Cas9蛋白表達啟動子的選擇需要根據(jù)實際情況進行，以保證CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠在目標菌株中高效合理的發(fā)揮作用。

4 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的遞送進真菌細胞的方式

用于真菌基因組編輯的CRISPR/Cas9系統(tǒng)需要合適的方法轉染至細胞內。聚乙二醇-氯化鈣介導的原生質體轉化法作為一種周期短、成本低的真菌遺傳轉化方法，可對質粒、線性化DNA、RNA、蛋白質等多種大分子物質進行轉化，已被廣泛應用于煙曲霉［40］、嗜熱毀絲菌［19］、里氏木霉［26］、黑曲霉［41］等絲狀真菌中。在易產(chǎn)生多核孢子和多核原生質體的絲狀真菌中，從RNP瞬時轉化中分離純合轉化子較困難，所以Zou等［42］在原生質體制備前的菌絲培養(yǎng)過程中加入了肌醇或苯菌靈來控制有絲分裂周期，明顯提高了純合轉化體的獲得效率。

雖然目前原生質體轉化已被大量運用于絲狀真菌CRISPR/Cas9系統(tǒng)的轉化中，但原生質體的活力取決于用于生產(chǎn)原生質體的菌絲生長狀態(tài)以及所用酶的批次質量，這嚴重影響了原生質體的轉化效率。相對而言，在農桿菌轉化方法中起始材料選擇范圍較為廣泛，這使得CRISPR/Cas9系統(tǒng)的轉化變得更加方便快捷。Wei等［43］使用根癌農桿菌LBA4404對絲狀真菌（Glarea lozoyensis）的菌絲體完成了CRISPR質粒轉化。Zou等［31］使用根癌農桿菌LBA1100與里氏木霉的分生孢子共同培養(yǎng)完成了Cas9表達載體的轉化。目前通過原生質體法和電擊法未實現(xiàn)嗜熱絲狀真菌（Thermoascus aurantiacus）的轉化，Gabriel等［44］使用根癌農桿菌EHA105與嗜熱絲狀真菌的子囊孢子共培養(yǎng)的方法進行了實驗，并完成了基因編輯。在農桿菌介導的轉化方法中選擇合適的農桿菌菌株以及轉化起始材料尤為重要，這對轉化效率的影響較大。除以上兩種常見的遺傳轉化方法外，基因槍轉化法［30］、電穿孔轉化法［45］等也被應用到絲狀真菌CRISPR/Cas9系統(tǒng)的遺傳轉化中。以上研究表明，不同的絲狀真菌生長狀況及其生理特性不盡相同，所以在遺傳轉化方法的選擇中需要綜合考慮多方面因素，合適的轉化方法可以極大地提高陽性轉化子的獲得率。

5 CRISPR/Cas9系統(tǒng)實現(xiàn)基因編輯的方式

當Cas9蛋白成功作用于靶位點后，會導致DSB，當DSB產(chǎn)生后，細胞為了保持DNA雙鏈的完整性，會通過非同源性末端鏈接（nonhomologous end joining，NHEJ）和同源重組（homologydirected repair，HDR）兩種途徑對斷裂的雙鏈進行連接修復從而實現(xiàn)基因編輯。

5.1 NHEJ機制試驗絲狀真菌基因敲除

NHEJ機制具有高效、迅速等特性，幾乎可在細胞復制的所有周期進行DSB修復［46］。NHEJ修復通路過程中Ku70蛋白和Ku80蛋白起到了重要作用［47］。通常由NHEJ通路完成的DSB修復保真性較差，在斷端修復過程中會引起堿基的插入或缺失造成移碼突變，導致基因開放閱讀框的提前終止，從而實現(xiàn)目標基因的敲除。

5.2 HDR機制實現(xiàn)絲狀真菌定向基因編輯

HDR機制具有高保真特性，在正常修復過程中需以未受損的同源序列為模板進行修復［48］。在基因工程中，通過人為引入具有同源片段的DNA分子作為模板來實現(xiàn)基因的定向編輯［49］，如基因的定向敲除［43］、構建特殊表型［50］、外源基因或報告基因的敲入［39，51］等。Liu等［39］在研究中發(fā)現(xiàn)，當供體DNA中具有≥200 bp的同源區(qū)域，則可以刺激里氏木霉中的同源重組，添加≥600 bp的同源臂時，同源重組的頻率幾乎為100%。Wang等［26］在草酸青霉（Penicillium oxalicum）中使用不帶標記的40 bp上下游同源臂直接融合產(chǎn)物，編輯效率極低（6%），而使用帶有40 bp上下游同源片段以及潮霉素標記的供體DNA，則可以進行同源重組。Kuivanen等［52］在黑曲霉中以40 bp的側翼序列作為供體DNA的一部分，同樣實現(xiàn)了同源重組。由于HDR的修復條件較為苛刻，通常由迅速反應的NHEJ搶先修復，而由HDR介導的基因敲入效率往往較低，所以近期研究中，人們致力于如何提高HDR介導基因定向編輯的效率問題，如有研究表明，在絲狀真菌的NHEJ缺陷株中HDR的效率會得到一定的提高［7，53］，Gandía等［54］研究表明，破壞參與非同源末端連接的Ku70蛋白會促進同源重組的發(fā)生。

