李新，王園園，侯婉毅，李思佳，江魁，趙云霞

華蘭基因工程有限公司，河南新鄉(xiāng)453003

流式細胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）是指利用流式細胞儀對液流中的細胞或生物顆粒逐個進行多參數(shù)快速分析的技術(shù)［1］，已成為血液病研究和診斷的重要生物技術(shù)之一。盡管流式檢測外周血淋巴細胞表面標志已有基本的實驗步驟（加入熒光抗體→裂解紅細胞→洗細胞→重懸后上機檢測），但實驗中仍可能存在多種因素影響結(jié)果的準確性［2］，如抗體滴定［3］、紅細胞裂解［4］、多聚甲醛固定［5］等，因此對影響因素進行優(yōu)化可以提高分析結(jié)果的準確性。目前已有對B淋巴細胞亞群、單核細胞的流式檢測方法進行優(yōu)化的報道［6-7］，但鮮見對T淋巴細胞流式檢測方法進行優(yōu)化的報道。T淋巴細胞膜上的主要抗原標志是CD3，按功能T細胞可分為輔助性T細胞（CD3+CD4+）和細胞毒性T細胞（CD3+CD8+）兩個亞群。大量研究認為，優(yōu)化流式檢測外周血T淋巴細胞亞群的方法對臨床前藥物免疫毒性的評價［8］、患者免疫功能及疾病的診斷［9-11］均有重要意義。本研究從樣本體積、抗體滴定、紅細胞裂解條件對外周血T淋巴細胞亞群流式檢測方法進行了優(yōu)化，并驗證了優(yōu)化方法的精密度和樣品穩(wěn)定性，旨在完善實驗方法，提高流式檢測外周血樣本結(jié)果的準確性，以期指導臨床前評價中的流式相關檢測，以及為某些血液病的臨床診斷方法學研究提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取6只健康清潔級雄性美國國立衛(wèi)生研究院（National Institutes of Health，NIH）小鼠，體質(zhì)量16～18 g，均購自華蘭生物疫苗股份有限公司，許可證號：SCXK（豫）2020-0003，質(zhì)量合格證：410966211100075351。實驗小鼠飼養(yǎng)于華蘭基因工程有限公司動物中心屏障動物實驗室，飼養(yǎng)環(huán)境：12 h光照/12 h黑暗，相對濕度40%～70%，溫度22～25℃。實驗過程符合動物福利3R指導原則，已通過動物關懷及使用委員會批準，批準號：ERHLGE-2021-P010。

1.2 主要試劑和儀器

磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）購自美國Gibco公司；肝素鈉和牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）購自索萊寶公司；抗體FITC rat anti-mouse CD3（貨號：11-0032-82，克隆號：17A2，0.5 mg·mL-1）、APC rat anti-mouse CD4（貨號：17-0041-82，克隆號：GK1.5，0.2 mg·mL-1）、PE rat anti-mouse CD8a（貨號：12-0081-82，克隆號：53-6.7，0.2 mg·mL-1）和紅細胞裂解液均購自美國eBioscience公司；死活染料7-氨基放線菌素（7-amino-actinomycin D，7-AAD）購自美國BD公司。離心機購自美國Eppendorf公司；細胞計數(shù)儀購自德國ROCHE公司；流式細胞儀C6購自美國BD公司。

1.3 預處理方法

小鼠眼眶靜脈叢采集外周血，按50∶1的比例加入1%肝素鈉溶液制備成抗凝血。于2 mL離心管中加入肝素鈉抗凝血，再加入1% BSA-PBS稀釋的熒光抗體進行染色，輕輕混勻，室溫避光孵育30 min，加入紅細胞裂解液裂解紅細胞后，用PBS終止裂解反應，500 g·min-1離心5 min，棄上清，加入300 μL PBS重懸細胞沉淀，上機檢測前加入7-AAD，孵育10 min。

1.4 方法優(yōu)化

1.4.1 樣本體積6只小鼠分別取50、100 μL抗凝血，裂解紅細胞后用300 μL PBS重懸細胞沉淀，進行細胞計數(shù)。

1.4.2 熒光抗體 采用6只小鼠的抗凝血混合后，對抗體FITC rat anti-mouse CD3、APC rat anti-mouse CD4和PE rat anti-mouse CD8a分別進行了6個濃度的滴定：FITC rat anti-mouse CD3的終濃度分別為1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00 μg·mL-1，APC rat anti-mouse CD4的終濃度分別為0.625、1.250、2.500、5.000、10.000、20.000 μg·mL-1，PE rat anti-mouse CD8a的終濃度分別為1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00 μg·mL-1。每個濃度設3個重復，選擇各抗體信噪比［signal/noise，S/N，陽性熒光強度中值與陰性熒光強度中值（median fluorescence intensity，MFI）的比值］較大的一組作為該抗體滴定的最佳工作濃度。