6 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在絲狀真菌中的編輯效率與脫靶效應

6.1 編輯效率

編輯效率是指實現(xiàn)目標基因成功編輯的菌株所占的比率，相較于傳統(tǒng)基因編輯系統(tǒng)，CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)具有編輯效率高的特性，但也不能保證所有的研究都能高效進行，如Katayama等［37］在研究中應用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)分別對米曲霉wA、pyrG和yA基因進行編輯，編輯效率分別為10%～20%、10%和100%，這表明同一菌株中不同的基因在進行CRISPR/Cas9基因編輯時，編輯效率具有較大差異。Gabriel等［44］在嗜熱絲狀真菌（Thermoascus aurantiacus）的研究中針對同一基因的不同靶位點設計了3個sgRNA（sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3），最終只有sgRNA1和sgRNA3實現(xiàn)了基因編輯，成功率分別為10%和35%。van Rhijn等［40］的研究表明，使用選擇性培養(yǎng)基再生的菌株的編輯效率明顯高于非選擇性培養(yǎng)基上再生的菌株。Li等［21］構建了nDsRed報告基因，將原間區(qū)序列和PAM區(qū)共同插入到DsRed起始密碼子下游并構建失活的熒光蛋白的表達質粒，當CRISPR系統(tǒng)成功表達并作用于原間區(qū)序列后有一定概率再次造成移碼突變，使得紅的熒光蛋白恢復活性，從而為挑選陽性突變株提供便利。以上研究表明，通過各種方法提高編輯效率，有助于快速獲得所需的基因編輯目標菌株，從而大大降低試驗工作量和試驗成本。

6.2 脫靶效應

脫靶效應是指sgRNA沒有作用于靶點序列而產(chǎn)生的非特異性切割，從而產(chǎn)生非預期基因突變的情況。產(chǎn)生脫靶的原因主要有sgRNA與靶點序列等長但存在錯配堿基，sgRNA存在一個或多個堿基“凸起”，靶點DNA存在一個或多個“凸起”［55-56］。在CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)得到廣泛應用后，脫靶效應問題日益突出，并嚴重影響編輯效率的提高。研究表明，每個sgRNA的脫靶位點不會超過5個［57］。針對脫靶效應問題，不同的研究采用了不同的策略，Leynaud-Kieffer等［36］在黑曲霉的研究中引入“跳躍系統(tǒng)”，使脫靶菌株在含有5-FOA的培養(yǎng)基上死亡，從而降低脫靶菌株率。sgRNA和Cas9蛋白的濃度過高以及持續(xù)表達也會引起脫靶效應，故質粒的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)［33-34，42］被開發(fā)應用于絲狀真菌基因編輯。Huck等［38］在毛霉病菌的CRISPR/Cas9表達質粒構建時去除了介導自我復制的元件，使得其不能自我復制而只能做瞬時表達，從而降低脫靶效應。基于第二代測序的GUIDE-seq［58］、Digenomeseq［59］等分子生物學技術也可用于脫靶位點的檢測，從而減少脫靶產(chǎn)物的產(chǎn)生。以上研究表明，脫靶效應是不可避免的，但通過不同的實驗設計以及檢測方法，可以減少脫靶產(chǎn)物的產(chǎn)生。

7 CRISPR/Cas9技術在絲狀真菌中的應用

絲狀真菌與人類生活有著極為密切的聯(lián)系，利用絲狀真菌生產(chǎn)具有重要價值的生物酶和次級代謝產(chǎn)物已成為工業(yè)界和學術界關注的焦點。野生型菌株并不能實現(xiàn)所需產(chǎn)物工業(yè)化水平的生產(chǎn)，為了解決這一問題，科研人員開發(fā)了許多基因技術來增加所需目標產(chǎn)物的產(chǎn)量。鑒于絲狀真菌的復雜性，包括多細胞形態(tài)、細胞分化、厚幾丁質細胞壁以及缺乏合適的質粒，CRISPR/Cas9技術在工業(yè)菌株的改造中極大地提高了基因改造能力。

作為生物酶工業(yè)化生產(chǎn)中最常用的真菌，里氏木霉具有強大的異源蛋白合成及分泌能力［60］。Fonseca等［61］使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在里氏木霉RUT-C30引入6種基因修飾，包括纖維素酶主調節(jié)因子XYR1的突變等位基因的組成型表達、兩種異源酶的表達，即來自埃默森籃狀菌（Talaromyces emersonii）的β-葡萄糖苷酶CEL3A和來自黑曲霉的轉化酶SUC1，以及編碼纖維素酶阻遏物ACE1和細胞外蛋白酶SLP1和PEP1的基因缺失。最終所得基因編輯菌株的纖維素混合酶分解纖維素的能力明顯高于RUT-C30。Liu等［62］同樣將里氏木霉RUT-C30作為試驗菌株，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除SxlR基因來調節(jié)木聚糖酶和纖維素酶的比例，獲得了更高的木質纖維素水解效率。里氏木霉的纖維素酶共表達特性對于纖維素分解酶混合物具有重要意義，但在異源蛋白表達時這種特性通常是不被看好的。Rantasalo等［63］利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)及通用功能合成基因表達系統(tǒng)作用于里氏木霉，成功獲得了高純度脂肪酶B（來自于南極假絲酵母）。Rojas-Sanchez等［64］在使用黑曲霉生產(chǎn)人類促紅細胞生成素時，使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對vps、prtT、algC和och1基因進行敲除，獲得了一種不含蛋白酶的菌株，其重組人紅細胞生長素（recombinant human erythropoietin，rHuEPO）生產(chǎn)水平提高了41.1倍。Yang等［65］在生產(chǎn)檸檬酸的黑曲霉ATCC 1015菌株中進行了連續(xù)的基因操作，替換高效的C4-二羧酸轉運蛋白并過表達可溶性NADH依賴性延胡索酸還原酶，顯著提高了工程菌株中琥珀酸的產(chǎn)量，這說明通過基因敲除策略可以顯著提高黑曲霉的異源蛋白表達效率。以上研究表明，CRISPR/Cas9系統(tǒng)已逐漸應用于工業(yè)真菌，而使用CRISPR/Cas9基因組編輯系統(tǒng)可以進一步增強這些工業(yè)真菌的適用性。

除了對以上工業(yè)真菌的改造，CRISPR/Cas9基因組編輯技術還可用于其他絲狀真菌，如Seekles等［50］在 絲 狀 真 菌Paecilomyces variotii和Penicillium roqueforti的研究中，使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對參與非同源末端修復的kusA基因進行敲除，創(chuàng)建了非同源末端連接機制受到破壞的菌株；Vieira等［30］使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)生成具有pyr4營養(yǎng)缺陷型標記的哈茨木霉，對農業(yè)生物防治劑具有重要生態(tài)學價值。以上對菌株本身的改造為后期菌株的基因編輯提供了有力的基礎。

8 展望

相對于傳統(tǒng)的ZFN和TALEN基因編輯系統(tǒng)，CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)具有獨特的優(yōu)勢。CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)組成成分簡單，僅由sgRNA和Cas9蛋白兩部分組成，它們可根據(jù)具體需要構建于不同載體或同一載體上，也可直接體外合成后構建穩(wěn)定復合物，并轉入細胞。該系統(tǒng)要求條件較少，僅需要一個特定的PAM序列（NGG），而PAM序列廣泛存在于生物體的基因組中，即CRISPR/Cas9系統(tǒng)幾乎適用于所有基因的編輯。此外，CRISPR/Cas9系統(tǒng)可使用較少的選擇性標記同時對多個基因進行編輯［39］。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)因其獨特的優(yōu)勢，目前在絲狀真菌模式生物其他真菌都被大力開發(fā)應用。在工程菌株的改造方面取得了巨大成果，越來越多的絲狀真菌工程菌株被開發(fā)利用。盡管CRISPR/Cas9系統(tǒng)已被廣泛應用于絲狀真菌的基因編輯，但仍存在編輯效率低、脫靶效應等問題。根據(jù)DNA雙鏈斷裂和染色體易位原理，Yin等［66］基于高通量測序方法開發(fā)了一種引物延伸介導測序（primer extension-mediated sequencing，PEM-seq）的新方法。PEM-seq可以靈敏識別Cas9的脫靶位點，還可以準確量化CRISPR/Cas9對靶點的切割效率位點，從而找到更有效的Cas9切割位點。雖然目前該方法還未在絲狀真菌中建立，但隨著研究的深入PEM-seq將會在真菌基因編輯中發(fā)揮巨大作用。在非模式絲狀真菌中存在編輯難度較高、編輯效率波動較大等問題，這可能與人們不了解宿主真菌的代謝、防御等機制，無法解除宿主內CRISPR系統(tǒng)的限制因素相關。隨著研究的深入，未來將會有更多的絲狀真菌的基因組被破譯，以幫助研究人員設計更加適合絲狀真菌的CRISPR系統(tǒng)。