1.4.3 紅細胞裂解條件 根據(jù)紅細胞裂解液的使用說明書，篩選了5個裂解條件：①裂解1次，裂解時間為5 min；②裂解1次，裂解時間為8 min；③裂解1次，裂解時間為10 min；④裂解2次，每次裂解時間為5 min；⑤裂解2次，每次裂解時間為8 min。通過比較前向散射光（forward scatter，F(xiàn)SC，與細胞大小相關）和側(cè)向散射光（side scatter，SSC，與細胞顆粒度相關）散點圖中淋巴細胞門內(nèi)的細胞占比情況、碎片雜質(zhì)信號及白細胞亞群的基本形態(tài)，確定適宜的裂紅條件。

1.5 方法學驗證

1.5.1 精密度驗證 通過檢測批內(nèi)差異和批間差異進行精密度驗證。批內(nèi)差異：將1只小鼠血樣分成6份（編號分別為1、2、3、4、5、6）進行檢測。實驗合格標準：6份樣品3個指標（CD3+細胞/淋巴細胞、CD3+CD4+細胞/淋巴細胞、CD3+CD8+細胞/淋巴細胞）的變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）均≤15%。批間差異：將1只小鼠連續(xù)3 d（第1天、第2天、第3天）同一時間進行采樣檢測，設重復孔。實驗合格標準：3次檢測3個指標的CV值均≤15%。

1.5.2 樣本穩(wěn)定性驗證 將5只小鼠的抗凝血混合后分為立即檢測血樣、4℃放置24 h血樣和室溫放置24 h血樣共3份，每份5個樣品。將4℃放置24 h、常溫放置24 h血樣染色處理的檢測結(jié)果分別與采樣后立即檢測結(jié)果進行t檢驗差異分析。另外，將立即檢測后的樣品（即染色處理后樣品）繼續(xù)于4℃放置24 h后復測，將結(jié)果與立即檢測結(jié)果進行t檢驗差異分析。

1.6 數(shù)據(jù)處理

流式圖采用FlowJo V10軟件分析，數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 8.0.1統(tǒng)計學軟件進行處理，結(jié)果用平均值±標準差（±s）表示。采用Student’st-檢驗計算組間顯著性差異，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣本體積的確定

50 μL血樣中裂紅后細胞濃度為1.20×107cells·mL-1，活 細 胞1.19×107cells·mL-1，活 率99.0%；100 μL血樣中裂紅后細胞濃度為2.05×107cells·mL-1，活細胞濃度2.02×107cells·mL-1，活率98.3%（表1）。因流式檢測要求細胞濃度范圍為5×105～1×108cells·mL-1。依據(jù)實驗動物福利3R中減少原則，以及生物制品臨床前評價中可能需要對相同動物進行不同時間點的多次采血，以上研究表明50 μL抗凝血中的細胞濃度符合流式細胞儀上機要求，采用50 μL抗凝血進行后續(xù)試驗。

表1 不同體積血樣中的細胞濃度（±s，n=6）Table 1 Cell concentrations in blood samples of different volumes(±s,n=6)

表1 不同體積血樣中的細胞濃度（±s，n=6）Table 1 Cell concentrations in blood samples of different volumes(±s,n=6)

樣本體積/μL 50 100細胞濃度/（×106 cells·mL-1）12.03±1.49 20.53±1.36活細胞濃度/（×106 cells·mL-1）11.91±1.47 20.18±1.33細胞活率/%99.0±0.14 98.3±0.25

2.2 不同抗體的滴定結(jié)果分析

抗體滴定結(jié)果見圖1，F(xiàn)ITC rat anti-mouse CD3抗體隨著滴定濃度的增加S/N值無明顯變化；APC rat anti-mouse CD4和PE rat anti-mouse CD8a抗體S/N值隨著滴定濃度的增加呈先增加后降低的趨勢。經(jīng)t檢驗差異分析表明，6個滴定濃度的FITC rat anti-mouse CD3抗體的S/N均無顯著差異（P＞0.05），為達到節(jié)約抗體的目的，選擇FITC rat anti-mouse CD3的最佳滴定濃度為1.25 μg·mL-1；1.25 μg·mL-1APC rat anti-mouse CD4抗體的S/N顯著高于0.625 μg·mL-1（P＜0.05），但與2.50 μg·mL-1的S/N差異不顯著（P＞0.05），故APC rat anti-mouse CD4的最佳滴定濃度為1.25 μg·mL-1；5.00 μg·mL-1PE rat anti-mouse CD8a抗體的S/N顯著高于1.25 μg·mL-1和2.50 μg·mL-1（P＜0.05），但與10 μg·mL-1的S/N差異不顯著（P＞0.05），故PE rat anti-mouse CD8a的最佳抗體滴定濃度為5.00 μg·mL-1。而說明書中FITC rat anti-mouse CD3、APC rat anti-mouse CD4和PE rat anti-mouse CD8a的建議濃度分別為2.50 μg·mL-1、1.25 μg·mL-1和2.50 μg·mL-1。以上結(jié)果表明在進行抗體染色前需要根據(jù)具體的實驗目的和樣本對抗體進行滴定，確定抗體的最佳工作濃度。

圖1 FITC rat anti-mouse CD3、APC rat anti-mouse CD4、PE rat anti-mouse CD8a抗體不同濃度S/N值變化趨勢Fig.1 Trend of S/N value of FITC rat anti-mouse CD3,APC rat anti-mouse CD4 and PE rat anti-mouse CD8a antibodies at different concentrations

2.3 紅細胞裂解條件的確定

由圖2可知，裂解2次的樣品在FSCvs.SSC圖中P2門內(nèi)的淋巴細胞占比較高，且門前面的雜質(zhì)碎片信號較少，白細胞亞群維持基本形態(tài)，整體裂紅效果稍優(yōu)于1次裂解效果；其中裂解2次、每次5 min和裂解2次、每次8 min效果相當，故選擇裂解2次、每次5 min作為適宜的裂紅條件。

圖2 不同裂解條件下的FSC vs.SSC圖Fig.2 FSC vs.SSC diagram in different lysis conditions

2.4 樣本精密度分析

由表2可知，6份樣品3個指標批內(nèi)差異的CV＜15%。由表3可知，3 d連續(xù)檢測3個指標的批間差異CV＜15%。以上研究表明，優(yōu)化后實驗方法的精密度符合規(guī)定的合格標準。

表2 批內(nèi)差異結(jié)果Table 2 The results of intra-batch difference %

表3 批間差異結(jié)果Table 3 The results of inter-batch difference %

2.5 樣本穩(wěn)定性結(jié)果分析

經(jīng)t檢驗差異分析表明，CD3+細胞/淋巴細胞、CD3+CD4+細胞/淋巴細胞和CD3+CD8+細胞/淋巴細胞3個指標在不同的放置條件下的差異性相似，即無論是4℃放置24 h還是室溫放置24 h后血樣染色處理的檢測結(jié)果與采樣后立即檢測的結(jié)果差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；染色處理后樣本于4℃放置24 h復檢結(jié)果與立即檢測結(jié)果差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖3。以上結(jié)果表明采集后的血樣在染色處理后立即上機檢測和染色處理后于4℃放置24 h內(nèi)檢測，3個指標的變化不明顯，即如果血樣不能立即檢測，應染色處理后放于4℃，24 h內(nèi)進行檢測，結(jié)果可靠。

圖3 血樣在不同放置條件下檢測CD3+細胞/淋巴細胞、CD3+CD4+細胞/淋巴細胞和CD3+CD8+細胞/淋巴細胞的結(jié)果Fig.3 The results of CD3+/lymphocytes,CD3+CD4+/lymphocytes and CD3+CD8+/lymphocytesof blood samples tested under different placement conditions

3 討論

研究表明，微量全血可以解決臨床上特殊病患抽血困難、血標本不足等難題［12］。本研究中樣品體積優(yōu)化后為50 μL，與相關報道中血樣體積一致，對臨床檢測方法有借鑒意義，且在臨床前檢測中也更符合實驗動物倫理福利中的減少原則。近兩年抗腫瘤抗體藥物研究較多，其中藥效評價中需要構(gòu)建免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型［13］，用流式檢測外周血T淋巴細胞占比時，50 μL血液可以降低對操作人員的要求和對重度免疫缺陷小鼠的應激反應。

流式抗體滴定可以很好地消除非特異性抗體結(jié)合［14］，一方面能夠提高實驗結(jié)果的精確性，另一方面可以節(jié)約實驗成本，但由公司出售或由學術(shù)團體描述的近50%抗體不能直接使用推薦用量［15］；而且，抗體存在批次間差異，即使是貨號相同，批號不同的抗體，也會有8.8%的抗體CV值超過20%［16］。對于小鼠髓系細胞表面分子CD11b，說明書推薦的抗體濃度與滴定的最佳抗體濃度并不一致［3］。本研究通過用3個不同濃度熒光抗體滴定50 μL抗凝血，選擇信噪比較大的濃度作為滴定的最佳工作濃度，結(jié)果表明，APC rat anti-mouse CD4抗體最優(yōu)工作濃度與說明書推薦的一致，為1.25 μg·mL-1；FITC rat anti-mouse CD3抗體最優(yōu)工作濃度是1.25 μg·mL-1，而說明書推薦濃度是2.50 μg·mL-1；PE rat anti-mouse CD8a抗體的最優(yōu)工作濃 度為5 μg·mL-1，而 說明書推薦 濃度是2.5 μg·mL-1［17］。提示流式檢測的相關實驗人員，在使用抗體前需要根據(jù)具體的實驗目的和樣本對抗體進行滴定，以區(qū)分抗原陰性細胞和抗原陽性細胞，從而提高檢測結(jié)果的準確性。

流式檢測全血樣品去除紅細胞的方式一般分為紅細胞裂解法和密度梯度離心分離法，而密度梯度離心法需要血量較大且會造成潛在的細胞丟失［12］。本研究中使用紅細胞裂解液，從裂解時間（5、8、10 min）和裂解次數(shù)（1次和2次）上進行了對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，裂解2次的樣品淋巴細胞門前面的雜質(zhì)碎片信號比較少，白細胞亞群能夠維持基本形態(tài)，效果稍優(yōu)于1次裂紅效果，裂解2次、每次5 min和裂解2次、每次8 min效果相當，因此選擇裂解2次、每次5 min作為本研究的裂紅條件。市面上有多種紅細胞裂解液，研究人員需要摸索適合實驗需求的裂解條件，充分裂解紅細胞可以準確提高淋巴細胞的比例。

方法學驗證對于檢測結(jié)果的準確性和可重復性至關重要，目前流式細胞術(shù)的方法學驗證多應用于臨床檢測［18］。本研究的批內(nèi)精密度即通常采用的重復性，由變異系數(shù)量化，國際血液標準化委員會對臨床樣本分析內(nèi)重復性的共識建議為CV＜10%［19］。本研究雖然是臨床前樣本，但研究中3個指標（CD3+細胞/淋巴細胞、CD3+CD4+細胞/淋巴細胞、CD3+CD8+細胞/淋巴細胞）的批內(nèi)CV值分別為3.12%、3.86%和4.33%，均小于10%，表明優(yōu)化后方法的重復性良好，為制定該類實驗方法的標準操作手冊提供了可能。

2011年發(fā)布的《流式細胞術(shù)檢測外周血淋巴細胞亞群指南》［20］指出，臨床血液樣品采集后應立即檢測，不能立即檢測的標本應保存于室溫（18～25℃）環(huán)境中；有文獻［21］報道，在4℃條件下血細胞參數(shù)的穩(wěn)定性優(yōu)于室溫；也有報道表明，臨床抗凝全血無論放置在4℃還是在室溫下，48 h內(nèi)的檢測結(jié)果都是可靠的［22］。為應對無法及時上機檢測的突發(fā)情況，很多科研人員和臨床檢測從業(yè)者選擇用多聚甲醛固定樣品，在確定樣品穩(wěn)定性的一段時間內(nèi)上機檢測［5，23］。但由于甲醛交聯(lián)蛋白的增加，使蛋白苯環(huán)結(jié)構(gòu)上的抗原決定簇發(fā)生改變，可能降低抗原的敏感性［24］。本研究中未使用多聚甲醛進行固定，樣本穩(wěn)定性結(jié)果表明，血樣在采集染色處理后立即檢測或者染色處理后于4℃放置24 h內(nèi)檢測穩(wěn)定性變化不明顯，差異不顯著，表明應用本研究所優(yōu)化的方法，即使血樣處理后不能立即上機，也不需要用多聚甲醛固定，置于4℃可以保持24 h內(nèi)檢測結(jié)果可靠，且簡化了試驗步驟，節(jié)約了試驗時間。

綜上所述，本研究對流式檢測外周血T淋巴細胞亞群的方法進行了系統(tǒng)性優(yōu)化并對優(yōu)化的方法進行了初步驗證，方法的重復性良好，不用固定樣本穩(wěn)定性也可以保持24 h，且研究中的優(yōu)化指標均是影響流式檢測外周血樣本準確性的重要因素，不僅可以為多參數(shù)流式更準確深入地研究血液細胞的功能提供思路，也可以為流式細胞術(shù)分析臨床血液淋巴細胞免疫表型的方法學研究提供參考依據(jù)。